Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов и их роли в противовирусном иммунном ответе (обзор литературы) 18
1.1. Эффекторные субпопуляции Т-лимфоцитов: биологические функции, индукция дифференцировки, пластичность и трансформации 18
1.2. Субпопуляции Т-лимфоцитов памяти, изменение численности Т-эффекторов/клеток памяти в зависимости от возраста и пола 28
1.3. Участие CD4+ и CD8+Т-эффекторов в противовирусном иммунном ответе 33
1.4. Роль Т-лимфоцитарных субпопуляций и других компонентов адаптивного и врожденного иммунитета при инфицировании: 40
- неполиомиелитными энтеровирусами 40
- флавивирусами 49
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Дизайн исследования 56
2.2. Объект исследования 57
2.3. Методы исследования 62
Глава 3. Возрастные и ассоциированные с полом особенности содержания т-эффекторов 72
3.1. Содержание Th1, Th2, Th17, Tc1, Tc2, Tnc17, Treg
лимфоцитов у практически здоровых детей и взрослых 72
3.2. Взаимосвязь между содержанием Т-эффекторов, клеток памяти и другими показателями врожденного и адаптивного иммунитета 76
3.3. Ассоциированные с полом различия в содержании Т 3 эффекторных субпопуляций и других показателей врожденного иадаптивного иммунитета 88
3.4.Абсолютная интегрированная средняя интенсивность флюоресценции как комплексный показатель, характеризующий цитокиновую экспрессию Т-эффекторов 91
3.5. Обсуждение результатов 94
Глава 4. Клинико-иммунологические особенности энтеровирусной инфекции с серозным менингитом в разных возрастных группах 102
4.1. Клиническая характеристика энтеровирусной инфекции с
серозным менингитом в возрастных группах: 1-3 лет, 4-7 лет, 15 18 лет, 19-45 лет 102
4.2. Иммунологические особенности энтеровирусной инфекции с
серозным менингитом в возрастных группах: 1-3 лет, 4-7 лет, 15 18 лет, 19-45 лет 104
4.3. Значение абсолютной интегрированной средней интенсивности флюоресценции цитокинов у детей с энтеровирусными менингитами 149
4.4. Ассоциированные с полом особенности иммунного ответа
при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом 151
4.5.Связь HLA-полиморфизма с чувствительностью к
энтеровирусным менингитам 158
4.6. Обсуждение результатов 175
Глава 5. Характеристика эффекторных субпопуляций т лимфоцитов при coxsackie b- и echo менингитах у детей 196
5.1. Изменение содержания основных субпопуляций Т эффекторов при Coxsackie B5-менингитах у детей 196
5.2. Сравнительная характеристика эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов при Coxsackie В1-В5-менингитах 201
5.3. Сравнительная характеристика эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов при ECHO-менингитах, вызванных вирусами 204 ECHO11 и ECHO30 .
5.4. Эффекторные субпопуляции Т-лимфоцитов и особенности клинического течения ECHO- и Coxsackie В-менингитов 207
5.5. Обсуждение результатов 213
Глава 6. Характеристика отдельных компонентов врожденного и адаптивного иммунитета в цереброспинальной жидкости при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом 219
6.1. Изменение клеточного состава и характеристика Т лимфоцитарных субпопуляций в цереброспинальной жидкости 219
6.2. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов в цереброспинальной жидкости 226
6.3. Обсуждение результатов 227
Глава 7. Клинико-иммунологические особенности менингеальной формы клещевого энцефалита 231
7.1. Сравнительная клинико-иммунологическая характеристика менингеальной формы клещевого энцефалита и энтеровирусной инфекции с серозным менингитом 231
7.2. Сравнительная характеристика иммунологических показателей цереброспинальной жидкости при менингеальной форме клещевого энцефалита и энтеровирусной инфекции с серозным менингитом 240
7.3. Обсуждение результатов 243
Заключение 247
Выводы 260
Практические рекомендации 263
Список литературы
- Субпопуляции Т-лимфоцитов памяти, изменение численности Т-эффекторов/клеток памяти в зависимости от возраста и пола
- Взаимосвязь между содержанием Т-эффекторов, клеток памяти и другими показателями врожденного и адаптивного иммунитета
- Значение абсолютной интегрированной средней интенсивности флюоресценции цитокинов у детей с энтеровирусными менингитами
- Сравнительная характеристика эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов при Coxsackie В1-В5-менингитах
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Острый асептический менингит представляет собой одну из самых распространенных
клинических форм нейроинфекций вирусной этиологии. Как у взрослых, так и у детей он
этиологически связан с вирусами различных таксономических групп (Сорокина М.Н.,
Скрипченко Н.В. Вирусные энцефалиты и менингиты у детей: Руководство для врачей. М.:
«Медицина», 2004. 416 с.), однако, 80-92% всех регистрируемых случаев асептических
менингитов вызывается неполиомиелитными энтеровирусами (НПЭВ) (Rotbart H.A.
Clin. Infect. Dis. 1995. 20(4). P.971-81). В
России после введения эпидемиологического надзора за энтеровирусными инфекциями
(ЭВИ) ежегодно регистрируют от 4000 до 10000 случаев заболевания, доля серозных
менингитов (СМ) в их структуре составляет около 60% (данные Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
). О возрастающем эпидемическом значении НПЭВ-инфекций на фоне действующей программы по ликвидации полиомиелита свидетельствуют постоянно регистрируемые в разных странах мира подъемы заболеваемости и вспышки. Не менее актуальным возбудителем менингитов на эндемичных территориях является вирус клещевого энцефалита (КЭ), несмотря на успехи вакцинации постоянно расширяющий свой географический ареал (Drrbecker B., Dobler G., Spiegel M. et al. Tick-borne encephalitis virus and the immune response of the mammalian host. Travel Medicine and Infectious Disease. 2010. Vol.8. P. 213-222). В структуре клинических форм КЭ, заболеваемость которым в Свердловской области в последние годы сохраняется на уровне 2,7 на 100 тысяч населения и стабильно превышает средний по Российской Федерации показатель, менингеальная форма (МФ) составляет 27,5 % (Волкова Л.И. Клещевой энцефалит на Среднем Урале: клинико-эпидемиологический анализ острых и хронических форм, пути оптимизации оказания специализированной медицинской помощи в эндемичном очаге: автореф. дис… доктора мед. наук. Екатеринбург, 2009. 45 с.). Несмотря на относительно доброкачественное течение и благоприятный прогноз, к исходам СМ относят различные резидуальные нарушения в виде цереброастении, неврозоподобных состояний, гипертензионного синдрома, очаговой симптоматики, синдрома гипоталамической дисфункции и т.д. При этом клиническая манифестация заболевания, его течение и исход зависят не только от антигенных свойств вируса, но и определяются особенностями иммунологической реактивности хозяина, в свою очередь зависящими от его возраста, пола, HLA-полиморфизма и т.д. Механизмы адаптивного иммунитета с участием различных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов играют решающую роль в противовирусном иммунном ответе и иммунопатологических реакциях, вносящих вклад в патогенез менингитов вирусной этиологии. Участие Т-лимфоцитов (вирус-специфическая цитотоксичность) в контроле НПЭВ было продемонстрировано in vitro более 30 назад (Wong C.Y., Woodruff J.J., Woodruff J.F. Generation of cytotoxic T lymphocytes during coxsackievirus B-3 infection. Model and viral specificity. J. Immunol. 1977. Vol.118. P.1159– 1164). С тех пор роль CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитарных субпопуляций при ЭВИ в основном изучалась на экспериментальных животных моделях (Kemball C.C., Harkins S., Whitton J.L. et al. Enumeration and functional evaluation of virus-specific CD4+and CD8+ T cells in lymphoid and peripheral sites of coxsackievirus B3 infection. J. Virol. 2008. Vol.82. P.4331–4342; Weinzierl A.O., Szalay G., Wolburg H. et al. Effective chemokine secretion by dendritic cells and expansion of cross-presenting CD4-/CD8+ dendritic cells define a protective phenotype in the mouse model of coxsackievirus myocarditis. J. Virol. 2008. Vol.82. P.8149–8160; Kemball C.C.,
Harkins S., Whitmire J.K. et al. Coxsackievirus B3 inhibits antigen presentation in vivo, exerting
a profound and selective effect on the MHC class I pathway. PLoS Path. 2009. Vol.5. P.
