Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика гликолипидных биосурфактантов продуцируемых актинобактериями родов mycobacterium и rhodococcus 10
1.2. Рецепторы гликолипидных биосурфактантов 17
1.3. Биологическая активность и иммуномодулирующие свойства трегалолипидных биосурфактантов 31
Глава 2. Материалы и методы исследований 44
2.1. Приготовление Rhodococcus-биосурфактанта. Выделение доминирующей фракции из гликолипидного комплекса Rhodococcus rubber ИЭГМ 231 44
2.2. Экспериментальные подходы in vitro 46
2.2.1 Объект исследования in vitro 46
2.2.2. Оценка микробицидной активности лейкоцитов периферической крови. Постановка люминолзависимой хемилюминесценции 46
2.2.3. Оценка продукции цитокинов гранулоцитами периферической крови 48
2.2.4. Конфокальная и атомно-силовая микроскопия моноцитов 49
2.3. Экспериментальные подходы in vivo 51
2.3.1. Объект исследования in vivo 51
2.3.2. Оценка количества антителообразующих клеток методом Ерне 51
2.3.3. Оценка окислительной активности перитонеальных лейкоцитов мыши in vivo методом люминолзависимой хемилюминесценции 53
2.3.4. Оценка продукции цитокинов перитонеальными лейкоцитами и спленоцитами мыши 54
2.3.5. Реакция бласттрансформации лимфоцитов 56
2.4. Статистический анализ результатов 57
Глава 3. Результаты исследований 58
3.1. Результаты исследований in vitro 58
3.1.1. Влияние Rhоdococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, IL-1, IL-8 лейкоцитами и гранулоцитами периферической крови in vitro 58
3.1.2. Влияние биосурфактантного гликолипидного комплекса из Rhodococcus ruber на морфологическую структуру моноцитов периферической крови человека in vitro 64
3.2. Результаты исследований in vivo 69
3.2.1. Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на функциональную активность спленоцитов in vivo 69
3.2.2. Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, про- и противовоспалительных цитокинов перитонеальными лейкоцитами, а также антителогенез в селезенке при различных способах введения гликолипида .72
3.2.3. Влияние доминирующей фракции Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши, а также антителогенз в селезенке при различных способах введения гликолипида 82
Заключение 90
Выводы .97
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 101
- Рецепторы гликолипидных биосурфактантов
- Влияние Rhоdococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, IL-1, IL-8 лейкоцитами и гранулоцитами периферической крови in vitro
- Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, про- и противовоспалительных цитокинов перитонеальными лейкоцитами, а также антителогенез в селезенке при различных способах введения гликолипида
- Влияние доминирующей фракции Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши, а также антителогенз в селезенке при различных способах введения гликолипида
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности
Биосурфактанты микробного происхождения, благодаря разнообразию химических
структур и биологических функций, являются объектом повышенного внимания со
стороны различных индустрий. В силу их химического разнообразия,
многофункциональных характеристик и низкой токсичности, по сравнению с
синтетическими поверхностно-активными соединениями, биосурфактанты становятся все
более интересными для многих отраслей промышленности. В последние годы большой
интерес к микробным биосурфактантам проявляет фармацевтическая промышленность,
рассматривая их как возможные компоненты новых лекарственных средств
многоцелевого назначения, благодаря наличию у некоторых биосурфактантных
комплексов высокой иммуномодулирующей активности (Kitamoto D., Isoda H., Nakahara
T. Functions and potential applications of glycolipid biosurfactants from energy-saving materials
to gene delivery carriers. J. Biosci. Bioeng. 2002. Vol. 94(3). P. 187-201). Наиболее
перспективными для медико-биологических исследований являются гликолипидные
биосурфактантные комплексы, состоящие из моно- и дисахаров, соединённых с -разветвленными -гидроксилированными жирными (миколовыми) кислотами (Luna J.M., Rufino R.D., Sarubbo L.A. Evaluation antimicrobial and antiadhesive properties of the biosurfactant Lunasan produced by Candida sphaerica UCP 0995. Curr. Microbiol. 2011. Vol. 62. P. 1527–1534). Повышенным содержанием подобных структур характеризуются гликолипиды наружной оболочки коринеформных и нокардиоформных актинобактерий (Lee W.B., Kang J.S., Yan J.J. et al. Neutrophils promote Mycobacterial trehalose dimycolate-induced lung Inflammation via the Mincle pathway. PLoS Pathog. 2012. Vol. 8 (4):е1002614). В настоящее время предполагают, что именно структура миколовых кислот и их процентное содержание в клеточной стенке бактерий определяют токсичность, персистенцию и иммунногенность ряда микроорганизмов, в частности, микобактерий, нокардий и коринебактерий. В ряде работ была продемонстрирована способность гликолипидных биосурфактантных комплексов модулировать врожденный, приобретенный, клеточный и гуморальный иммунный ответ (Ryll R., Kumazawa V., Vano I. Immunological Properties of Trehalose Dimycolate (Cord Factor) and Other Mycolic Acid-Containing Glycolipid. Microbes and Infection. 2001. Vol. 45(12). P. 801-811), [10]. Наиболее изучены в этом плане гликолипиды патогенных бактерий (Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphtheriae и др.), однако явная или потенциальная опасность штаммов-продуцентов, а так же высокая токсичность синтезируемых ими гликолипидов представляют собой
