Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Трансинтестинальная транслокация бактерий и их токсинов 11
1.1.1. Проблема подтверждения бактериальной транслокации 12
1.1.2. Защита организма от бактериальной транслокации 13
1.2. Роль кишечника в полиорганной недостаточности 15
1.2.1. Стрессовое воздействие и гипоперфузия слизистой оболочки кишечника 16
1.2.2. Гиперпроницаемость слизистой кишечника и бактериальная и/или эндотоксиновая транслокация 19
1.2.3. Транслокация и полиорганная недостаточность 21
1.3. Изменение иммунного статуса в ответ на хирургическое вмешательство 23
1.3.1. Функции макрофагов 24
1.3.2. Характеристика лимфоцитов 25
1.3.3. Цитокиновый профиль 25
1.4. Иммунный статус онкологических больных 26
1.5. Заключение 27
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Использованные реактивы и препараты 30
2.2. Приборы и оборудование 30
2.3. Характеристика пациентов 31
2.4. Схема исследования 33
2.5. Оценка проницаемости кишечной стенки
2.5.1. Определение лактулозы 34
2.5.2. Определение маннитола 34
2.6. Оценка функциональной активности гранулоцитов и моноцитов 35
2.6.1. Фагоцитарная активность нейтрофилов 35
2.6.1.1. Латекс. 35
2.6.1.2. L. Acidophilus. 35
2.6.1.3. S. Cerevisiae. 35
2.6.1.4. Тест восстановления нитросинего тетразолия. 35
2.6.2. Исследование фенотипа лейкоцитов 36
2.7. Измерение сывороточного уровня липополисахарида 37
2.8. Измерение концентрации в сыворотке крови интерлейкинов 37
2.9. Статистическая обработка 37
Глава 3. Результаты. 38
2.1. Исследование динамики липополисахарида 38
2.2. Исследование трансинтестинальной проницаемости 43
3.1. Цитокиновый профиль 48
3.2. Исследование функциональной активности гранулоцитов и моноцитов 57
3.4.1. Фагоцитарная активность нейтрофилов 57
3.4.2. Кислородзависисимая цитотоксичность нейтрофилов 66
3.4.3. Исследование фенотипа лейкоцитов
3.4.3.1. Фенотип гранулоцитов 69
3.4.3.2. Фенотип моноцитов 72
Обсуждение 77
Выводы 87
Список литературы
- Проблема подтверждения бактериальной транслокации
- Изменение иммунного статуса в ответ на хирургическое вмешательство
- Приборы и оборудование
- Исследование функциональной активности гранулоцитов и моноцитов
Введение к работе
Актуальность темы
Слизистая оболочка кишечника формирует эффективный барьер для
микроорганизмов и токсинов. Нарушение этого защитного механизма в случае
увеличения кишечной проницаемости может привести к чрезмерной
транслокации кишечных бактерий и/или их токсинов в окружающие ткани и отдаленные органы [Papa M. et al., 1983]. Многочисленные исследования позволили обнаружить трансинтестинальное перемещение бактерий и токсинов у пациентов с ожогами, кардиогенным шоком, кишечной непроходимостью, а также при стрессе и переохлаждениях [Ando T. et al., 2000]. Наибольшее повышение ЛПС в крови отмечено после хирургических операций, в том числе не связанных с нарушением целостности кишечной трубки [O’Boyle C.J.et al., 1998].
Патогенетический механизм действия ЛПС опосредован активацией эффекторов врожденного иммунитета. Высвобождаемые биологически активные молекулы, в том числе и медиаторы воспаления, способные оказывать повреждающее действие на паренхиматозные органы и вызывать органную или полиорганную недостаточность (ПОН).
Несмотря на несомненные успехи в лечении сепсиса, смертность от этого патологического состояния колеблется от 15% до 80%. Поэтому необходимы более глубокое понимание патогенеза и поиск биомаркеров сепсиса для ранней диагностики и разработки новых методов лечения. У онкологических больных риск развития синдрома системной воспалительной реакции и сепсиса в послеперационном периоде на 30% выше, чем у пациентов общехирургического профиля. Это обусловлено опухолеассоциированными иммуносупрессивными состояниями больных и объемом хирургического вмешательства.
