Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы (современные представления о механизмах формирования перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных) 11
1.1. Особенности развития плода при беременности, осложнённой плацентарной недостаточностью 11
1.2. Патогенез перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных детей 17
1.3. Роль иммунной системы в патогенезе перинатального поражения ЦНС .
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 33
2.1. Общая характеристика материала 33
2.2. Методы исследования
2.2.1. Инструментальные методы исследования 47
2.2.2. Лабораторные методы обследования 49
2.2.3. Методы статистического анализа 50
Глава III. Результаты собственных исследований 52
3.1. Особенности фетальной гемодинамики в исследуемых группах 52
3.2. Особенности цитокинового статуса у беременных с плацентарной недостаточностью 56
3.3. Особенности цитокинового статуса и содержание нейроспецифических белков в околоплодных водах беременных с плацентарной недостаточностью 66
3.4. Характеристика исходов беременности 75
3.5. Оценка состояния новорожденных в исследуемых группах 3.6. Оценка газового состава пуповинной крови 82
3.7. Особенности цитокинового статуса и содержание нейроспецифических белков в пуповинной крови новорожденных 87
3.8. Корреляционные взаимосвязи между изучаемыми показателями в исследуемых группах 97
Обсуждение 103
Выводы 125
Практические рекомендации 126
Список литературы 1
- Патогенез перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных детей
- Роль иммунной системы в патогенезе перинатального поражения ЦНС
- Лабораторные методы обследования
- Особенности цитокинового статуса и содержание нейроспецифических белков в околоплодных водах беременных с плацентарной недостаточностью
Патогенез перинатального гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных детей
Многолетние исследования показывают, что здоровье новорожденного ребенка в значительной степени определяется течением антенатального периода (Цинзерлинг В.А., Мельникова В.Ф., 2002; Колобов А. В., Соколов Д. И. с соавт., 2008) . Несмотря на ряд значительных достижений акушерства и перинатологии, основными из которых являются снижение материнской и перинатальной заболеваемости и смертности, отмечена тенденция к увеличению числа врожденных заболеваний, детерминированных морфофункциональными нарушениями в фетоплацентарной системе, прежде всего у матерей с отягощенным акушерско-гинекологическим и соматическим анамнезом, а также осложненным течением беременности (Стрижаков А.Н., Макацария А.Д., с соавт, 2007).
Прогресс в современной перинатологии привел к необходимости решения новых проблем, связанных с гестационным процессом и антенатальной охраной плода (Радзинский В.Е., Смалько П.Я., 2002). Среди них ведущее значение принадлежит хронической плацентарной недостаточности, которая, будучи частым осложнением беременности (от 14 до 22%), сопровождается гипоксией, задержкой внутриутробного роста плода и является одной из наиболее частых причин перинатальной заболеваемости (до 60%) и смертности (Кулаков В.И., Орджоникидзе Н.В. с соавт., 2004; Рыбин М. В., 2007; Neerhof M.G., Thaete L.G. , 2008).
Проблема плацентарной недостаточности не теряет своей актуальности, а коррекция данного осложнения гестации продолжает оставаться одним из приоритетных направлений в современном акушерстве (Сидорова И.С., Макаров И.О., 2000; Тютюнник В.Л., 2002; Горбунов А.В., 2003; Румянцев А.Г. с соавт., 2003; Стрижаков В.Н. с соавт., 2003; Кулаков В.И. с соавт., 2004; Краснопольский В.И., 2008; Филиппов О.С, 2009; Найфонова А. Н., 2012; Lockwood C.J., 2002; Loeliger М. et al., 2003).
В последнее время наблюдается достоверное возрастание частоты и тяжести хронической плацентарной недостаточности, которая во многом определяет состояние новорожденного, являясь одной из наиболее частых причин поражения головного мозга плода (Стрижаков А.Н. с соавт., 2003; Евсюкова И.И., 2004; Линева О.И., Цуркан С. В., 2004; Башмакова Е.Н. с соавт., 2008). При всем многообразии патогенетических механизмов осложнений беременности реализация их происходит через нарушение нормального функционирования фетоплацентарного комплекса (ФПК). Его деятельность осуществляется благодаря взаимодействию материнских, плодовых и плацентарных факторов. Плацента, выполняет в отношении плода функцию легких, выделительную функцию и целый ряд других многообразных функций (Краснопольский В.И., 2007; Salafia СМ., 2011). Благодаря этому обеспечивается избирательный переход различных веществ из крови матери в кровь плода и в обратном направлении. Во многих органах кровообращение выполняет лишь трофическую функцию, способствующую их деятельности. Однако в матке, особенно в материнской части плаценты, кровообращение является неотъемлемой частью плацентарных функций и в то же время функцией материнского организма. Только при достаточной интенсивности маточно-плацентарного кровообращения трансплацентарный обмен веществ может быть адекватным потребностям плода (Волкова Е.В., 2003; Стрижаков А.Н., 2003; Агеева М.И., 2006; Краснопольский В.И., 2008). При возникновении у беременной той или иной формы патологии в ранние сроки беременности, формируется плацентарная недостаточность. (Стрижаков А.Н., Мусаев З.М. с соавт., 2003). Плацентарная недостаточность — клинический синдром, состоящий из комплекса нарушений трофической, эндокринной и метаболической функции плаценты, ведущих к развитию неспособности поддерживать адекватный и достаточный обмен между организмом матери и плода (Мурашко Л.Е., 2003; Филиппов О.С., 2009; Клементе А.Х., 2011).