серьезный ограничивающий фактор в плане их практического применения (Ryll К, Kumazawa V., Vano I. Immunological Properties of Trehalose Dimycolate (Cord Factor) and Other Mycolic Acid-Containing Glycolipid. Microbes and Infection. 2001. Vol. 45(12). P. 801-811.). Перспективным объектом при скрининге новых продуцентов биосурфактантов являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие уникальными биологическими свойствами и широкими катаболическими способностями. В 2000 году на базе ИЭГМ УрО РАН в результате индуцированного биосинтеза на основе непатогенных актинобактерий Rhodococcus rubber, был получен биосурфактантный гликолипидный комплекс, проанализирована его химическая структура и сурфактантная активность (Куюкина М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение: диссертация … доктора био. наук. М.С Куюкина; Пермь. 2006. С. 295). Полученный гликолипидный комплекс является не токсичным и перспективным для исследования его биологических свойств.
Цель исследования
Оценка иммунорегуляторных эффектов гликолипидного биосурфактанта, выделенного из штамма Rhodococcus ruber Институт экологии и генетики микроорганизмов (ИЭГМ) 231, в системах in vitro и in vivo.
Задачи исследования
-
Исследовать влияние Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, интерлейкина-1 (IL-lp), интерлейкина-8 (IL-8) гранулоцитами периферической крови in vitro.
-
Оценить влияние Rhodococcus-биосурфактанта на пролиферативный ответ спленоцитов, продукцию интерлейкина-4 (TL-4), интерлейкина-2 (TL-2), интерлейкина-1, интерферона-у (TFN-y) in vivo.
3. Исследовать влияние Rhodococcus-биосурфактанта на антителогенез в селезенке,
продукцию активных форм кислорода и провоспалительных цитокинов клетками
перитонеальной полости при различных путях введения трегалолипида.
4. Оценить влияние доминирующей фракции Rhodococcus-биосурфактанта на
антителогенез в селезенке и продукцию активных форм кислорода клетками
перитонеальной полости при различных путях введения трегалолипида.
Методология и методы исследования
В ходе проведения научных исследований в системе in vitro была использована кровь 15 условно здоровых доноров в возрасте от 20 до 35. Все исследования проводились в соответствии с этическими нормами и с согласия доноров-добровольцев. Исследования осуществлялись на нефракционированной клеточной суспензии, а также на отдельных
клеточных фракциях. Rhodococcus-биосурфактат вносили в культуры в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 мкг/мл. Оценку кислородзависимой микробицидной активности лейкоцитов и гранулоцитов проводили методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Для индукции респираторного взрыва использовали опсонизированный зимозан в концентрации 15 и 150 мкг/мл. Уровень секреции IL-lp и IL-8 гранулоцитами периферической крови в супернатантах 24 ч культур определяли твердофазным иммуноферментным анализом с помощью наборов Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ и Интерлейкин-1 бета-ИФА-БЕСТ (АО «Вектор-Бест», Новосибирск).
Экспериментальные исследования in vivo выполнены на 632 белых нелинейных беспородных мышах-самцах массой 20±2 г. в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов (Страсбург, 1986). Исследуемый трегалолипид вводили животным двумя способами: внутрибрюшинно и внутримышечно в дозах 25, 50, 100 мг/кг. Для оценки пролиферативной и секреторной активности спленоцитов и перитонеальных лейкоцитов через 1 час после введения гликолипида животных выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Пролиферативную активность спленоцитов оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов по интенсивности включения радиоактивного 3Н-тимидина. Определение концентрации цитокинов спленоцитами и перитонеальными клетками мыши проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, США). Продукция активных форм кислорода (АФК) оценивалась методом ЛЗХЛ. Для оценки выраженности гуморального иммунного ответа через 1 час после введения гликолипида животных иммунизировали эритроцитами барана внутрибрюшинно (108 клеток/0,2 мл 0,09% NaCl), на пятые сутки животных выводили из эксперимента. Для определение количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке использовали метод гемолиза в геле агарозы по Jerne.