Таким образом, нарушение кишечной проницаемости, вызванное
хирургическим вмешательством, может стать пусковым механизмом развития системной воспалительной реакции и осложненного течения послеоперационного периода. Однако, до настоящего времени эффект транслокации бактериальных токсинов из кишечника в ответ на операционную травму остается до конца не
4 изученным, а имеющиеся немногочисленные исследования, посвященные оценке кишечной проницаемости, не касаются особенностей онкологических больных.
Изучение триггерных механизмов иммунных реакций организма является в настоящее время одной из важнейших задач биомедицинских исследований, решение которой позволит понять патогенез развития послеоперационных гнойно-септических осложнений, а также выявить прогностические маркеры и разработать меры профилактики.
Цель работы: исследование изменения трансинтестинальной проницаемости и показателей иммунитета у онкологических больных в периоперационном периоде.
Задачи исследования
-
Оценить изменение трансинтестинальной проницаемости у онкологических больных в периоперационном периоде по экскреции лактулозы и маннитола, а также сывороточной концентрации ЛПС.
-
Исследовать состояние врожденного иммунитета у больных в периоперационном периоде.
-
Выявить взаимосвязь между уровнем кишечной проницаемости и показателями врожденного иммунитета у онкологических больных в периоперационном периоде.
-
Оценить связь состояния трансинтестинальной проницаемости с развитием послеоперационных осложнений.
Научная новизна
В настоящей работе впервые оценены параметры проницаемости кишечной
стенки у онкологических больных с помощью определения экскреции с мочой
лактулозы и маннитола. Одновременно исследовано содержание в крови
эндотоксина, как следствие повышенной проницаемости кишечной стенки.
Рассмотрена взаимосвязь повышенной трансинтестинальной проницаемости с
активацией эффекторов врожденного иммунитета и развитием
послеоперационных осложнений у онкохирургических больных.
Научная и практическая значимость
Полученные результаты позволят расширить представления о влиянии
хирургического вмешательства на проницаемость кишечной стенки и показатели
врожденного иммунитета. Увеличение трансинтестинальной проницаемости
может рассматриваться в качестве прогностического фактора неблагоприятного
течения раннего послеоперационного периода у онкологических больных.
Полученные результаты обосновывают необходимость дооперационной
коррекции проницаемости стенки кишечника и повышенного содержания эндотоксина.
Положения, выносимые на защиту
-
Повышение до операции содержания в сыворотке ЛПС, экскреции лактулозы и маннитола сопряжено с развитием послеоперационных осложнений у онкологических больных.
-
Оперативное вмешательство приводит к возрастанию проницаемости кишечной стенки как у онкологических, так и у кардиохирургических больных.
-
После хирургического вмешательства возрастают содержание интерлейкина 10 и фагоцитарный индекс у всех исследуемых групп пациентов.
-
Онкологические больные с осложнениями характеризуются повышенными показателями фагоцитарной активности, содержанием ЛПС, ИЛ-10, ИЛ-6, CD14+CD16+ клеток на протяжении периоперационного периода.
Личный вклад автора. Выполнение исследования, анализ и статистическая обработка данных осуществлялись лично автором.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены на VI всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 24-28 сентября 2012 г.); конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Нижний Новгород, 31 мая -1 июня 2012 г.). Апробация диссертации состоялась 08.07.2015 г. на объединенной научной конференции НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рецензируемых ВАК, 5 тезисных сообщений и одно свидетельство о регистрации программы для ЭВМ.
Объем и структура диссертации.
Проблема подтверждения бактериальной транслокации
Тонкий кишечник является резервуаром для большого числа бактерий и их токсичных продуктов (эндотоксины и пептидогликаны), в связи с чем нарушение кишечного барьера может привести к системной бактериемии и септическому состоянию. Именно в этом контексте концепция бактериальной транслокации привлекла внимание клиницистов в 1980х, так как объясняла факт эндотоксемии и бактериемии у тяжелобольных и пациентов с травмой в отсутствии фокуса инфекции [53]. Однако подтверждение бактериальной транслокации у пациентов оказалось затруднительным, так как требовало биопсию лимфатических узлов. Поэтому в клинике стали применять непрямые методы подтверждения бактериальной транслокации: связь повышенной проницаемости кишечной стенки и ПОН; связь ишемии кишечной стенки и органной недостаточности; исследования, показывающие, что селективная деконтаминация ЖКТ пациентов улучшает клинический исход.