E1000618 и др.). Широкий спектр публикаций посвящен изучению роли Т-лимфоцитов в
патогенезе аутоиммунных заболеваний, ассоциированных с ЭВИ (Oikarinen M., Tauriainen
S., Oikarinen S. et al. Diabetes. 2012. Vol. 61(3). P.687-691; Hober D., Alidjinou E.K. Curr. Opin. Infect. Dis. 2013. Vol.26(3). P.263-269; , G. Enteroviral infections and development of type 1 diabetes: The Brothers
Karamazov within the CVBs. 2014. Vol.63(2). P.384-386 и др.). Последние
исследования свидетельствуют о том, что именно баланс основных Т-лимфоцитарных
субпопуляций определяет развитие острых миокардитов, их прогрессию в хронические
миокардиты и дилатационную кардиомиопатию на фоне ЭВИ , K.A., Update on coxsackievirus B3 myocarditis. 2012.
Vol.24 (4). P.401-407). Изучению участия Т-лимфоцитарных субпопуляций в противовирусном иммунном ответе при ЭВИ с СМ у человека посвящены отдельные исследования, не раскрывающие значения основных эффекторных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов в патогенезе энтеровирусных менингитов (Бацкалевич Н.А. Клинические, иммунологические особенности и прогностическая оценка показателей врожденного и адаптивного иммунитета у подростков с энтеровирусным менингитом: дис…. канд. мед.наук. Екатеринбург. 2009. 109 с.; Хаманова Ю.Б. Клиника, иммунопатогенез и оптимизация лечения энтеровирусных менингитов у детей: дис… доктора мед. наук. Екатеринбург. 2013. 279 с.).
Взаимодействие вируса КЭ с компонентами врожденного и адаптивного иммунитета хозяина при различных клинических формах КЭ также является объектом интенсивного исследования (Kaiser R., Holzmann H. Laboratory findings in tick-borne encephalitis correlation with clinical outcome. Infection. 2000. Vol.28 (2). P.78-84; Atrasheuskaya A.V., Fredeking T.M., Ignatyev G.M. Changes in immune parameters and their correction in human cases of tickborne encephalitis. Clin. Exp. Immunol. 2003. Vol.131(1). P.148-54; Drrbecker B., Dobler G., Spiegel M. et al. Tick-borne encephalitis virus and the immune response of the mammalian host. Travel Medicine and Infectious Disease. 2010. Vol.8. P. 213-222; Yea J., Zhu B., Fu Z.F. et al. Immune evasion strategies of flaviviruses. Vaccine. 2013. Vol.31. P. 461–471 и др.). Однако, роль в противовирусном ответе, в том числе в пределах центральной нервной системы (ЦНС), при МФ КЭ различных эффекторных субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов практически не изучена, за исключением экстраполяции данных об уровне синтезируемых ими цитокинов на возможную поляризацию иммунного ответа по Th1- или Th2-пути (Удинцева И.Н. Клинико-иммунологические проявления лихорадочной и стертой форм клещевого энцефалита в различные периоды заболевания: автореф. дис… канд.мед.наук. Томск, 2010. 24 с.; Контякова Е.Л. Прогностические критерии течения и исхода тяжелых форм клещевого энцефалита: дис…. канд. мед. наук. Киров, 2011. 163 с. и др.).
Между тем, по мнению ряда исследователей, вирусные инфекции сопровождаются сложным комплексом разнообразных реакций, регулируемых Т-лимфоцитами различных линий дифференцировки, содержание которых меняется в соответствии с локальным изменением цитокинового фона, количества антигена, состояния антиген-презентирующих клеток (APC) и т.д. (Roman E., Miller E., Harmsen A. et al. CD4 effector T cell subsets in the response to influenza: heterogeneity, migration, and function. J. Exp. Med. 2002. Vol. 196 (7). P.957-68). Согласно современным взглядам на функциональную специализацию Т-эффекторов статус самостоятельной субпопуляции помимо Th1 и Th2 лимфоцитов имеют
Th17 клетки и регуляторные Т-лимфоциты (Treg). Описаны новые субпопуляции Т-
хелперов (Th9, Th22, фолликулярные T-хелперы - TFH и т.д.), а также факты,
подтверждающие необычайную пластичность CD4+ Т-эффекторов ,
B. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances. 2010. 11(8). P.674-80; , M., T. Th9 cells, new players in
adaptive immunity. 2014. Vol.35(2). P.61-8; Raphael I., Nalawade S., Eagar
T.N., Forsthuber T.G. Cytokine. 2014. pii: S1043-4666(14)00539-0. doi:
10.1016/j.cyto.2014.09.011 и др.). Аналоги Т-хелперных субпопуляций обнаружены среди цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов (Тс1, Тс2, Tnc17 и т.д.) (Sad S., Marcotte R., Mossmann T.R. Cytokine-induced differentiation of precursor mouse CD8+ T cells into cytotoxic CD8+ cells secreting TH1 or TH2 cytokines. Immunity. 1995. Vol.2. P.271; Liu S.J., Tsai J.P., Shen C.R. et al. Induction of a distinct CD8 Tnc17 subset by transforming growth factor- and interleukin-6. J. Leukoc. Biol. 2007. Vol.82. P.354-360). Динамика изменения содержания различных, в том числе вновь открытых, субпопуляций Т-эффекторов в ходе вирусных нейроинфекций остается малоизученной и представляет несомненный интерес, поскольку определяет эффективность механизмов адаптивного противовирусного иммунитета.
Зависимость клинической манифестации при инфицировании НПЭВ от возраста, пола и генетически детерминированной чувствительности/резистентности хозяина (Jimenez Cabalero P.E., Munoz Escudero F., Murcia Carretero S. et al. Descriptive analysis of viral meningitis in a general hospital: differences in the characteristics between children and adults. Neurologia. 2011. Vol. 26(8). P. 468-473; Мишакина Н.О. Клинико-патогенетические особенности острого и отдаленного периодов при серозном менингите энтеровирусной этиологии у детей: дис…. канд. мед.наук. Тюмень, 2012. 150 с.; Hiar R.E.L., Haddad S., Jaidne H. et al. Enteroviral central nervous system infections in children of region of Monastir, Tunisia: diagnosis, laboratory findings of cerebrospinal fluid and clinical manifestations. Indian J. Virol. 2012. Vol. 23(3). P. 294-302 и др.) позволяет предположить, что возрастные, ассоциированные с полом и генетически обусловленные особенности дифференцировки различных субпопуляций Т-эффекторов могут играть определенную роль в иммунопатогенезе ЭВИ с СМ. В то же время исследованиям, направленным на изучение цитокиновой экспрессии Т-лимфоцитов в зависимости от возраста у детей и взрослых, посвящены единичные публикации (Hoffmann F., Albert M.H., Arenz S. et al. Intracellular T-cell cytokine levels are age-dependent in healthy children and adults. Eur. Cytokine Netw. 2005. Vol.16. P.283-288; Wiegering V., Eyrich M., Wunder C. et al. Age-related changes in intracellular cytokine expression in healthy children. Eur. Cytokine Netw. 2009. Vol.20. P.75-80). Количественные характеристики содержания тех или иных цитокин-положительных субпопуляций в различных возрастных группах отличаются в зависимости от используемых модификаций метода (выбор индукторов экспрессии, времени индукции и т.д.), а также границ возрастной группы. Не сформулированы до настоящего момента и ассоциированные с полом особенности дифференцировки различных субпопуляций Т-эффекторов. Наконец, несмотря на разнообразие подходов к оценке HLA-ассоциаций при ЭВИ S., J., Role of class I human leukocyte antigen molecules in early steps of echovirus infection of rhabdomyosarcoma cells. 2008. Vol.25; 381(2). P.203-214; L.Y., I.S., W.J. et al. HLA-A33 Is Associated With Susceptibility to Enterovirus 71 Infection. Pediatrics. 2008. Vol.122(6). P. 1271-1276; J., J., Effect of HLA genotype or CTLA-4 polymorphism on cytokine response in healthy children. 2008. Vol. 68(3). P.345-50; o E., O., HLA-DRB1-DQA1-DQB1 genotype and frequency of enterovirus in
longitudinal monthly fecal samples from healthy infants. 2012. Vol. 25(3). P.187-192 и др.), связь полиморфизма HLA с развитием ЭВИ с СМ и иммунопатогенетические механизмы, лежащие в ее основе, также остаются не изученными.