Статистический анализ данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного LSD-критерия Фишера для post-hoc сравнения, а также t-критерия Стьюдента.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы исследования обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным объемом выборки, использованием современных лабораторных методов, применением компьютерных программ статистического анализа полученных данных. Экспериментальная часть работы выполнена на сертифицированном лабораторном оборудовании. Все вышеперечисленное подтверждает достоверность полученных результатов.
Основные положения работы были доложены и обсуждались на ХIII Всероссийской молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2014 г.), на VII Всероссийском Конгрессе молодых биологов. «Симбиоз-Росси» 2014» (Екатеринбург, 2014 г.) и на II Всероссийской школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» в рамках Пермского научного форума (Пермь, 2015 г.).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы, постановка проблемы и подготовка статей проводились совместно с научными руководителями. Анализ отечественной и зарубежной научной литературы, статистическая обработка полученных данных с описанием результатов, их интерпретацией и систематизацией, написание и оформление рукописи диссертации выполнялись лично автором под контролем научных руководителей. Практическая лабораторная часть, включающая иммунологические, микробиологические и аналитические исследования, выполнены автором лично и при участии научных сотрудников «Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральское отделение Российской академии наук».
Положения, выносимые на защиту
-
В системе in vitro Rhodococcus-биосурфактант усиливает продукцию интерлейкина-lp и интерлейкина-8 не стимулированными гранулоцитами периферической крови. Изменения продукции свободных радикалов гранулоцитами под воздействием Rhodococcus-биосурфактанта носили разнонаправленный характер, зависящий от степени активации клеток.
-
В системе in vivo гликолипидный биосурфактантный комплекс актинобактерий штамма Rhodococcus ruber Институт экологии и генетики микроорганизмов 231 оказывал угнетающее влияние на врожденный и приобретенный иммунитет при разных способах введения.
-
Доминирующей фракцией Rhodococcus-биосурфактанта явилась моноацилтрегалоза, которая оказывала угнетающее действие на антителогенез и продукцию активных форм кислорода независимо от пути введения.
Научная новизна
В работе впервые показаны существенные различия в направленности иммунорегуляторного действия Rhodococcus-биосурфактанта в системах in vivo и in vitro. Показано, что в системе in vitro Rhodococcus-биосурфактант оказывал стимулирующий эффект на продукцию активных форм кислорода в спонтанных культурах лейкоцитов и
гранулоцитов, а также усиливал продукцию IL-ip и IL-8 не активированными
гранулоцитами. В зимозан-индуцированных культурах гликолипидный
биосурфактантный комплекс не влиял на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами, не изменял динамики продукции IL-lp и IL-8 гранулоцитами. Изменения продукции свободных радикалов гранулоцитами под воздействием Rhodococcus-биосурфактанта носили разнонаправленный характер, зависящий от концентрации опсонизированного зимозана. Впервые установлено, что в системе in vivo Rhodococcus-биосурфактант независимо от пути введения угнетал функциональную активность клеток иммунной системы, включая антителогенез, продукцию АФК и продукцию цитокинов. Впервые установлено, что основной эффект in vivo оказывает доминирующая фракция биосурфактанта, по химической структуре представляющая собой моноацилтрегалозу.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Результаты работы расширяют существующие представления о роли гликолипидов микробного происхождения в регуляции функций клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Полученные данные позволяют утверждать, что гликолипидный биосурфактантный комплекс Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 является перспективной основой для создания лекарственного препарата с иммуномодулирующей активностью. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе для студентов биологических факультетов, а так же медицинских и фармацевтических ВУЗов.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работ внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного национального исследовательского университета (теоретический курс "Иммунология репродукции и иммунотерапия") (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15).
Конкурсная поддержка исследования
Диссертационная работа была выполнена в лаборатории биохимии и развития микроорганизмов «ИЭГМ УрО РАН», поддержана грантом Программы поддержки ведущих научных школ (НШ-5589.2012.4), Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052) и Госзаданием 6.3330.2017/4.6.
Публикации
Соискатель имеет 10 опубликованных научных работ, из них по теме диссертации опубликовано 10 научных работ, общим объемом 1,3 печатных листа, в том числе 5 публикаций в научных журналах и изданиях для опубликования основных научных результатов диссертации, из них 4 работы включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий и 1 публикация в издании, входящем в базу
Scopus, 5 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных съездов, конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации
Рецепторы гликолипидных биосурфактантов
Паттерн-распознающие рецепторы (PRRs) играют важную роль во врожденном иммунитете. Они способны к распознаванию специфических молекулярных структур, таких как: самоассоциированные молекулярные образцы (SAMPs), молекулярные образцы, ассоциированные с повреждениями (DAMPs), микробные молекулярные образцы (MAMPs) и патоген-ассоциированные образцы (PAMPs) [163]. К группе PRRs относятся Толл-подобные рецепторы (TLRs), внутриклеточные нуклеотид связывающие NOD-подобные рецепторы (NLRs), RIG-I-подобные рецепторы и лектиновые рецепторы С-типа (CLRs) [8, 82]. Одновременный запуск нескольких PRRs вызывает активацию внутриклеточного каскада реакций, приводящих к различным врожденным иммунным ответам, необходимым для формирования эффективного адаптивного иммунного ответа [54].