Наиболее часто в практике для оценки бактериальной транслокации используют измерение кишечной проницаемости для веществ, вводимых перорально. Так, исследования показали, что кишечная проницаемость повышена у больных с ожогами, травмой, а также у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии. Однако, менее чем в половине работ была выявлена связь увеличения трансинтестинальной проницаемости с наличием инфекционных осложнений или эндотоксемии [45;47;57]. Несмотря на это, зависимость развития ПОН от степени проницаемости кишечной стенки была подтверждена в значительно большем числе случаев [70;72;95]. Подобные исследования подтверждали теорию о том, что развитие синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) и органной недостаточности после травмы, шока и других системных стрессовых воздействий обусловлено небактериальными провоспалительными факторами, попадающими из кишечника через брыжеечные лимфатические узлы в системный кровоток [42;115]. Эта теория объясняет развитие сепсиса и ПОН в отсутствии бактерий и их токсинов в системной циркуляции, а также связь повышенной проницаемости кишечной стенки и ПОН [37].
Стрессовый ответ – это гормональные и метаболические изменения в ответ на повреждение, включающие реакции со стороны нервной, эндокринной и иммунной систем и системы гемостаза. Стрессовый ответ на повреждение тканей характеризуется увеличением секреции гормонов гипофиза и активацией симпатической нервной системы. Общий метаболический эффект гормональных изменений направлен на усиление катаболизма, сохранение водно-солевого баланса, объема циркулирующей жидкости и гомеостаз.
В ответ на стресс со стороны иммунной системы увеличивается продукция цитокинов, пролиферация и функциональная активность нейтрофилов и лейкоцитов. Инициирующим фактором является секреция ИЛ-1 и ФНО активированными макрофагами и моноцитами поврежденных тканей. Это стимулирует дальнейшую выработку цитокинов, в большей степени ИЛ-6, ответственного за инициацию острой фазы воспаления [44].
Стресс также оказывает воздействие и на энтеральную нервную систему, что приводит к функциональным изменениям ЖКТ. Среди них: желудочная секреция, перистальтика кишечника, проницаемость и барьерная функция [69;107]. Кровоснабжение кишечника является избыточным по отношению к его потребностям [73]. В экспериментах показано, что кровоснабжение кишечника должно быть снижено более чем на 50%, чтобы вызвать заметное повреждение тканей. Местные адаптивные механизмы способны компенсировать снижение кровотока до 50% и предотвратить повреждение. Эти механизмы включают увеличение экстракции кислорода и перераспределение кровотока стенки кишечника к местам с более высокой метаболической потребностью [26]. Периферическая вазоконстрикция является основным компенсаторным механизмом гиповолемии, переключающим кровоток от кишечника к сердцу и головному мозгу. Если вазоконстрикция длительная и выраженная, как при септическом шоке, геморрагии или сердечной тампонаде, то могут развиться гипоксия слизистой кишечника и его морфологические повреждения [55;114]. Кровоснабжение ворсинчатого слоя представлено сетью анастомозов между центрально расположенными артериями и субэпителиальными небольшими венами и капиллярами. Артериолы ветвятся и формируют анастомозы только на кончиках ворсинок, в связи с чем в слизистой оболочке кишечника образуется конечный градиент давления О2 с его минимальным значением на верхушке ворсинок (рис. 2).
Артериальная ишемия делает невозможным аэробный метаболизм, что вызывает повреждение тканей из-за нехватки кислорода. Происходит накопление токсичных метаболитов, приводящих к развитию некроза. Однако, если ишемия устранена до начала развития необратимых повреждений, то доставка кислорода позволяет восстановить нормальный метаболизм и функции клеток [30]. Несмотря на это, в зависимости от времени и тяжести ишемии, возобновление доставки кислорода может только усилить повреждение тканей. Ишемия с последующей реперфузией приводят к нарушению слизистого барьера, транслокации бактерий и активации воспалительного ответа [63]. Одним из механизмов повреждения стенки тонкого кишечника является свободные радикалы, образующиеся в электрон-транспортной цепи митохондрий, метаболизме ксантин-оксидазы, активированных нейтрофилах [54;100]. В норме, активные формы кислорода нейтрализуются ферментами антиоксидантной системы, но во время реперфузии образуется избыточная концентрация свободных радикалов, запускающая процесс окислительного стресса. Так, свободные формы кислорода вызывают пероксидацию липидов клеточной мембраны, что активирует миграцию и адгезию гранулоцитов, способствующих дальнейшему повреждению тканей [79].