Особое значение имеют исследования локального иммунного ответа,
формирующегося в пределах ЦНС и характеризующегося целым рядом особенностей,
обусловленных: селективной миграцией специфических субпопуляций эффекторных Т-
лимфоцитов из периферического кровотока в ткани мозга; селективным удерживанием Т-
клеточных субпопуляций, преодолевших гематоэнцефалический барьер (ГЭБ);
локальными воздействиями на эффекторные функции Т-лимфоцитов в условиях нового
микроокружения. Современные представления о том, каким образом осуществляется
регуляция, в том числе локальная, иммунного ответа с участием различных Т-
лимфоцитарных субпопуляций при вирусных поражениях ЦНС, весьма ограничены (Lepej
S.Z., Tesovic G., Sternak S.L. et al. Nave and memory CD4+ N-cells in the cerebrospinal fluid
of children with aseptic meningitis following measles-mumps-rubella vaccination and enteroviral
meningitis. Immun.Inv. 2007. V.36. P.321-335; Singh S.K., Ruzek D. Neuroviral infections.
RNA viruses аnd retroviruses:Taylor &Francis Group, 2013. 499 p.; Хаманова Ю.Б. Клиника,
иммунопатогенез и оптимизация лечения энтеровирусных менингитов у детей: дис…
доктора мед.наук. Екатеринбург. 2013. 279 с.). Таким образом, исследование Т-клеточного
ответа при естественном инфицировании человека самыми актуальными возбудителями
нейроинфекций имеет фундаментальное значение для понимания роли различных
эффекторных Т-клеточных субпопуляций в противовирусном иммунном ответе и
механизмах иммунопатогенеза при вирусных поражениях ЦНС.
Цель исследования
Оценить роль различных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов в
иммунопатогенезе менингитов вирусной этиологии с учетом возрастных,
ассоциированных с полом и полиморфизмом HLA особенностей их дифференцировки.
Задачи исследования
-
Оценить базовый уровень эффекторных Т-лимфоцитарных субпопуляций (Th1, Th2, Tc1, Tc2, Th17, Tnc17, Treg) у практически здоровых детей и взрослых. Исследовать возрастные и ассоциированные с полом особенности содержания основных субпопопуляций эффекторных Т-лимфоцитов, их взаимосвязь с другими показателями адаптивного и врожденного иммунитета.
-
Определить содержание эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов в динамике острого периода энтеровирусной инфекции с серозным менингитом. Охарактеризовать особенности иммунного ответа на неполиомиелитные энтеровирусы в зависимости от возраста, пола пациентов и серотипа возбудителя.
-
Провести анализ иммуногенетических ассоциаций аллельных вариантов HLA I (HLA-A, -B, -Cw) и II класса (HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1) с развитием энтеровирусной инфекции с серозным менингитом.
-
Оценить параметры врожденного и адаптивного иммунитета в цереброспинальной жидкости при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом.
-
Сформулировать универсальные и зависящие от типа возбудителя особенности адаптивного иммунитета с участием основных субпопуляций Т-эффекторов при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом и менингеальной форме клещевого энцефалита.
Методология и методы исследования
Исследования проведены на базе лаборатории иммунопатофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук (ИИФ УрО РАН) с 2003 по 2014 гг. Для выполнения задач, поставленных в работе, обследовано 195 практически здоровых детей и взрослых в шести возрастных группах: 7-12 мес: 30 человек; 1-3 года: 30 человек; 4-7 лет: 30 человек; 8-14 лет: 30 человек; 15-18 лет: 30 человек; 19-45 лет: 45 человек. В каждой возрастной группе анализ данных лабораторного обследования проведен, в том числе, в зависимости от пола обследуемых.
Проведен ретроспективный анализ результатов вирусологического и молекулярно-биологического обследования 1720 случаев заболевания ЭВИ с СМ, а также клинического и иммунологического обследования 435 пациентов с менингитами вирусной этиологии. В ходе ретроспективного исследования в зависимости от результатов идентификации возбудителя менингитов сформированы следующие основные группы:
1-я основная группа – 400 пациентов с ЭВИ с СМ, в рамках которой были выделены следующие возрастные подгруппы: 1-3 года (58 человек); 4-7 лет (107 человек); 8-14 лет (180 человек); 15-18 лет (30 человек); 19-15 лет (25 человек). Для исследования ассоциированных с полом особенностей иммунного ответа в группах 1-18 лет выделены соответствующие подгруппы. Для изучения серотип-специфических закономерностей в возрастных группах 4-7 и 8-14 лет выделены подгруппы с ЭВИ с СМ, вызванными Coxsackie B1-B5 (76 человек) и ECHO11, 30 (110 человек).
2-я основная группа – 35 пациентов с МФ КЭ в возрасте 19-45 лет.
На первом этапе работы проведено обследование и анализ результатов иммунологических, гормональных и генетических исследований у практически здоровых детей и взрослых. Основной задачей второго этапа исследований явилось изучение возрастной, половой структуры пациентов с ЭВИ с СМ, сезонного распределения случаев заболевания, пейзажа выделенных серотипов НПЭВ. На третьем этапе проведен анализ клинико-анамнестических данных и оценка результатов иммунологических исследований периферической крови и цереброспинальной жидкости пациентов с ЭВИ с СМ, проведенных в 1-10 и 11-20 сутки от начала заболевания, в зависимости от возраста, пола пациентов, серотипа возбудителя и результатов типирования HLA. Кроме того, проведен сравнительный анализ данных клинико-иммунологического обследования пациентов возрастной группы 19-45 лет с ЭВИ с СМ и МФ КЭ.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Высокая степень достоверности результатов исследования, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений, продуманном методическом и методологическом подходе к выполнению исследования с формулировкой и проверкой рабочей гипотезы, использовании комплекса современных лабораторных методов исследования, статистической обработке полученных данных адекватными методами статистического анализа с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США).
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 2 международных и 11 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); Объединенном иммунологическом форуме. III съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004); Областной конференции «Актуальные проблемы лечения, диагностики и профилактики КЭ на территории Свердловской области» (Екатеринбург, 2005); IV съезде физиологов Урала с международным участием (Екатеринбург, 2009); II Национальной конференции с международным участием
«Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых инфекций» (Екатеринбург, 2010);
Региональной конференции «Вирусные инфекции у детей. Достижения, проблемы,
перспективы (диагностика, лечение, профилактика)» (Екатеринбург, 2010); 14th
International Congress of Immunology (Kobe, Japan, 2010); cеминаре «Современные
технологии и новые тесты в лабораторной диагностике» (Москва, 2011); VII
Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.