CLRs представляют большое семейство консервативных рецепторов позвоночных животных, которые связывают остатки углеводов [191]. Они распознают различные классы эндогенных и экзогенных патогенов, таких как грибы, бактерии и паразиты [83].
Макрофагальный индуцибельный С-типа лектин (Mincle или CLEC4e, Clecsf9) и макрофагальный лектин С-типа (MCL или CLEC4d, ClecSf8) являются рецепторами «корд-фактора» (TДM, трегалоза-6,6 -димиколат), представляющего собой уникальный гликолипид, входящий в клеточную стенку Micobacterium tuberculosis [52]. Данные рецепторы относятся к отдельной группе лектинов С-типа, т. к. для осуществления связывания лиганда в углевод распознающем домене им необходимо присутствие ионов Ca2+ [191].
Mincle-рецептор
Впервые рецептор Mincle был идентифицирован M. Matsumoto и соавторами (1999) как белок, который экспрессируется в ответ на стимуляцию липополисахаридом (ЛПС) и некоторыми провоспалительными цитокинами, такими как IFN-, IL-6, и TNF- [114]. Он относится ко II типу трансмембранных лектиновых рецепторов С-типа, которые экспрессируются у человека и грызунов на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах, дендритных клетках и некоторых субпопуляциях В-лимфоцитов при их стимуляции [81, 101, 114, 185]. У морских свинок Mincle также присутствует на клетках лимфоузлов, селезенки и перитонеальных макрофагах [173].
Структурно Mincle состоит из внеклеточной части, которая несет углевод-распознающий домен (CRD), отделенный от мембраны короткой ножкой, а также трансмембранный участок и короткий цитоплазматический хвост, не имеющий сигнальной последовательности (рисунок 3) [114]. В своем трансмембранном участке Mincle содержит положительно заряженный аргинин, который опосредует взаимодействие рецептора с иммунорецепторной тирозиновой активирующей последовательностью (ITAM) Fc рецептора -цепи (FcR), тем самым осуществляя передачу сигнала внутрь клетки [185]. Распознавание лиганда приводит к фосфорилированию ITAM и активации Syk, запуская каскад реакций через Card9-Bcl10-MALT1 высвобождая транскрипционный фактор NFB (рисунок 5) [87].
Детальные исследования лигандов Mincle показали, что CLEC4e связывает гликолипиды, выделенные из M. tuberculosis, такие как трегалоза димиколат, трегалозо-мономиколат и глицерол-мономиколат (ГлиММ) [67, 73]. Однако ГлиММ приводит к меньшей активации Mincle и распознается избирательно только человеческим рецептором, но не мышиным [67]. Кроме того, лигандом Mincle является и синтетический аналог ТДМ – трегалозо дибегенат (ТДБ) [45]. Также Mincle способен распознавать целый ряд грибных патогенов, включая Candida albicans и нестандартные глицерогликолипиды гриба Malassezia [29, 181, 184].
Взаимодействие лигандов с человеческим или мышиным CRD-доменом Mincle осуществляется благодаря наличию консервативной для лектинов последовательности: глутаминовая кислота-пролин-аспарагин (EPN, остатки 169-171), которая является также необходимой для связывания с ТДМ [73]. N. D. S. Rambaruth с соавторами (2015) были проведены сравнительные исследования биохимических характеристик связывания ТДМ с мышиными, человеческими и коровьими углевод-распознающими доменами рецептора Mincle [145]. Результаты показали сохранение способности к распознаванию гликолипида у Mincle различного происхождения, что свидетельствует о возможности проведения исследований данного рецептора на различных объектах и интерпретации полученных данных на человека при построении экспериментов на животных.