Проявления этих нарушений обусловлены морфофункциональными изменениями в плаценте и нарушением ее компенсаторно-приспособительных возможностей. В развитии этого синдрома можно выделить два основных пути формирования плацентарной недостаточности, которые могут существовать самостоятельно или сочетаться друг с другом: трофическая недостаточность, при которой нарушается всасывание и усвоение питательных продуктов, а также синтез собственных продуктов обмена веществ плода: дыхательная недостаточность, проявляющаяся в нарушении транспорта кислорода и углекислого газа (Мурашко Л.Е., 2003).
Причинами плацентарной недостаточности могут быть нарушения созревания и формирования плаценты у женщин с патологией эндометрия, гормональные нарушения, аборты и привычным невынашивание беременности в анамнезе. В возникновении плацентарной дисфункции большое значение имеют преэклампсия, угроза прерывания беременности, изосерологическая несовместимость крови матери и плода, генитальныи инфантилизм, а также различная экстрагенитальная патология (дисфункция коры надпочечников, сахарный диабет, тиреотоксикоз и др.). В связи с этим наблюдается комплекс нарушений транспортной, трофической, эндокринной и метаболической функции плаценты, лежащих в основе патологии плода и новорожденного (Аржанова О.Н. с соавт., 2006).
Плацентарная недостаточность включена в Международную, статистическую классификацию болезней, травм и причин смерти как основной диагноз патологического состояния плода и новорожденного (IX пересмотр, шифр 762.2). Уже сам термин содержит вопрос, поскольку не уточняет ее причину и следствие, не всегда отображает суть изменений в фетоплацентарном комплексе. Плацентарная недостаточность приводит не только к увеличению перинатальной смертности: 20% случаев перинатальной смертности непосредственно связаны с патологией плаценты (Афанасьева Н.В., Стрижаков А.Н., 2004). Плацентарная недостаточность устанавливается у каждой второй беременной с угрозой преждевременных родов, у каждой третьей при переношенной беременности и у каждой четвертой при развитии позднего гестоза.
В основе синдрома плацентарной недостаточности лежит нарушение компесаторно-приспособительных механизмов в фетоплацентарном комплексе (Казанцева Е.В., Белокриницкая Т.Е. с соавт., 2003; Белокриницкая Т.Е., Витковский Ю.А. с соавт., 2003).
Накоплено много данных о том, что возникновение и развитие плацентарной недостаточности может быть обусловлено нарушениями в маточно-плацентарном кровотоке, который зависит от многих анатомических и функциональных факторов, взаимосвязанных в системе мать-плацента-плод (Милованов А. П. с соавт., 1999; Стрижаков А.Н. с соавт., 2003; А.В.Орлов, 2006). К материнским факторам в первую очередь относятся экстрагенитальные заболевания, к фетальным - эмбрио - и фетопатии различного происхождения. Среди плацентарных факторов важную роль играет спазм сосудов, приводящий к морфологическим изменениям в интравиллозном пространстве и плацентарном барьере (Costa S.L. et al., 2008).