Челябинске», Международной школе «Проточная цитометрия в клинической
лабораторной диагностике» (Челябинск, 2012); 15th International Congress of Immunology (Milan, Italy, 2013); IХ Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г. Челябинске», Международной школе «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Челябинск, 2014); Российском научном форуме на Урале с международным участием «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (Екатеринбург, 2014), Х Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г. Челябинске», Международной школе «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» (Челябинск, 2015).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии во всех этапах
диссертационного исследования. Планирование научной работы, включая формулировку
рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного
исследования проводились совместно с научными консультантами: директором ИИФ УрО
РАН, академиком РАН, д.м.н., профессором В.А.Черешневым и главным врачом МАУ
«Клинико-диагностический Центр» (МАУ КДЦ), д.м.н., профессором, Заслуженным
врачом РФ Я.Б.Бейкиным. Анализ литературы по теме исследования, определение
иммунологических показателей периферической крови и цереброспинальной жидкости, статистическая обработка и интерпретация результатов исследования, написание и оформление рукописи диссертации осуществлялись соискателем лично. Оценка и интерпретация данных вирусологических, серологических и молекулярно-биологических методов исследования проводилась при участии к.б.н. Сбитневой Н.Н. и Оленьковой О.М., заведующих лабораториями молекулярно-биологических методов исследования и вирусологии МАУ КДЦ. Оценка уровня гормонов – при участии к.б.н. Беляевой С.В., заведующей биохимической лабораторией МАУ КДЦ, результатов генетических исследований – совместно с к.б.н. Рыбиной И.В., заведующей лабораторией клинической генетики МАУ КДЦ. Анализ и интерпретация клинико-анамнестических данных осуществлялись при участии заместителя главного врача по научной работе д.м.н., профессора Фомина В.В. Подготовка публикаций по теме диссертации осуществлялась автором совместно с научными консультантами.
Положения, выносимые на защиту
-
Изменение базового уровня основных субпопуляций Т-эффекторов в онтогенезе подчинено возрастным закономерностям. Содержание эффекторных субпопуляций Т-хелперов в возрастных группах 15-45 лет характеризуется ассоциированным с полом иммунологическим диморфизмом.
-
Характер адаптивного иммунного ответа при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом зависит от возраста и пола пациентов.
-
Увеличение содержания эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов Th1(Tc1) и Th2(Tc2) типа в периферической крови в остром периоде энтеровирусной инфекции с серозным менингитом коррелирует с клиническим течением заболевания и выраженностью воспалительной реакции в центральной нервной системе.
-
Энтеровирусную инфекцию центральной нервной системы контролируют CD4+T-эффекторы/клетки-памяти Th1- и Th2-типа, а также CD8+ Т-эффекторы Тс1-типа и терминально-дифференцированные CD8+ T-эффекторы памяти.
-
Энтеровирусная инфекция с серозным менингитом является HLA-ассоциированным заболеванием с высоким риском развития у носителей гаплотипа HLA-DRB1*01;DQA1*01:01;DQB1*05:01.
-
Энтеровирусные инфекции с серозным менингитом и менингеальная форма клещевого энцефалита характеризуются как общими закономерностями формирования Т-клеточного адаптивного иммунного ответа, так и характерными особенностями динамики и уровня дифференцировки основных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов, а также состава мигрирующих в цереброспинальную жидкость Т-эффекторов.
Научная новизна
Впервые проведена оценка содержания эффекторных CD4+, CD8+ Т-лимфоцитарных субпопуляций, экспрессирующих цитокины Th1, Th2, Th17-типов, у практически здоровых детей в возрастных группах: 7-12 месяцев, 1-3 года, 4-7 лет, 8-14 лет, 15-18 лет и взрослых (19-45 лет). На 7-12 месяце жизни у детей выявлена преимущественная поляризация дифференцировки Т-лимфоцитов по пути Th2 (Tc2) и Th17 (Tnc17) и максимальное содержание Treg клеток. Продемонстрировано, что для детей младших возрастных групп (до 7 лет) характерна сниженная эффективность экспрессии цитокинов Th1(Тс1)-типа. Определена зависимость содержания основных субпопуляций Т-эффекторов от уровня в периферической крови половых стероидов, взаимосвязь с другими показателями, характеризующими состояние врожденного и адаптивного иммунитета.
Впервые определены возрастные, ассоциированные с полом и HLA полиморфизмом особенности дифференцировки основных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов в остром периоде ЭВИ с СМ. Установлено, что увеличение содержания Th1 и Tc1 эффекторов характерно только для детей до 7 лет, в то время как повышение уровня эффекторов второго типа (Th2, Tc2) характеризует Т-клеточный ответ во всех возрастных группах от 1 до 45 лет и ассоциировано с формированием противовирусного гуморального иммунного ответа. Проведена оценка уровня Т-эффекторов в зависимости от серотипа НПЭВ. Установлена взаимосвязь между содержанием отдельных субпопуляций Т-эффекторов и их соотношением с клиническим течением заболевания и выраженностью воспалительных изменений в ЦНС.
Впервые проведен анализ иммуногенетических ассоциаций аллельных вариантов
генов HLA I (HLA-A, B, Cw) и II класса (DRB1, DQA1, DQB1) с развитием ЭВИ с СМ.
Установлено, что аллели HLA-DRB1*07, HLA-А2 имеют отрицательную ассоциацию с
заболеванием ЭВИ СМ. Выявлен гаплотип-провокатор HLA-
DRB1*01;DQA1*01:01;DQB1*05:01 и описаны особенности противовирусного иммунного ответа у его носителей: снижение уровня дифференцировки Th2 субпопуляции лимфоцитов и синтеза противовирусных нейтрализующих антител.
Впервые описаны ассоциированные с полом особенности иммунного ответа при ЭВИ с СМ и механизмы формирования иммунологического диморфизма.
Впервые с помощью метода внутриклеточного окрашивания цитокинов и проточноцитометрического анализа ЦСЖ определены субпопуляции Т-эффекторов, участвующих в контроле энтеровирусной инфекции ЦНС: CD4+T-эффекторы/клетки-памяти Th1-и Th2-типа, а также CD8+ эффекторные Т-лимфоциты Тс1-типа и CD8+ TEMRA.
Впервые сформулированы общие и зависящие от типа возбудителя закономерности дифференцировки основных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов, а также состава
мигрирующих в ЦСЖ Т-эффекторов при энтеровирусных и флавивирусных менингитах. Разработана концепция иммунопатогенеза ЭВИ с СМ, расширяющая современные представления об участии в патогенезе СМ отдельных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы
В теоретическом плане полученные новые данные расширяют современные
представления об иммунологических аспектах патогенеза энтеровирусных и
флавивирусных менингитов (КЭ). Результаты исследования вносят вклад в изучение иммунологических детерминант чувствительности к нейроинфекциям с позиций возрастных, ассоциированных с полом и полиморфизмом HLA особенностей дифференцировки различных эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов.
Практическая значимость работы заключается в формировании базы нормативных показателей, характеризующих содержание CD4+ и CD8+Т-лимфоцитарных субпопуляций, синтезирующих цитокины Th1, Th2, Th17-типов, Treg-лимфоцитов, наивных Т-лимфоцитов и различных субпопуляций CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов памяти.
Для оценки содержания субпопуляций CD4+ и CD8+Т-лимфоцитов первого типа предложены уравнения, основанные на выявленной логарифмической зависимости данных показателей от возраста.
Определена группа риска (носители гаплотипа HLA-
DRB1*01;DQA1*01:01;DQB1*05:01), характеризующаяся высокой чувствительностью к развитию ЭВИ с СМ. Выявлены особенности адаптивного иммунного ответа на НПЭВ у носителей гаплотипа-провокатора и пациентов с НПЭВ-инфекцией в отсутствии в генотипе HLA-DRB1*01;DQA1*01:01;DQB1*05:01, свидетельствующие о необходимости дифференцированного подхода к иммунопатогенетической терапии ЭВИ с СМ.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанные региональные возрастные нормы содержания CD4+ и CD8+Т-
лимфоцитарных субпопуляций, синтезирующих цитокины Th1, Th2, Th17-типов, Treg-
лимфоцитов, наивных Т-лимфоцитов и различных субпопуляций CD4+ и CD8+Т-
лимфоцитов памяти используются в практике лаборатории клинической иммунологии
МАУ «Клинико-диагностический Центр», научного отделения иммунологии и
микробиологии ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны
материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница №1» г. Екатеринбурга и ООО Медицинский лабораторный центр «Фамилия» г.Челябинска.