Понимание механизмов распознавания углеводов рецептором Mincle было получено с помощью комплекса бычьего рецептора Mincle с ТДМ. В этом комплексе, один из двух остатков глюкозы, входящий в состав ТДМ, распознается первичным углевод-связывающим сайтом. Он состоит из 5 аминокислотных остатков, связанных с ионом Ca2+, 4 из которых (Glu-176, Asn-192, Glu-168 и Asn-170) образуют водородные связи с 3ей и 4ой ОН-группами глюкозы, также взаимодействующими с ионом Ca2+. Второй остаток глюкозы связывается с вторичным углевод-связывающим сайтом, в котором Glu-135 и Arg-182 формируют водородные связи со 2ой OH группой остатка глюкозы [45]. Вблизи первичного углевод-связывающего сайта располагается небольшой участок, состоящий из гидрофобных аминокислот, отсутствующий у большинства классических доменов С-типа. Он вмещает в себя ацильные цепи, присоединяющиеся к 6ой ОН-группе остатка глюкозы, в первичном сайте связывания [46] (рисунок 4). Авторами показано, что достаточно одной ацильной цепи для связывания с Mincle, однако, обязательным условием является длина липидного фрагмента, которая должна быть не менее 10 углеродных остатков (С10). Эти сайты могут вмещать разветвленные ацильные цепи миколовых кислот, содержащиеся в ТДМ и ТММ [46].
Как и некоторые другие представители CLRs, Mincle способен распознавать DAMPs. Поврежденные и мертвые клетки высвобождают белок, ассоциированный со сплайсосомой 130 (SAP 130), который передает внутриклеточный сигнал, связываясь с внедоменной частью рецептора [185]. Также Mincle связывает кристаллизованные кристаллы холестерина, которые присутствуют в пределах атеросклеротических бляшек при гиперхолестеринемии [89].
MCL-рецепотр
Более 15 лет назад во время создания библиотеки мышиных макрофагальных генов был идентифицирован рецептор MCL, состоящий из 219 аминокислотных остатков [16]. MCL, как и Mincle, является С лектиновым рецептором II типа, имеющий сходную структурную организацию: один распознающий домен на ножке и трансмембранный участок с коротким цитоплазматическим хвостом [13]. Данный рецептор также требует присутствие другого рецептора – FcR для осуществления передачи сигнала внутрь клетки через сигнальный путь Syk/CARD9 [117]. Однако природа взаимодействия с адаптерным белком не достаточно ясна, так как MCL не содержит необходимого остатка аргинина в трансмембранном участке для ассоциации с ITAM, тем самым ставя под вопрос непосредственную связь с FcR [149]. A. Lobato-Pascual (2013) предположил, что MCL и Mincle ковалентно образуют гетеродимер, в котором Mincle выступает в роли мостика между рецептором MCL и белком FcR (рисунок 5). Возможность такой связи доказывают данные о прямо пропорциональной зависимости экспрессии этих двух рецепторов, полученные в спонтанных и ЛПС-стимулированных культурах перитонеальных макрофагов крысы [108].
Влияние Rhоdococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, IL-1, IL-8 лейкоцитами и гранулоцитами периферической крови in vitro
Гранулоциты играют важную роль в не специфическом иммунном ответе благодаря их способности к фагоцитозу. В ответ на проникновение в организм чужеродных микроорганизмов они генерируют бактерицидные факторы, так, например, кислородные метаболиты. К основным активным формам кислорода относятся: супероксиданион, гидроксильный радикал, перекись водорода, синглетный кислород. Помимо этого при участии миелопероксидазы с актвными формами кислорода образуется гипохлорит.
При контакте с бактерией они вызывают серьезные разрушения бактериальных клеточных структур и нарушение естественного метаболизма, тем самым приводя их к гибели. По данным литературы, рецепторы к гликолипидам (С-типа лектиновые рецепторы MCL и Mincle, а так же TLR2) экспрессируются на клетках миелоидного ряда, в том числе на гранулоцитах [46, 101]. Показано, что экспрессия рецептора MCL является конститутивной, в то время как выраженность Mincle значительно увеличивается в присутствии индуктора [84]. Таким образом, глколипиды могут существенно модулировать функциональныую активность гранулоцитов.
В результате проведенных исследований было установлено, что Rhodococcus-биосурфактант ИЭГМ 231 в концентрации 100 мкг/мл оказывал статистически значимое влияние на спонтанную продукцию активных форм кислорода гранулоцитами периферической крови, усиливая ее втечение всего временного промежутка наблюдений (таблица 3).
При одномоментном добавлении к гранулоцитам Rhodococcus-биосурфактанта и опсонизированного зимозана в концентрации 15 мкг/мл, трегалолипид в концентрации 0,1 мкг/мл статистически значимо угнетал продукцию активных форм кислорода на протяжении всего периода наблюдения, а в концентрации 10 мкг/мл – с 30-ой по 60-ую мин эксперимента. Концентрации Rhodococcus-биосурфактанта 1 и 100 мкг/мл не оказали выраженного модулирующего влияния на исследуемый показатель (таблица 3).