Роль иммунной системы в патогенезе перинатального поражения ЦНС
Определяли следующие параметры: кислотность крови (рН), парциальное давление углекислого газа (рС02), парциальное давление кислорода (р02), уровень бикарбонатов плазмы крови (НСОЗ), истинная буферная емкость крови (SBE), концентрация в крови общего С02 (tC02), концентрация в крови общего 02 (Ю2), насыщение кислородом крови (S02). Забор крови для исследования осуществляли в момент рождения ребенка, до отделения его от пуповины и до первого вдоха. Производилось наложение двух зажимов примерно посередине пуповины на расстоянии 10 см друг от друга. В этом участке пуповины (между зажимами) производили забор крови. Кровь из пуповинной артерии и вены набиралась в отдельные стеклянные 12 миллиметровые капилляры (от прибора ABL800), которые предварительно согревались до 36 и промывались раствором гепарина. Прокол вены и артерии производили раздельно тонкой инъекционной иглой, прикрепленной с помощью переходника к стеклянному капилляру, что позволяло крови пассивно заполнять капилляр. После наполнения капилляра кровью его герметично закрывали с обеих сторон резиновыми пробками. Данные манипуляции позволяли осуществлять раздельный забор крови из артерии и вены пуповины, соблюдая анаэробные условия и снижая до минимума контакт крови с кислородом воздуха.
Включали традиционно используемые исследования оценки состояния беременной (определение общего анализа крови и мочи, содержание общего белка, глюкозы, мочевины, билирубина), Для выполнения поставленных задач исследования особое внимание уделялось иммунологическим методам исследования: определение цитокинов в сыворотке крови пациенток клинических групп, околоплодных водах, пуповинной крови проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Реакцию проводили согласно рекомендациям производителя. IL-1J3, IL-6, TNF-a, с использованием тест-систем фирмы Цитокин (С-Петербург, Россия), IL-4-, IFN-y. IL-12, TGF-J3 с использованием тест-систем Bender Medsistems (Австрия), неоптерина - с использованием тест-системы IBL (Германия). Определения концентрации нейропептидов - белка S 100(3 и основного белка миелина(ОБМ) в пуповинной крови и околоплодных водах проводили методом ИФА с использованием диагностических наборов "Sigma"(CIIIA) по прилагаемым протоколам.
Забор периферической крови у беременных производился в сроке 38-40 недель, забор околоплодных вод производился во время операции кесарева сечения и при родоразрешении через естественные родовые пути, пуповинной крови у новорожденных - при рождении, в объеме 3 мл в сухую центрифужную пробирку, затем кровь отстаивали 20 минут при комнатной температуре. Гуморальную фракцию крови получали стандартным методом скоростного центрифугирования при 1500 оборотов в минуту в течение 20 минут. Сыворотку отбирали в пробирки типа Ependorf и замораживали при -20 С. Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением 1420 Multilabel Counter УісІш(Финляндия).
Для формирования базы данных и при проведении статистического исследования эмпирических данных использовались возможности табличного процессора Excel 2003 и пакетов прикладных программ («Мегастат» и Statistica 6.0). При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для зависимых групп. Показатели описательной статистики представлены в виде выборочной средней и стандартного отклонения. Для анализа различия частот в двух независимых группах применялся точный критерий Фишера-Ирвина. Для оценки тесноты связи отдельных показателей использовался коэффициент корреляции по Спирмену (Реброва О.Ю., 2002). Для выявления значимых признаков соответствующих клиническим группам был применен метод «деревьев решений», позволяющий выявить следственную связь между признаками и получить точки раздела клинических групп (CutOff).
Лабораторные методы обследования
С момента формирования акушерства как научной клинической дисциплины основной проблемой остается оценка внутриутробного состояния плода.
Новой вехой в изучении гемо динамических процессов в маточно-плацентарной и фето-плацентарной системах, фетальной гемодинамики явилось применение доплерометрии. Больший интерес вызывает изучение кровотока в средней мозговой артерии плода (Кузнецов М.И. 2000; Баркова С.Н.,2001).
Для качественного анализа состояния кровотока основной акцент сделан на уголнезависимые показатели кровотока: систолодиастолическое отношение (СДО), индекс резистентности (ИР) и пульсационный индекс (ПИ).
Большинство авторов в силу простоты и доступности вычесления показателя отдают предпочтение определению систоло-диастолического отношения, поскольку имеются достоверные отличия данных показателей как при осложненном, так и неосложненном течении беременности (Gudmundsson S. et al, 2001).
В конце беременности, когда основные резервные защитно-адаптационные механизмы исчерпаны, неблагоприятные воздействия на систему «мать-плацента-плод» могут быть компенсированы лишь быстрым изменением гемодинамики плода, приводящим к ее централизации. Увеличение мозгового кровотока является проявлением компенсаторной централизации плодового кровообращения в условиях сниженной плацентарной перфузии с преимущественным кровоснабжением жизненно важных органов - головного мозга, миокарда, надпочечников (Habek D. et al, 2003; Harkness U.F. et al, 2004). Это возможно лишь при достоточном уровне адаптационных возможностей плода. Плоды, у которых к концу беременности все резервные возможности исчерпаны, не смогут адекватно отреагировать на быстро возникшее неблагоприятное воздействие, что, вероятно, проявится отсутствием каких либо гемодинамических реакций в организме плода или их парадоксальным характером (М.Ю.Гиляновский, 2005).