Результаты диссертационной работы используются в научно-исследовательской и
практической работе инфекционных отделений МАУ «Городская клиническая больница
№40» г. Екатеринбурга, в преподавании клинической иммунологии на кафедре
инфекционных болезней и клинической иммунологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также лекциях ежегодной Международной школы «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике» в г. Челябинске (ООО "Академический инновационный научный центр").
Публикации по теме диссертации
Соискатель имеет более 100 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 36 работ общим объемом 7,6 печатных листов, в том числе 21 публикация в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов
диссертаций (17 статей и 4 тезиса), 2 работы в зарубежных научных изданиях, 3 публикации в материалах российских и международных конференций, 3 статьи в нерецензируемых научных журналах, 5 статей в сборниках научных трудов, получен 1 патент. В монографии «Патоморфоз острого клещевого энцефалита на Среднем Урале» (Екатеринбург, 2008 г.) Ю.Г. Лагерева является соавтором главы «Иммунология клещевого энцефалита».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 309 страницах машинописного текста, состоит из введения,
обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, 5 глав с
изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов,
иллюстрирована 95 таблицами и 50 рисунками. Библиография включает 482 источника.
Субпопуляции Т-лимфоцитов памяти, изменение численности Т-эффекторов/клеток памяти в зависимости от возраста и пола
После разрешения иммунного ответа большинство CD4+ эффекторных Т лимфоцитов погибает путем апоптоза, остается лишь небольшая популяция клеток памяти, которая, тем не менее, по численности превышает первоначальное количество антиген-специфических наивных лимфоцитов. По крайней мере, в некоторых ситуациях, сила эффекторного ответа коррелирует с размером результирующего пула клеток-памяти [295]. Примированные антигеном Т-клетки можно разделить на центральные Т-клетки-памяти (TCM), эффекторные Т-клетки-памяти (TEM) и эффекторные субпопуляции (TEFF), отличающиеся по основным миграционным и функциональным характеристикам, хотя реальная ситуация может быть гораздо сложнее [284]. Центральные клетки памяти сохраняют экспрессию хоминговых рецепторов: L-селектина и хемокинового рецептора (ССR7) и, подобно наивным клеткам, широко представлены во вторичных лимфоидных органах. TCM также локализуются в периферических тканях и очагах воспаления [218]. По сравнению с наивными Т-клетками TCM более чувствительны к антигенной стимуляции, менее зависимы от ко-стимуляции и экспрессируют на высоком уровне CD40L, что позволяет более эффективно воспринимать стимуляционные сигналы от дендритных клеток и В-лимфоцитов [386]. В ответ на TCR-активацию TCM продуцируют в основном IL-2. После пролиферации они эффективно дифференцируются в эффекторные клетки и продуцируют в больших количествах IFN- и IL-4. Однако, среди TCM лимфоцитов присутствует часть клеток, так называемые пре-коммитированные неэффекторные клетки, которые спонтанно могут дифференцироваться в IFN- и IL-4-продуцирующие клетки, даже в отсутствии поляризующих цитокинов. Эти клетки представляют собой преh1 и преh2 и могут быть идентифицированы на основании экспрессии CXCR3 и CCR4, соответственно [243].
В отличие от TCM TEM и TEFF являются CCR7-негативными и большинство из них также L-селектин-/low. TEM являются долгоживущими, в то время как эффекторные Т-лимфоциты в основном представлены короткоживущими активированными Т-клетками. И эффекторные Т-лимфоциты, и эффекторные Т-клетки памяти теряют способность мигрировать в периферические лимфатические узлы и представлены в основном в нелимфоидных тканях. Однако, они могут мигрировать в реактивные лимфатические узлы и модулировать иммунный ответ [171, 288]. CD62L-CCR7- эффекторные клетки памяти обладают большим количеством функций по сравнению с центральными клетками памяти: они поляризованы в отношении продукции цитокинов и продуцируют не только IL-2, но и эффекторные цитокины IFN-, IL-4, TNF- [82]. CD8 TEM содержат большое количество перфорина. Таким образом, пул TEM у человека включает в себя дифференцированные Th1, Th2 и CTL. Относительные пропорции TEM и TCM в периферической крови варьируют в популяции CD4+ и CD8+ лимфоцитов: TCM преобладают среди CD4+ лимфоцитов, в то время как в CD8+ субпопуляции доминируют TEM [386]. Зрелые Т-клетки с фенотипом CD45RA+CD62L-CCR7- получили название терминально-дифференцированных эффекторных клеток памяти (TEMRA). TEMRA субпопуляцию образуют зрелые цитотоксические CD8+Т-лимфоциты, содержащие перфорин и гранзим В, экспрессирующие FasL и продуцирующие IFN- и TNF-, подобно наивным Т-лимфоцитам они экпрессируют CD45RA и молекулы хоминга, сходные с эффекторными клетками памяти, т.е. лишены CD62L и CCR7, несут CD11a/CD18, CD11b, CD49d [44]. Зрелые цитокинпродуценты с аналогичным фенотипом CD45RA+CD62L-CCR7- обнаружены и среди CD4+ Т-лимфоцитов [318]. Изучению факторов и механизмов, влияющих на дифференцировку антиген-примированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в коротко-живущие эффекторы или клетки памяти, посвящено большое количество исследований [60, 395, 403 и др.].
Исследованиям, направленным на изучение динамики цитокиновой экспрессии в Т-лимфоцитах в зависимости от возраста у детей и взрослых, посвящены единичные публикации [90, 102, 151, 152, 189, 458]. Количественные характеристики содержания тех или иных цитокин-положительных субпопуляций в разных возрастных группах отличаются в зависимости от используемых модификаций метода внутриклеточного окрашивания цитокинов (выбор индукторов экспрессии, времени индукции и т.д.), а также границ возрастной группы. Большинство исследователей сходится во мнении, что у новорожденных детей Т-лимфоциты имеют преимущественно фенотип наивных клеток, уровень клеток памяти увеличивается с возрастом, и, поскольку, большинство цитокинов продуцируется клетками памяти, более высокая цитокиновая экспрессия характеризует детей старшего возраста [152, 392]. В исследованиях, проведенных Wiegering V. et al., показана позитивная, значимая корреляция содержания IFN- в хелперных и цитотоксических лимфоцитах в зависимости от возраста [458]. Повышение уровня Th1 лимфоцитов с возрастом описано в исследованиях Chipeta J. [102] и Hoffmann F. [189]. И у детей и у взрослых содержание Тс1 лимфоцитов выше, чем содержание Th1 клеток [90]. Данные, касающиеся изменения соотношения Th1 и Th2 лимфоцитов в разных возрастных группах, полученные разными авторами, зачастую противоречивы. Так, Wiegering V. et al. в связи с низким содержанием цитокинов Th2-типа (IL-4, IL-5, IL-10) не удалось отметить какой-либо тенденции к изменению содержания Th2 лимфоцитов по мере взросления ребенка [458]. Смещение в сторону увеличения Th2 клеток с возрастом отмечено в публикации Shearer G.M. [392]. Buck R.H. et al. приводят данные, свидетельствующие о том, что к 12 месяцам абсолютное и относительное содержание Th2 лимфоцитов у детей ближе к уровню этих клеток у взрослых, чем содержание Th1 лимфоцитов, что говорит о раннем созревании Th2 лимфоцитов по действием мукозальных антигенов [90]. На всех уровнях и этапах формирования и функционирования иммунной системы осуществляется гормональный контроль, чему способствует наличие стероидных рецепторов на иммунокомпетентных клетках [14]. И эстрогены, и андрогены снижают содержание незрелых Т-лимфоцитов [339, 421]. Иммуномодулирующее действие эстрогенов на экспрессию цитокинов Th1- и Th2-типов зависит от множества факторов, например, дозы гормона, времени экспозиции, а также плотности, распределения и типа рецепторов (ER) на иммунокомпетентных клетках. Низкие уровни эстрогенов коррелируют с повышением экспрессии транскрипционного фактора T-bet, который участвует в дифференцировке Th1 клеток [144]. Повышение продукции IFN- Th1 клетками под действием эстрадиола (E2) описано Bao M. et al. [69]. Maret A. et al. продемонстрировали, что E2 способствует дифференцировке Th1 клеток при участии ER [285]. Помимо проh1 эффекта E2 влияет и на дифференцировку Th2 клеток. Увеличение уровня IL-4 в лютеиновую фазу связано также с участием E2 [135]. E2 способствует увеличению секреции IL-4 CD4+ T клетками, также как и эскпрессии GATA-3 у мышей [239]. Стимуляция эстрогенами Th2 ответа и антителообразования показана в исследованиях Giron-Gonzalez et al. [160], Fish et al. [144], Gonzalez et al. [163]. Высокие уровни эстрогенов ингибируют IRF1 (интерферон регулирующий фактор 1), благоприятствуя Th2 иммунитету и экспрессии IL-4 [144]. Модулирующее действие эстрогенов на дифференцировку Treg клеток изучено в работах Polanczyk et al. Установлено, что E2 усиливает экспрессию Foxp3 in vivo и in vitro [355, 356]. Prieto G.A. et al. и Valor L. et al. также продемонстрировали, что E2 способствует пролиферации Treg [359, 431]. Повышение содержания регуляторных клеток наблюдали при повышении уровня эстрогенов в ходе менструального цикла [63]. Что касается Th17 клеток, в течение длительного времени господствовала точка зрения, что E2 ингибирует образование Th17 клеток [75] и продукцию IL-17 [438]. Однако, Khan et al. показали, что E2 усиливает экспрессию IL-17 и ROR в стимулированных спленоцитах мышей [228]. Несмотря на противоречивые результаты, очевидно, что E2 регулирует образование Th17, по-видимому, в зависимости от контекста. Таким образом, E2 может как способствовать дифференцировке Th1, Th2, Treg и Th17 клеток, так и оказывать ингибирующее действие на эти субпопуляции. Эстрогены также играют определенную роль в регуляции хоминга T-клеток, усиливая экспрессию хемокиновых рецепторов CCR1 и CCR5 на CD4+ клетках [310]. В основе молекулярных механизмов
Взаимосвязь между содержанием Т-эффекторов, клеток памяти и другими показателями врожденного и адаптивного иммунитета
На первом этапе работы исследованы образцы периферической крови 150 практически здоровых детей в возрасте от 7 месяцев до 18 лет (1 группа-7-12 мес., 2 группа – 1-3 года, 3 группа – 4-7 лет, 4 группа 8-14 лет, 5 группа-15-18 лет, численность каждой группы – 30 человек) и 6 группа - 45 взрослых (19-45 лет). Обследование женщин и подростков с установившимся менструальным циклом проводили в фолликулярную фазу на 5-7 день менструального цикла. Обследование практически здоровых лиц проведено в соответствии с распоряжением Управления здравоохранения Администрации г.Екатеринбурга №298/35 от 29.04.2011 г. с целью определения нормативных показателей гормонального, иммунного и цитокинового статуса. Для исключения детей с хроническими воспалительными заболеваниями из группы сравнения использован запатентованный метод [4]. Выполнен комплекс иммунологических методов исследования, оценка гормонального статуса и типирование генов гистосовместимости HLA II класса по локусу DRB1.
На втором этапе проведен ретроспективный анализ результатов вирусологического и молекулярно-биологического обследования 1720 (1675 детей и подростков до 18 лет и 45 взрослых) случаев заболевания ЭВИ с СМ за период с 2003 по 2014 гг. У 992 (57,7%) пациентов энтеровирусная природа менингита установлена на основании обнаружения РНК энтеровирусов в ЦСЖ методом ОТ ПЦР. В 728 (42,3%) случаях НПЭВ выделены и идентифицированы с помощью классических вирусологических методов (в 89,3% случаев в образцах ЦСЖ также была обнаружена РНК НПЭВ). Максимальное число случаев заболевания ЭВИ с СМ зарегистрировано за этот период в 2007 году.
Заболеваемость обусловлена различными серотипами НПЭВ. С 2003 по 2007 гг. преобладали серотипы группы Coxsackie B. Основными этиологическими агентами энтеровирусных менингитов в 2008-2009 годах были ECHO-вирусы (ECHO 30 и ECHO 7). В 2010 году доминировал Coxsackie B4 (рисунок 2.1). 40 30 20 10 CVB1
Для 2011-2014 гг. характерен разнообразный вирусный пейзаж. Значительное количество лиц было инфицировано ЕСНО-вирусами разных серотипов (ЕСНО 6, ЕСНО 7, ЕСНО 17, ЕСНО 18). Наряду с моноинфекцией в 2011-2014 гг. возрастает роль микст-инфицирования. Большинство микстов составили вирусы Коксаки В4 и ЕСНО-вирусы разных типов (рисунок 2.2). Распределение по возрасту. В подавляющем большинстве случаев НПЭВ изолированы у детей (рисунок 2.3). При этом дети в возрасте от 0 до 2 лет составили 7,3% от всех случаев заболевания, от 3 до 7 лет – 47,9%, 8-14 лет – 39,7%, 15-18 лет – 2,5% и 19-45 лет – 2,6%. Таким образом, 87,6% заболевших ЭВИ с СМ составляют дети в возрасте 3-14 лет. Максимальное количество случаев заболевания ЭВИ с СМ зарегистрировано у детей 5 лет.
Распределение по возрасту случаев заболевания энтеровирусной инфекцией с серозным менингитом в период 2003-2014 гг. Распределение по полу. В целом, ЭВИ с СМ чаще регистрировали у представителей мужского пола. Мальчики составили в среднем 61,3% (58,1-64,3%) от всех заболевших. Соотношение случаев заболевания, зафиксированных у представителей мужского и женского пола, в среднем составляющее 1,58 (1,39-1,80), варьировало от 1,2 в возрасте до 1 года до 2,6 у детей 14 лет. Тенденция к повышению соотношения в пользу лиц мужского пола наблюдалась с увеличением возраста пациентов (рисунок 2.4). возраст, количество лет месяцы
Соотношение пациентов мужского и женского пола с энтеровирусной инфекцией с серозным менингитом (а). Сезонное распределение случаев заболевания энтеровирусной инфекцией с серозным менингитом (б)
Сезонное распределение. Большинство случаев изоляции НПЭВ относилось к летне-осенним месяцам с отчетливым пиком в августе-сентябре (рисунок 2.4). На 5 месяцев с июня по октябрь приходилось 93,5% всех случаев заболевания ЭВИ с СМ.
На третьем этапе проведен анализ клинико-анамнестических данных и оценка результатов иммунологических исследований периферической крови и ЦСЖ 400 пациентов с менингитами энтеровирусной этиологии в зависимости от возраста, пола, серотипа возбудителя (Coxsackievirus B1-B5, ECHO11, 30) и результатов типирования HLA.
В основной группе проведение вирусологического исследования позволило выделить и идентифицировать возбудителя в среднем в 52,6% случаев. 32,2% из них составили различные серотипы Coxsackie B-вирусов; 20,4% - ECHO-вирусы. В остальных случаях (47,4%) диагноз ЭВИ установлен на основании положительных результатов выделения РНК энтеровирусов в ЦСЖ. Пейзаж изолированных НПЭВ представлен различными серотипами энтеровирусов, относящихся как к Coxsackie B, так и различным ECHO-вирусам (рисунок 2.5).