Совершенно другая картина наблюдалась в суспензии гранулоцитов в присутствии биосурфактанта и опсонизированного зимозана в концентрации 150 мкг/мл. В культурах с Rhodococcus-биосурфактантом, в концентрации 100 мкг/мл, значительно усиливалась генерация гранулоцитами кислородных метаболитов на всем временном интервале наблюдений. Следует отметить, что пиковые значения ЛЗХЛ, регистрируемые для гранулоцитов, стимулированных одновременно двумя микробными продуктами, в три раза превышали соответствующие значения для культур, стимулированных только Rhodococcus-биосурфактантом или только опсонизированный зимозан (таблица 3).
Оценка влияния гликолипидного биосурфактантного комплекса на продукцию активных форм кислорода проводилась и в лейкоцитарной фракции, где нейтрофилы составляют в среднем 60% от клеточного состава. Было установлено, что Rhodococcus-биосурфактант в концентрации 100 мкг/мл проявлял стимулирующий эффект на продукцию кислород-зависимых радикалов в спонтанных культурах лейкоцитов с 20-ой по 60-ую минуту регистрации (таблица 4). При внесении в культуры зимозана в концентрации 15 мкг/мл статистически значимого влияния Rhodococcus-биосурфактанта на динамику респираторного взрыва в культурах лейкоцитов зарегистрировано не было. Аналогичный результат был получен и при внесении опсонизированного зимозана 150 мкг/мл (таблица 4). В дальнейшем нами было исследовано влияние гликолипидного биосурфактантного комплекса актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 в системе in vitro на продукцию цитокинов IL-1 и IL-8 гранулоцитами периферической крови.
Установлено, что в спонтанных культурах гранулоцитов трегалолипидный комплекс статистически значимо увеличивал продукцию цитокина IL-1 (F=11,36, р=0,0001) в концентрациях 10 и 100 мкг/мл (рисунок 14, А). Однако при добавлении в клеточные культуры стимулятора (ОЗ в концентрации 150 мкг/мл) Rhodococcus-биосурфактант не влиял на продукцию исследуемого цитокина.
Как видно из рисунка 14, Б гликолипидный комплекс оказывал существенное влияние на повышение уровня активации цитокина IL-8 в спонтанных культурах гранулоцитов (F=3,326, р=0,043) в концентрациях 10 и 100 мкг/мл. При дополнительном внесении активатора культур статистически значимых эффектов влияния биосурфактанта на изменение экспрессии цитокина не наблюдалось.
Таким образом, Rhodococcus-биосурфактант оказывал стимулирующий эффект на продукцию активных форм кислорода в спонтанных культурах лейкоцитов и гранулоцитов. В зимозан-индуцированных культурах гликолипидный биосурфактантный комплекс не влиял на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами. Изменения продукции свободных радикалов гранулоцитами под воздействием Rhodococcus-биосурфактанта носили разнонаправленный характер, зависящий от концентрации зимозана. Продукцию провоспалительных цитокинов в не стимулированных культурах исследуемый биосурфактантный комплекс так же усиливал. Ранее было показано, что Rhodococcus-биосурфактант активировал продукцию IL-1 в нефракционированной лейкоцитарной взвеси [55], что говорит о его стимулирующем влиянии на функциональную активность гранулоцитов in vitro.
Влияние Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода, про- и противовоспалительных цитокинов перитонеальными лейкоцитами, а также антителогенез в селезенке при различных способах введения гликолипида
Ранее проведенные исследования иммуномодулирующей активности гликолипида актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 в системе in vitro показали, что Rhodococcus-биосурфактант способен регулировать функции клеток врожденного иммунитета in vitro. Биосурфактант активировал продукцию провоспалительных цитокинов IL-12, IL-18, IL-1, TNF- моноцитами периферической крови, а также продукцию IL-8 нейтрофилами, но не влиял на уровень секреции противовоспалительного цитокина IL-10 [6]. Изучение Rhodococcus-биосурфактанта в системе in vitro как во фракции человеческих нейтрофильных гранулоцитов, так и в лейкоцитарной взвеси, показали дозозависимое стимулирующее влияние гликолипида на динамику респираторного взрыва. Однако совершенно иные результаты были получены при исследованиях биосурфактанта в системе in vivo.