Проведение исследования начиналось с определения показателей кровотока плода накануне родов в средней мозговой артерии (СМА), пуповинной артерии (aUMb). Оценка гемодинамики плода в вышеуказанных сосудах производилась с помощью определения систоло- диастолического соотношения (СДО, S/D).
Анализируя показатели С ДО КСК СМА выявлено, что в 1а и lb подгруппах они были достоверно ниже, чем в контрольной группе (3,0±0,3; 3,4±0,3 против 4,0±0,3 соответственно р 0,05). Во Па и lib подгруппах достоверно значимых отличий СДО мозгового кровотока плода от контрольной группы не выявлено.
При анализе данных СДО КСК aUMb достоверно значимых различий между подгруппами не обнаружено. Таким образом, можно предположить, что снижение сосудистого сопротивления в СМА связано с развитием компенсаторных механизмов защиты головного мозга плода от гипоксемии.
Следующим этапом было проведение функциональной пробы с задержкой дыхания (И.И.Мирущенко,1990) с целью выяснения адаптационно-компенсаторных возможностей плода в исследуемых клинических группах. В связи с высокой вариабельностью диагностической эффективности доплерометрического исследования разработаны и применяются в перинатальной диагностике функциональные нагрузочные тесты. Использование функциональных тестов для изучения компенсаторно-приспособительных процессов в организме плода основано на том, что эти тесты моделируют повседневные реакции материнского организма, на которые в той или иной степени реагирует плод. Изменение качественного состава плацентарной крови, а также изменение интенсивности плацентарного кровотока воспринимается плодом. При проведении функциональной пробы с задержкой дыхания матери происходит изменение кровотока в средней мозговой артерии плода изменяется в зависимости от его резервных возможностей.
Оценка адаптационно-компенсаторных возможностей плода с учетом реакции фетального мозгового кровотока на пробу с задержкой дыхания имеет ряд преимуществ: возможность скрининга (продолжительность исследования 3-5 мин.), высокая диагностическая точность, простота интерпретации, возможность выбора метода и срока родоразрешения (Гиляновский М.Ю., Орлов А.В., 2005). После исследования кровотока в исходном состоянии беременной предлагают сделать выдох и задержать дыхание до непроизвольного вдоха. После окончания пробы вновь проводили исследование кровотока в изучаемых артериях (СМА, aUMb). Согласно данным литературы имеется три типа реакции фетального кровотока плода на нагрузочную пробу с задержкой дыхания (Гиляновский М.Ю., 2005). Первый тип характеризуется централизацией фетального кровотока в виде ответной реакции плода на пробу с задержкой дыхания, что доплерометрически проявляется в виде снижения СДО КСК СМА во время функциональной пробы с задержкой дыхания. Данная реакция СМА расценивается как дилятация. Второй тип реакции характеризуется снижением мозгового кровотока, что доплерометрически проявляется в виде повышения СДО КСК СМА во время функциональной пробы с задержкой дыхания. Данная реакция расценивается как спазм. Третий тип реакции СМА характеризуется отсутствием изменений фетального кровотока на пробу с задержкой дыхания, что доплерометрически проявляется в виде отсутствия изменений СДО КСК СМА после функциональной пробы с задержкой дыхания.
Особенности цитокинового статуса и содержание нейроспецифических белков в околоплодных водах беременных с плацентарной недостаточностью
При проведении корреляционного анализа в подгруппе 1а нами установлена обратная корреляционная зависимость IL-6 в сыворотке крови матери с показателями кровотока в СМА (R=-0,75, р 0,01). Кроме того, выявлена прямая корреляционная зависимость содержания TNF-a в сыворотке крови матери с показателями НСОЗ арт. (R=0,97,) и обратная с уровнем кровотока в CMA(R=-0,77, р 0,05), а также обратная корреляционная зависимость содержания неоптерина с уровнем кровотока в СМА (R=-0,65, р 0,04), в подгруппе lb установлена обратная корреляционная зависимость IL-6 в сыворотке крови матери с показателями кровотока в СМА (R=-0,81, р 0,05), что может свидетельствовать о влиянии провоспалительных цитокинов на изменение мозгового кровотока плода, нарушение перфузии головного мозга и согласуется с данными Т. D. Yanowitz(2002). В патогенезе нарушений мозговой гемодинамики плода ведущее место занимает хроническая внутриутробная гипоксия плода, обусловленная во всех случаях в нашем исследовании наличием плацентарной недостаточности.