Образцы венозной крови получены в остром периоде ЭВИ с СМ (1-10 сутки от начала заболевания) и в динамике (11-20 сутки) заболевания. Все обследуемые пациенты находились на лечении в инфекционных отделениях МАУ ГКБ№40 (главный врач - Прудков А.И.). Первую группу составили 58 детей в возрасте от 1 года до 3 лет; вторую-107 детей в возрасте от 4 до 7 лет; третью - 180 детей в возрасте от 8 до 14 лет, четвертую - 30 подростков в возрасте от 15 до 18 лет и пятую - 25 взрослых пациента (19-45 лет). Соотношение пациентов мужского и женского пола в разных возрастных группах в среднем составило: 1,8:1. Для исследования ассоциированных с полом особенностей иммунного ответа в группах 1-18 лет выделены соответствующие подгруппы. Для изучения серотип-специфических закономерностей в возрастных группах 4-7 и 8-14 лет выделены подгруппы с ЭВИ с СМ, вызванной Coxsackie B1-B5 (76 человек) и ECHO11, 30 (110 человек).
Образцы ЦСЖ получены при люмбальной пункции в 1-10 день от начала заболевания и в динамике болезни (11-20 день). Клеточный состав ЦСЖ исследовали у всех обследуемых пациентов с помощью стандартных цитологических методов, включающих определение цитограммы и общего содержания лейкоцитов. Комплекс иммунологических методов проведен с использованием материала ЦСЖ у 12 детей 1-3 лет; 41 ребенка 4-7 лет; 46 детей 8-14 лет; 10 подростков 15-18 лет; 11 взрослых 19-45 лет.
Кроме того, проведен сравнительный анализ данных клинико-иммунологического обследования пациентов возрастной группы 19-45 лет с ЭВИ с СМ и МФ КЭ. Группу пациентов с МФ КЭ на основании общепринятых клинических критериев и результатов серологического обследования составили 35 человек в возрасте 19-45 лет (мужчин - 24, женщин - 11). Все пациенты находились на лечении в Городском центре природноочаговых инфекций (МО Новая больница, гл. врач Лившиц В.Р., зав. к.м.н. Топоркова М.Г.)
Значение абсолютной интегрированной средней интенсивности флюоресценции цитокинов у детей с энтеровирусными менингитами
У детей 4-7 лет в остром периоде ЭВИ с СМ наблюдали транзиторное снижение абсолютного содержания лимфоцитов в 1-10 сутки от начала заболевания. Относительное и абсолютное содержание моноцитов и гранулоцитов в динамике острого периода заболевания значимо не изменялось по отношению к показателям группы сравнения (таблица 4.10). Показатели поглотительной активности моноцитов и нейтрофилов, а также тесты, характеризующие состояние НАДФ-Н2-оксидазной системы нейтрофилов, значимо не отличались от параметров группы сравнения.
Показатели гемо- и иммуноцитограммы при энтеровирусной инфекции с серозным менингитом у детей 4-7 лет в динамике острого периода заболевания, Ме (LQ-UQ)
Фагоцитарная активность нейтрофилов, 109/л 3,18 2,45 4,54 3,08 2,31 3,78 3,24 2,88 4,04 Фагоцитарная активность моноцитов, % 84,35 75,30 89,62 81,90 73,55 88,05 79,40 62,50 88,40 Фагоцитарная активность моноцитов, 109/л 0,35 0,26 0,45 0,41 0,28 0,54 0,32 0,26 0,45 Бактерициднаяактивностьлейкоцитов 32,90 (3) 24,97 39,70 32,00 (3) 24,70 41,50 45,20 35,90 52,50 НСТ-тест спонтанный, % 9,00 5,00 16,00 7,00 4,00 13,00 5,00 3,00 9,75 НСТ-тест стимулированный, % 17,00 10,00 25,00 15,00 7,00 23,50 10,00 5,00 15,00 Примечание: значения в скобках указывают на значимые различия в группах, p 0,05 Значение иммунорегуляторного индекса (Th/Tc) в остром периоде ЭВИ с СМ у детей 4-7 лет оставалось сниженным на протяжении первой декады острого периода заболевания. Относительное содержание NK увеличивалось в 1-10 сутки от начала заболевания, далее возвращаясь к нормальным значениям. Относительное и абсолютное содержание субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD16+СD56+, значимо не изменялось (таблица 4.10). У детей 4-7 лет в остром периоде ЭВИ с СМ увеличивалось относительное содержание В-лимфоцитов в 1-10 сутки от начала заболевания. Абсолютное количество этих клеток не изменялось по отношению к группе сравнения. В этот же период наблюдали повышение общего уровня иммуноглобулинов классов IgG и IgE. Содержание ЦИК было повышено по отношению к группе сравнения в течение всего периода наблюдения (таблица 4.13).
Изменение относительного и абсолютного содержания основных субпопуляций CD4+ и СБ8+Т-эффекторов в остром периоде ЭВИ с СМ у детей 4-7 лет характеризовалось значимым повышением относительного и абсолютного содержания ТЫ лимфоцитов. Содержание Т-хелперов, экспрессирующих TNF-, не отличалось от показателей в группе сравнения, в то время как количество Неположительных Т-хелперов оставалось сниженным на протяжении всего периода наблюдения (таблица 4.12).
Относительное и абсолютное содержание Th2 лимфоцитов значимо увеличивалось и оставалось повышенным на протяжении 20 суток от начала заболевания. Соотношение Thl/Th2 лимфоцитов было снижено по отношению к показателю в группе сравнения в течение острого периода ЭВИ с СМ. Практически в три раза увеличивалась численность Tс1 клеток. Максимальное содержание Tel лимфоцитов наблюдали на 11-20 сутки от начала заболевания. Содержание CD3+CD8+TNF-+ лимфоцитов увеличивалось по отношению к группе сравнения в 1-10 сутки от начала заболевания. Относительное и абсолютное содержание CD3+CD8+IL-2+ лимфоцитов у детей 4-7 лет не изменялось по сравнению с нормальными значениями. Количество Тс2 лимфоцитов увеличивалось с первой декады заболевания до конца периода обследования.
В целом, в остром периоде ЭВИ с СМ у детей 4-7 лет в периферической крови происходило значимое увеличение относительного и абсолютного содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих IFN-Y и IL-4. Относительное и абсолютное содержание TNF-a+Т-лимфоцитов не изменялось, в то время как численность IL-2+Т-лимфоцитов оставалась сниженной на протяжении 20 суток от начала заболевания. Абсолютное содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих IL-17A, а также ТЫ 7 лимфоцитов у детей 4-7 лет было снижено на протяжении всего периода наблюдения. Изменение численности Т-лимфоцитов-эффекторов в периферической крови сопровождалось значимым увеличением концентрации IFN-y, IL-4 и IL-2, снижением уровня IL-10 и IL-17. На протяжении 1-10 суток от начала заболевания в периферической крови у детей 4-7 лет зарегистрирован повышенный уровень IL-18 (таблица 4.13).
Для оценки взаимосвязи иммунологических, клинических показателей и клеточного состава ЦСЖ с содержанием эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов рассчитаны парные коэффициенты корреляции Спирмена (Spearman, г). В первую декаду заболевания содержание IFN-y+ и TNF-a+Т-хелперов коррелировало с абсолютным содержанием в периферической крови моноцитов и их поглотительной активностью, а также бактерицидной активностью лейкоцитов, содержанием В-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов, NK, активированных Т-лимфоцитов, циркулирующих иммунных комплексов, содержанием других субпопуляций Т-эффекторов. Отрицательные корреляционные связи установлены между уровнем ТЫ лимфоцитов и длительностью регистрации симптомов Брудзинского (таблица 4.14).
Сравнительная характеристика эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов при Coxsackie В1-В5-менингитах
Несмотря на то, что представители мужского и женского пола в равной степени подвержены инфицированию НПЭВ, частота развития таких клинических форм НПЭВ-инфекции, как острый миокардит и серозный менингит, выше среди лиц мужского пола [91, 185]. Анализ 1720 случаев заболевания ЭВИ с СМ в г.Екатеринбурге с 2003 по 2014 гг. показал, что представители мужского пола среди заболевших составляют в среднем 61,3% (58,1-64,3%). Соотношение случаев заболевания, зафиксированных у представителей мужского и женского пола, в среднем составляющее 1,58 (1,39-1,80), варьирует от 1,2 в возрасте до 1 года до 2,6 у детей 14 лет. Тенденция к повышению соотношения в пользу лиц мужского пола наблюдается с увеличением возраста пациентов (данные представлены в Главе 2).