Установлено, что при внутрибрюшинном введении гликолипида Rhodococcus-биосурфактант оказывал статистически значимый угнетающий эффект как в спонтанных, так и в стимулированных опсонизированным зимозаном 150 мкг/мл культурах перитонеальных клеток. В культурах, при отсутствии индуктора, Rhodococcus-биосурфактант в дозе 25 и 100 мг/кг оказывал статистически значимое угнетающее действие на количество реактивных форм кислорода в течение первых 35 и 10 мин от начала наблюдений соответственно (таблица 5). Угнетение на протяжении всего времени регистрации результатов в стимулированных культурах перитонеальных клеток оказывала доза Rhodococcus-биосурфактанта 25 мг/кг. При введении мышам гликолипида в дозе 50 мг/кг был зарегистрирован угнетающий эффект на продукцию АФК от начала и до 30 минуты наблюдений. Аналогичное по продолжительности и эффекту влияние было зафиксировано и при использовании Rhodococcus-биосурфактанта в максимальной дозировке 100 мг/ кг (таблица 5).
При внутримышечном введении Rhodococcus-биосурфактант не оказывал модулирующего эффекта на динамику кислородного взрыва в спонтанных культурах мышиных перитонеальных лейкоцитов (таблица 6). Однако на протяжении всего периода наблюдений Rhodococcus-биосурфактант сильно подавлял продукцию активных форм кислорода во всем диапазоне исследуемых доз в активированных зимозаном культурах (таблица 6). Таким образом, Rhodococcus-биосурфактант оказывает угнетающее влияние на динамику респираторного взрыва in vivo независимо от способа введения.
Оценку продукции цитокинов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Было установлено, что при внутрибрюшинном введении гликолипид не оказывал влияния на секрецию IL-1 как в спонтанных (F=1,147, р=0,357), так и в стимулированных (F=1,221, р=0,331) культурах перитонеальных клеток (рисунок 21, А). Обнаружено статистически значимое угнетение уровня продукции TNF- во всем диапазоне исследуемых доз в культурах как с внесением опсонизированного зимозана (F=4,536, р=0,011), так и без индуктора (F=3,491, р=0,027) (рисунок 21, Б). Максимальное снижение было зарегистрировано при введении Rhodococcus-биосурфактанта в наивысшей дозе – 100 мг/кг. Секреция IL-10 была снижена в стимулированных культурах перитонеальных лейкоцитов при введении исследуемого гликолипида в дозах 25, 50 и 100 мг/кг (рисунок 21, В).
В условиях внутримышечного введения гликолипид не оказывал иммуномодулирующего эффекта на продукцию IL-1 и TNF- в спонтанных культурах перитонеальных клеток брюшной полости (F=0,318, р=0,813 и F=0,287, р=0,834 соответственно) (рисунок 22). Однако оказывал выраженный угнетающий эффект (F=3,975, р=0,020) на уровень IL-1 в стимулированных культурах в дозе 25 мг/кг (рисунок 22, А). На секрецию TNF- в стимулированных культурах биосурфактант не влиял (F=1,794, р=0,169) (рисунок 22, Б).
Таким образом, биосурфактантный комплекс оказывал статистически значимый подавляющий эффект на продукцию TNF- и IL-10 перитонеальными лейкоцитами при внутрибрюшинном введении и угнетал секрецию IL-1 при введении в лапу.
Исходя из полученных результатов, в дальнейшем мы оценили влияние различных путей введения биосурфактанта на гуморальное звено иммунитета. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали по числу антителообразующих клеток в селезенке. Установлено, что при внутрибрюшинном введении гликолипидного биосурфактанта в дозах 50 и 100 мг/кг он оказывал статистически значимое угнетающее влияние (F=5,228; р=0,004) на количество антителообразующих клеток в селезенке по относительным показателям (рисунок 23, А). При оценке изменений абсолютного числа АОК статистически значимого влияния (F=1,852; р=0,152) гликолипидного биосурфактанта обнаружено не было (рисунок 23, Б). Число ядросодержащих клеток селезенки под воздействием Rhodococcus-биосурфактанта также статистически значимо не изменялось, но при этом наблюдалась тенденция к повышению динамики клеточности органа при введении гликолипида в дозах 50 и 100 мг/кг (рисунок 23, В).
В связи с возможностью непосредственного влияния на перитонеальные макрофагальные клетки при внутрибрюшинном введении Rhodococcus-биосурфактанта был поставлен эксперимент, исключающий данное воздействие путем всасывания гликолипида в кровь при введении исследуемого биосурфактанта внутримышечно (правая задняя лапа). Установлено, что Rhodococcus-биосурфактант оказывал статистически значимый эффект на угнетение антителогенеза путем снижения количества АОК во всех трех дозах в расчете как на миллион (F=7,627; р=0,000), так и на весь орган (F=5,959; р=0,002) (рисунок 24, А,Б). Как и при внутрибрюшинном введении биосурфактанта наблюдалось тенденция к увеличению количества ядросодержащих клеток в селезенке (рисунок 24, В). Делая вывод из выше приведенных данных, биосурфактант Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 оказывал угнетающий эффект на относительное и абсолютное количество антителопродуцентов в селезенке. На продукцию про- и противовоспалительных цитокинов Rhodococcus-биосурфактант также оказывал угнетающее влияние.