Xu et al. провели исследование с целью подтверждения гипотезы о том, что бактериальная транслокация является следствием ишемии кишечника и его повреждения активными формами кислорода. Так, крысам однократно вводили нелетальную дозу эндотоксина, вызывающую транслокацию бактерий через стенку кишечника. Это приводило к снижению кровоснабжения дистальных отделов тонкой кишки на 35-50%, в то время как перфузия печени, поджелудочной железы, селезенки и тощей кишки не была нарушена. Проницаемость для 51CrEDTA оказалась повышенной в подвздошной кишке, но не в тощей, где кровоток не был нарушен. Аллопурнол, блокатор ксантин-оксидазы предотвращал нарушение как перфузии, так и проницаемости подвздошной кишки. Авторы заключили, что нарушение эпителия кишечника, вызванное эндотоксином, опосредовано влиянием ишемического повреждения дистального отдела тонкого кишечника [117].
Изменение иммунного статуса в ответ на хирургическое вмешательство
В ранние сроки в ответ на травму неизбежно развивается воспалительная реакция, обусловленная, прежде всего врожденным иммунитетом. Гипервоспалительная реакция приводит к чрезмерному высвобождению медиаторов воспаления, активации нейтрофилов, капиллярной адгезии и неконтролируемому, индуцированному лейкоцитами, окислительному взрыву. Высвобождение IL-6 вызывает ответ острой фазы и приводит к активации как противовоспалительных факторов, так и ингибиторов медиаторов воспаления (простагландина (PG) E2, IL-1ra, IL-10 и TGF-), что отражает защитный механизм, ограничивающий повреждение ткани эндогенными провоспалительными факторами. С другой стороны, преобладание противовспалительных медиаторов может приводить к иммунодепрессии и анергии иммунных клеток [68]. Так, хирургическая операция приводит к снижению всех основных компонентов иммунной системы: фагоцитоза, гуморального и клеточного иммунитета. Количественные и качественные изменения в фагоцитарной системе проявляются в снижении числа основных фагоцитирующих клеток: нейтрофилов/моноцитов, подавлении захвата и переваривания микроорганизмов. Изменения гуморального звена иммунитета характеризуются снижением содержания всех классов иммуноглобулинов.
Клеточный иммунитет реагирует на хирургическую травму подавлением функциональной активности и общего числа Т-лимфоцитов без существенного изменения соотношения основных субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров [71]. Снижение функциональной активности Т-клеток после операции проявляется в угнетении способности этих клеток к пролиферативному ответу на Т-митогены и синтезу цитокинов [14]. Данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что ответ на травму это динамический процесс, развивающийся под влиянием разнообразных факторов, включая активацию нейроэндокринной системы (глюкокортикоиды, катехоламины) и последующие изменения микроциркуляции, коагуляции и разнообразных метаболических процессов. Иммунологические нарушения при травме могут приводить к иммунопараличу, являющемуся одной из основных причин посттравматических осложнений. Следовательно, изучение изменений иммунного ответа на хирургическую травму, наряду с проницаемостью кишечной стенки, является актуальным для понимания механизмов развития послеоперационных осложнений. Глава 2. Материалы и методы
В исследование было включено 40 пациентов со злокачественными образованиями желудочно-кишечного тракта 2-3 степени ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» и ФГБУ ФНКЦ ФМБА. Из них у 29 больных раком желудка и 11 – раком толстой кишки. Возраст больных колебался от 48 до 85 лет. В группу входили 23 мужчины (57,5%) и 17женщин (42,5%).
Всем онкологическим пациентам были проведены расширенные хирургические вмешательства: гастропанкреатодуоденальные резекции (n=3), гастроэктомии (n=27), гемиколэктомии (n=10). У 8 пациентов онкологического профиля развились послеоперационные осложнения в виде панкреатита (n=6), пневмонии (n=2) и сепсиса (n=1). Поэтому было выделено 2 группы: онкологические пациенты с послеоперационными осложнениями и без таковых.
Также была набрана группа кардиохирургического профиля на базе ФГБУ ФНКЦ ФМБА, включающая 14 пациентов, из них 13 мужчин и 1 женщина. Возраст колебался от 51 до 76 лет. Данным больным проводились операции по замене аортального (n=4) и митрального клапанов (n=2), аортокоронарное (n=6) и маммарокоронарное (n=5) шунтирование.