Ассоциированные с полом особенности иммунного ответа при CVB3-миокардитах на протяжении многих лет являются предметом интенсивного исследования, в то время как иммунные механизмы, лежащие в основе повышенной чувствительности лиц мужского пола к развитию ЭВИ с СМ, остаются не раскрытыми.
Сравнительный анализ данных иммунологического обследования продемонстрировал, что во всех возрастных группах существует определенный комплекс показателей, характеризующих системы как врожденного, так и адаптивного иммунитета, отличающихся у заболевших лиц мужского и женского пола.
У здоровых детей 1-3 лет при сравнении базового содержания иммунологических показателей, обнаружены значимые отличия в содержании нейтрофильных гранулоцитов и их фагоцитарной активности (выше у представителей мужского пола). В остром периоде ЭВИ с СМ численность фагоцитирующих нейтрофилов у девочек увеличивается, нивелируя эту разницу (таблица 4.44). Повышается также процент НСТ-положительных нейтрофилов, причем в спонтанном тесте доля НСТ-положительных нейтрофилов у мальчиков становится выше, чем у девочек. Т-лимфопения, обусловленная снижением содержания Т-хелперных субпопуляций лимфоцитов, регистрируется в течение 20 суток от начала заболевания у представителей обоих полов.
Абсолютное содержание цитотоксических Т-лимфоцитов значимо не изменяется. Что касается эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов, то вне зависимости от пола при ЭВИ с СМ у детей 1-3 лет происходит увеличение содержания Th2, Тс2 и Тс1 лимфоцитов и снижение содержания Th17 клеток.
Значимые ассоциированные с полом отличия обнаружены в содержании основных гуморальных компонентов иммунитета. У заболевших ЭВИ с СМ девочек зарегистрировано более высокое по сравнению с мальчиками содержание В-лимфоцитов (1-10-е сутки), уровень общих иммуноглобулинов IgM класса (1-20-е сутки) и ЦИК (таблица 4.44). По другим анализируемым показателям значимых отличий не обнаружено.
В возрасте 4-7 лет численность нейтрофильных гранулоцитов и их поглотительная активность становится выше у мальчиков с ЭВИ с СМ. Вне зависимости от пола в остром периоде заболевания происходит увеличение содержания следующих эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов: Th1, Tc1, Th2 и Тс2. При этом, у мальчиков 4-7 лет в первую декаду заболевания содержание Th1 и Tc1 клеток в среднем выше, чем у девочек (таблица 4.45). Кроме того, только у мальчиков значимо ниже содержания Th17 лимфоцитов в первую декаду заболевания. В свою очередь, заболевшие девочки характеризуются повышением содержания общих иммуноглобулинов классов IgA и IgG, более высоким содержанием IgM-антител и ЦИК.
Примечание: значения, выделенные шрифтом, указывают на значимые различия в группах, p 0,05; - значимые различия с группами сравнения, p 0,05 В возрасте 8-14 лет в группах сравнения у девочек базовое содержание Т-хелперов превышает их количество у мальчиков. Несмотря на снижение численности Т-хелперов у девочек в первую декаду заболевания, в 11-20-е сутки заболевания их абсолютное содержание превышает количество Т-хелперов у мальчиков с ЭВИ с СМ (таблица 4.46).
Вне зависимости от пола у детей 8-14 лет в остром периоде заболевания увеличивается число НСТ-положительных нейтрофилов. В течение всего наблюдения повышено содержание Tc1, Th2 и Тс2 лимфоцитов, снижено в 1-10-е сутки содержание Th17 и Tnc17 субпопуляций. Количество Th1 клеток увеличивается только у мальчиков в 11-20-е сутки от начала заболевания. Кроме того, мальчики в первую декаду заболевания характеризуются повышенным содержанием NK и более высокой относительной поглотительной активностью моноцитов. Заболевших девочек, как и в младших возрастных группах, отличает высокое содержание общих IgM-антител и ЦИК.
К числу ассоциированных с полом иммунологических отличий в группах практически здоровых подростков 15-18 лет относятся: повышенное содержание моноцитов, НСТ-положительных нейтрофилов, Th1 лимфоцитов у юношей и более высокое базовое содержание общих иммуноглобулинов класса IgG у представительниц женского пола (таблица 4.47). В острый период ЭВИ с СМ у юношей происходит значимое снижение содержания в периферической крови моноцитов, лимфоцитов, Т-лимфоцитов и их хелперных субпопуляций. Из эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов у подростков с ЭВИ с СМ увеличивается только содержание Th2 лимфоцитов (на протяжении всего периода обследования) и Tc2 (у девушек – с первой декады заболевания, у юношей – со второй).
Кроме того, в 11-20-е сутки от начала заболевания у юношей увеличивается абсолютное содержание в периферической крови Th17 субпопуляции. У 15-18-летних девушек по сравнению с юношами зарегистрировано более высокое содержание Т-хелперов, Th2 и Tc2 субпопуляций лимфоцитов и циркулирующих иммунных комплексов. В группе пациентов 19-45 летнего возраста анализ ассоциированных с полом особенностей иммунного ответа при ЭВИ с СМ не проводили в связи с недостаточно репрезентативной выборкой.
В результате типирования HLA I (A, B, Cw) и II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) у пациентов с ЭВИ с СМ получены данные, характеризующие частоту аллелей HLA I и II класса, суммированные в таблицах 4.48-4.52. Для сравнения частот аллелей и их носителей использованы: результаты обследования практически здоровых детей и взрослых (HLA-DRB1); данные, полученные при типировании лимфоцитов периферической крови по HLA-антигенам I класса 2856 жителей г .Екатеринбурга [49]. Кроме того, использовали базы данных HLA » Allele Frequency Search » Classical ресурса http://www.allelefrequencies.net. В качестве группы сравнения выбрана популяция, обследованная в г.Челябинск (54 32 N, 60 20 E, Sample Size: 207, Loci typed: A, B, DQA1, DQB1, DRB1, Author(s): T.A. Suslova, A.L. Burmistrova, M.S Chernova, E.B. Khromova, E.I. Lupar, S.V. Timofeeva, M.N. Vavilov, I.V. Devald & C.Darke) и европеоидная популяция г. Санкт-Петербург (59 58 N, 30 18 E, Sample Size: 100, Loci typed: A, B, C, DQB1, DRB1, Author(s): Ludmila Bubnova, Poster presentation P28 EFI 2012). Из 14 аллелей HLA-A (A1, A2, A3, A11, A19, A23, A24, A25, A26, A28, A29, A30, A31, A32), HLA-A3 и HLA-A31 имели положительную ассоциацию с заболеванием, HLA-A2, напротив, отрицательную. Распределение аллелей HLA-B и HLA-Cw в группе пациентов с ЭВИ с СМ значимо не отличалось от показателей групп сравнения. Наиболее существенные отличия получены в частоте аллелей HLA II класса (DRB1, DQA1 и DQB1). Так в группе пациентов с ЭВИ с СМ у 50% заболевших присутствовал HLA-DRB1 01, при этом средняя частота этого аллеля в группе сравнения составила 18,2% (OR=4,500, 95% CI=2,391-8,471, p 0,0001). Эти же пациенты характеризовались присутствием аллелей HLA DQA1 01:01 и HLA-DQB1 05:01. Таким образом, частота гаплотипа HLA DRB1 01;DQA1 01:01;DQB1 05:01 (соответствует варианту HLA-DR1;DQ5) составила 25%, что значительно превышает его частоту в популяции европеоидов (8,5%) [220]. Это дает основание рассматривать данное сочетание HLA II в качестве гаплотипа-провокатора, ассоциированного с высокой чувствительностью к ЭВИ с СМ (OR=3,588; 95% CI= 1,916-6,718, p 0,0001).