Таким образом, гиколипидный биосурфактантный комплекс актинобактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 оказывал угнетающее влияние на врожденный и приобретенный иммунитет при разных способах введения Rhodococcus-биосурфактанта в системе in vivo. Было зарегистрировано снижение продукции активных форм кислорода перитонеальными макрофагами, как при внутрибрюшинном, так и при внутримышечном введении гликолипида. Отрицательная динамика наблюдалась и в изменении
Влияние доминирующей фракции Rhodococcus-биосурфактанта на продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши, а также антителогенз в селезенке при различных способах введения гликолипида
Гликолипидный биосурфактантный комплекс Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 имеет в своем составе 3 компонента, из которых доминирующим является моноацилтрегалоза. Данная фракция составляет 50,5% от всего комплекса, молекулы которых содержат одну жиронокислотную цепочку (С12-16) с насыщенными и ненасыщенными связями. Еще два компонента, трегалозодимиколат и диацилтрегалоза, составляют 24,2% и 25,3 % соответственно от массы гликолипида. В связи с высоким процентом содержания моноацилтрегалозы в биосурфактантном комплексе, было проведено фракционирование микробного гликолипида с последующим исследованием иммунорегуляторных свойств доминирующей фракции. Как и в предыдущих исследованиях, эксперименты были проведены in vivo на беспородных самцах белых мышей и в двух вариантах введения Rhodococcus-биосурфактанта: внутрибрюшинном и внутримышечном (введение в лапу). Оценка функциональной активности врожденного иммунитета, а именно уровень респираторного взрыва перитонеальных лейкоцитов, проводилась при помощи реакции люминолзависимой хемилюминесценции. Для оценки гуморального иммунитета использовали метод постановки антителообразующих в геле агарозы.
Установлено, что при внутрибрюшинном введении фракции биосурфактанта в дозе 100 мг/кг исследуемый трегалозолипид оказывал статистически значимое угнетение выраженности респираторного взрыва перитонеальными клетками мыши, как в спонтанных, так и в стимулированных зимозаном 150 мкг/мл культурах клеток. Так, в стимулированных культурах угнетение было зафиксировано на протяжении всего времени регистрации данных, в то время как в спонтанных статистически значимое угнетение было зафиксировано в диапазонах с 10-20, 30-35, на 45 и с 55-60 мин наблюдения (таблица 7).
При внутримышечном введении фракции Rhodococcus ruber в спонтанных культурах перитонеальных лейкоцитов нами была зафиксирована лишь тенденция к угнетению продукции активных форм кислорода. В зимозан-стимулированных перитонеальных клетках Rhodococcus-биосурфактант оказывал выраженный угнетающий эффект на уровень респираторного взрыва с 10-60 мин наблюдения (таблица 8). Таким образом, биосурфактант Rhodococcus ruber оказывал угнетающее действие на продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши независимо от присутствия индуктора и способа введения Rhodococcus-биосурфактанта.
Данные о влиянии доминирующей фракции биосурфактанта на абсолютное и относительное количество антителообразующих клеток в условиях внутрибрюшинной иммунизации Т-зависимым антигеном представлены на рисунке 25. Как видно из представленных данных, внутрибрюшинное введение фракции биосурфактанта Rhodococcus ruber в дозе 100 мг/кг, оказывало угнетающее действие на абсолютное и относительное количество антителообразующих клеток в селезенке.
Количество ядросодержащих клеток в органе под действием моноацилтрегалозы статистически значимо угнеталось.
При внутримышечном введении Rhodococcus-биосурфактанта был зафиксирован аналогичный угнетающий эффект. Как видно из рисунка 25 при введении Rhodococcus-биосурфактанта количество антителообразующих клеток в селезенке статистически значимо снижалось по абсолютным и относительным показателям. Так же было зафиксировано снижение количества ядросодержащих клеток в органе.
Таким образом, фракция биосурфактанта Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 оказывала угнетающее влияние на количество антителообразующих и ядросодержащих клеток селезенки не зависимо от способа введения Rhodococcus-биосурфактанта.
В целом, результаты, полученные при исследовании доминирующей фракции гликолипида, показали аналогичное влияние на выраженность респираторного взрыва перитонеальных лейкоцитов и антителогенз клеток селезенки мыши, как и при исследовании всего комплекса. Таким образом, можно предположить, что именно моноацилтрегалоза определяет иммунорегуляторные свойства биосурфактанта.