В качестве группы сравнения были отобраны 12 пациентов с обострением атопической бронхиальной астмы на кафедре клинической иммунологии и аллергологии МГМУ им. И.М.Сеченова. Из них – 7 женщин и 5 мужчин. Средний возраст пациентов составил 47 лет. Диагноз атопической бронхиальной астмы был подтвержден анамнестическими, физикальными, лабораторными и инструментальными методами исследования, согласно GINA, пересмотр 2010 года. У всех пациентов диагноз бронхиальной астмы был поставлен ранее, в среднем «стаж» заболевания составил 6.5 +/- 1.7 лет. У одного пациента бронхиальная астма была диагностирована впервые.
Все пациенты были доставлены в клинику нарядом скорой медицинской помощи с жалобами на приступы экспираторного удушья (преимущественно, в ночные или ранние утренние часы), тяжесть в грудной клетке, приступообразный кашель с трудноотделяемой вязкой мокротой или сухой кашель, «свистящее дыхание», одышку при минимальной физической нагрузке и/или в покое. У всех пациентов имелся аллергологический анамнез, (бытовая, эпидермальная, пыльцевая, грибковая сенсибилизация, непереносимость препаратов ацетилсалициловой кислоты), подтвержденный либо скарификационными аллергопробами, либо специфическими Ig E. В качестве контрольной группы были обследованы 25 здоровых доноров в возрасте от 19 до 45 лет (средний возраст – 32 года). Среди них – 17 мужчин (68%) и 8 женщин (32%). От всех пациентов получено информированное согласие на проводимые исследования.
Приборы и оборудование
Ряд клинических исследований показал, что бактериальный эндотоксин может обнаруживаться в кровотоке и при отсутствии инфекции. В частности, хирургическая травма, ожоги и другие патологические состояния могут приводить к нарушению кишечной проницаемости и транслокации ЛПС в системный кровоток, даже при отсутствии каких-либо признаков инфекции [29]. В настоящем исследовании показано, что у онкологических больных с послеоперационными осложнениями на дооперационном этапе концентрация ЛПС в крови была достоверно выше, чем у остальных исследуемых групп пациентов. После операции уровень ЛПС у этой группы больных достоверно возрастал и был повышен в сравнении с онкологическими больными без осложнений. Достоверного изменения концентрации ЛПС в ответ на оперативное вмешательство у кардиохирургических пациентов и онкологических больных без осложнений не выявлено, однако это может объясняться тем, что свободный ЛПС в крови связывается с ЛПС-связывающим белком (ЛСБ). Данный комплекс не определяется с помощью использованной тест-системы.
Для распознавания ЛПС TLR4 требуется участие различных акцессорных молекул. ЛПС сначала связываются с ЛПС – связывающим белком плазмы, который перемещает его к рецепторам макрофагов (CD14). Далее ЛПС взаимодействует с TLR4 и инициирует каскад внутриклеточных реакций, приводящих к запуску синтеза медиаторов воспаления макрофагами.
Полученные данные согласуются с результатами других исследований, показавших увеличенный уровень ЛПС у онкологических больных с сепсисом [2]. Авторы предлагают использовать нарастание концентрации ЛПС и снижение содержания ЛСБ как прогностический фактор неблагоприятного течения сепсиса [1]. Показатели кишечной проницаемости в группе онкологических больных без осложнений не отличались от таковых у кардиохирургических пациентов как до, так и после операции. Это позволяет предположить, что локализация опухоли в органах желудочно-кишечного тракта, сама по себе не влияет на трансинтестинальную проницаемость. Однако исследуемые параметры были повышены в группе онкологических больных с послеоперационными осложнениями, что наблюдалось уже на дооперационном этапе. Хирургическое вмешательство приводило к возрастанию экскреции лактулозы у всех исследуемых групп больных. Результаты данного исследования согласуются с имеющимися литературными данными о повышении трансинтестинальной проницаемости в ответ на хирургическое вмешательство [17]. Рассматриваемое явление наблюдалось не только в группе онкологических больных, у которых в ходе операции нарушалась целостность желудочно-кишечного тракта, но и во время кардиохирургических манипуляций, не оказывающих непосредственного влияния на состояние кишечной стенки. У онкологических больных с послеоперационными осложнениями проницаемость кишечной стенки была повышена на протяжении послеоперационного периода в сравнении с пациентами без осложнений.
Результаты настоящей работы свидетельствуют о повышенной кишечной проницаемости онкологических больных с послеоперационными осложнениями в сравнении с кардиохирургическими пациентами и группой онкологических больных без осложнений. Возможно, повышенную трансинтестинальную проницаемость можно связать с развитием послеоперационных воспалительных осложнений. Измерение экскреции с мочой неметаболизируемых сахаров, введенных перорально, широко используется для исследования кишечной проницаемости, как при различных патологиях, так и в здоровом организме. Метод двух сахаров основан на том, что небольшие молекулы (маннитол, рамноза) проходят через слизистую оболочку кишечника трансцеллюлярным путем, а большие молекулы (лактулоза, целлобиоза) – парацеллюлярным путем, через плотные контакты. Таким образом, возрастание процента экскреции лактулозы свидетельствует о повышении проницаемости плотных контактов.
Межклеточные плотные контакты представляют собой комплекс из нескольких белков, формирование которого регулируется множеством факторов. Так, имеются данные об изменении числа плотных контактов в ответ на действие интерферона , фактора некроза опухоли , интерлейкинов 1, 4, 6, 10, различных факторов роста. Механизмы такой регуляции связывают с влиянием вышеперечисленных цитокинов на реорганизацию актинового цитоскелета, что ведет к изменению структуры плотных контактов [27].
В данном исследовании хирургическое вмешательство приводило к возрастанию содержания в крови ИЛ-10 у онкологических больных без осложнений и кардиохирургичсеких пациентов. У онкологических больных как без, так и с осложнениями увеличивалась концентрация также и ИЛ-6. Полученные данные согласуются с описанными выше литературными данными о возрастании содержания как про-, так и противовоспалительных цитокинов после оперативного воздействия.
ИЛ-6 является одним из предполагаемых маркеров тяжести инфекционного или неинфекционного стресса, индуцируя продукцию белков острой фазы. Роль ИЛ-6 в патогенезе септического шока и ПОН, а также его прогностическое значение рассматривается многими авторами, однако результаты противоречивы. Повышенный уровень данного цитокина отмечают при септических состояниях [10;34], но его прогностическое значение не подтверждено. Возрастание концентрации ИЛ-6 в крови отмечено после хирургических операций, причем содержание цитокина коррелирует со сложностью оперативного вмешательства [34;77;83]. Эти работы служат основанием рассматривать ИЛ-6 в качестве прогностического маркера послеоперационных инфекционных осложнений. Однако интерпретация сывороточных уровней цитокинов неоднозначна, так как ИФА позволяет определить только свободные формы, а не связанные с клеточными или растворимыми рецепторами.
Экспрессия цитокинов моноцитами стимулируется бактериальными продуктами. Так, попавший в кровоток ЛПС связывается с CD14 на поверхности моноцитов, активируя через TLR4 внутриклеточные сигнальные каскады, транскрипционные факторы и, в конечном счете, синтез цитокинов. ФНО является основным цитокином, регулирующим иммунный ответ посредством усиления пролиферации клеток, экспрессии рецепторов, миграции. Кроме того, ФНО влияет на продукцию других цитокинов [21].
С помощью моноклональных антител выделяются классические CD14++ моноциты и популяция CD14+CD16+ [121]. Показано, что численность последних существенно возрастает у пациентов с тяжелой инфекцией [84]. Моноциты CD14+CD16+ характеризуются повышенным уровнем экспрессии антигенов HLA-DR и определенным набором синтезируемых цитокинов [122]. В частности, эти клетки эффективно продуцируют ФНО, в то время как синтез противовоспалительных цитокинов, например, ИЛ-10, практически отсутствует в сравнении с классическими моноцитами [50].
По результатам настоящей работы относительное содержание CD14+CD16+ субпопуляции моноцитов оказывается выше у онкологических больных, чум у здоровых доноров. Также в послеоперационном периоде данный показатель у онкологических больных с осложнениями превышает таковой у пациентов без осложнений. Это говорит о повышенной активации моноцитарного звена иммунитета у онкологических больных с развившимися после операции осложнениями.
Исследование функциональной активности гранулоцитов и моноцитов
Известно, что онкологические больные характеризуются повышенным содержанием в крови различных цитокинов [9;11], влияющих на систему межклеточных контактов и, соотвествено, на проницаемость кишечника. Это, наряду с последующим стрессовым воздействием расширенного хирургического вмешательства, может стать причиной транслокации бактерий и/или их токсинов через кишечную стенку в системный кровоток, что может привести к развитию системной воспалительной реакции в раннем послеоперационном периоде. Это согласуется с данными других авторов о повышенном уровне ЛПС и некоторых цитокинов у онкологических больных с сепсисом [2;10]. Можно предположить, что, проникающий вследствие повышенной кишечной проницаемости в кровь ЛПС, посредством толл-подобных рецепторов индуцирует ответ эффекторов врожденного иммунитета [13], что на фоне уже активированной иммунной системы приводит к развитию системной воспалительной реакции. Поэтому, оценка трансинтестинальной проницаемости может рассматриваться в качестве прогностического фактора неблагоприятного течения раннего послеоперационного периода у онкологических больных.
В последние годы стало очевидным, что TLRs могут распознавать ряд эндогенных продуктов, которые могут рассматриваться как «сигналы тревоги» неинфекционной природы. К эндогенным активаторам врожденного иммунитета относят: белки теплового шока, фибриноген, гиалуроновые кислоты, мочевую кислоту [65].
При травме или инфекции эффекторные клетки подвергаются воздействию не только одного сигнала, а многократному и синергичному воздействию нескольких стимулов, приводящих к усиленной продукции медиаторов воспаления. В частности, установлен синергизм в действии эндотоксина с другими агонистами TLR или лигандами Nod, микробными экзотоксинами, вирусной инфекцией, гипоксией и даже глюкозой. При инфекционном процессе ответ лейкоцитов (например, макрофагов) на PAMPs усиливается высвобождаемыми эндогенными медиаторами и кофакторами. Следовательно, «сигналами тревоги» необходимыми для инициации системного воспалительного ответа могут быть не только микроорганизмы или их дериваты, но и продукты неинфекционной природы, в том числе и эндогенные факторы. Системное воспаление способно развиваться в отсутствие бактериемии и даже без наличия локального очага инфекции, который может быть потенциальным источником бактериальных продуктов. Исследования последствий травмы и сердечно-сосудистой хирургии свидетельствуют о том, что индуктором генерализованной воспалительной реакции может быть эндогенная микрофлора и ее дериваты. Нарушения проницаемости кишечника приводят к транслокации ЛПС и других бактериальных токсинов в кровоток, что неизбежно индуцирует ответную воспалительную реакцию иммунной системы.
В работе изучалось изменение трансинтестинальной проницаемости, содержания ЛПС, цитокинового профиля, активности нейтрофилов, фенотипических особенностей клеток врожденного иммунитета у онкологических больных на протяжении периоперационного периода. Проводилось сравнение с группами здоровых доноров, кардиохирургических пациентов и больных бронхиальной астмой. В ходе исследования было установлено, что хирургическое вмешательство приводит к возрастанию проницаемости кишечной стенки, следствием которой является повышение в крови у онкологических и кардиохирургических пациентов. На фоне повышения концентрации ЛПС отмечается активация эффекторов врожденного иммунитета – фагоцитов и продукция медиаторов воспаления. Наибольшее повышение уровня ЛПС, CD16+ моноцитов, фагоцитарного индекса, концентрации ИЛ-10 и ИЛ-6 и снижение содержания CD95+ гранулоцитов зарегистрировано у онкологических больных с осложнениями в сравнении со здоровыми донорами, кардиохирургическими пациентами, онкологическими больными без осложнений.
Развитие ССВР и ПОН у онкохирургических больных. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что нарушение трансинтестинальной проницаемости в ответ на хирургическую травму, следствием которой является транслокация в кровоток бактериального эндотоксина, может быть триггерным механизмом системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности за счет высвобождения медиаторов воспаления и свободных радикалов активированными эффекторами врожденного иммунитета. Учитывая полученные данные, повышение проницаемости кишечной стенки у онкологических больных в первые сутки после хирургического вмешательства является неблагоприятным прогностическим фактором развития ССВР и сепсиса. Повышение трансинтестинальной проницаемости у онкологических больных в дооперационном периоде может служить предиктором развития осложнений в раннем послеоперационном периоде.