Материнское воспаление способствует значительной восприимчивости плода к гипоксии-ишемии (Jacobsson В., Hagberg G., 2004). Цитокины, как медиаторы воспаления, играют важную роль как в нормальном функционировании развития ЦНС, так и в ответе мозга на различные варианты повреждения.
Последние данные показывают, что кроме клеток иммунной системы цитокины секретируется несколькими типами клеток ЦНС, в том числе микроглии, астроцитами и нейронами. Эти молекулы обеспечивают взаимосвязь между нервной, эндокринной и иммунной системами(Тауа1 V. , Kalra В. S., 2008). Биологические эффекты цитокинов, могут влиять на прогрессирование повреждения в мозге, включают стимуляцию продукции нервных медиаторов повреждения, таких как окись азота, вызывающую инфильтрацию лейкоцитов и экспрессию молекул адгезии, влияющую на повреждение олигодендроцитов. В незрелом мозге, провоспалительные цитокины могут привести к повреждению белого вещества мозга во время пренатального периода и способствуют прогрессивному повреждению нейронов при церебральной гипоксии-ишемии.
У женщин в подгруппах I а и lb и Па по сравнению с контрольной группой отмечается достоверное повышение содержания TNF-a, IL-6 в околоплодных водах (р 0,05), при этом показатели содержания S 100(3 в этих подгруппах также достоверно превышали таковые в контрольной группе(р 0,05). При проведении корреляционного анализа в 1а подгруппе установлена корреляционная связь между уровнем TNF-a в околоплодных
водах и S 100(3 (R=0,72, р 0,03). Повышение уровня TNF-a в среде,
окружающей эмбрион, может иметь существенное воздействие на развивающийся мозг приводить к нарушению проницаемости гематоэнцефалического барьера и появлению неврологической симптоматики в периоде новорожденности (Lehnardt S., 2010). В lb и Па подгруппе выявлена корреляционная зависимость между уровнем IL-6 в околоплодных водах и S 100(3 (R=0,72, р 0,03) и (R=0,62, р 0,05), соответственно.
IFN-y- основной цитокин, связанный с развитием демиелинизирующих процессов. Повышение уровня IFN-y в белом веществе мозга ведет к полному отсутствию миелина, кроме того, усиливает процессы апоптоза и некроза. Исследование содержания IFN-y выявило его достоверное повышение в околоплодных водах у женщин в подгруппе 1а по сравнению с контрольной группой (р 0,05). При проведении корреляционного анализа в 1а подгруппе установлена корреляционная связь между уровнем IFN-y в околоплодных водах и S100(3 (R=0,82, р 0,05). Значимой ассоциативной взаимосвязи между содержанием IFN-y и S 100(3 в остальных исследуемых подгруппах не отмечено. Это свидетельствует о нарушении взаимодействия между уровнем IFN-y и продукцией S 100(3 и может быть использовано в качестве диагностического теста для оценки риска ранней манифестации перинатального поражения ЦНС у новорожденных от матерей с ХПН.
В настоящее время установлено, что TGF-J3 играет важную роль в развитии плаценты и плода. Обладая иммуносупрессивными свойствами, TGF- (3 регулирует клеточный рост, адгезию и дифференцировку, угнетает активированные лимфокинами NK-клетки, провоспалительные цитокины. Содержание TGF-J3 было повышено в околоплодных водах в подгруппах беременных с ХПН, родивших детей с отсроченной манифестацией перинатального поражения ЦНС (ІЬДІа ) по сравнению с контрольной группой (р 0,05). При проведении корреляционного анализа в lb подгруппе выявлена обратная зависимость между уровнем TGF- (3 и S 100(3 в околоплодных водах (R=0,91, р 0,04) , аналогичные данные получены и в подгруппе Па - выявлена обратная зависимость между уровнем TGF- (3 и S 100(3 (R=0,81, р 0,05), что можно объяснить протективным действием TGF-(3, направленным на нейтрализацию провоспалительных цитокинов. В подгруппе 1а данная взимосвязь не прослеживается, что является фактом в пользу предположения о более выраженном нарушении баланса между про-и противовоспалительными цитокинами в околоплодных водах при ранней манифестации перинатального поражения ЦНС.
Кроме того, в lb подгруппе выявлена обратная зависимость между уровнем TGF- (3 и TNF-a в околоплодных водах (R=-0,92, р 0,01), что согласуется с данными Tedgui А. (2001) о действии TGF- (3, как паракринного противовоспалительного фактора, снижающего продукцию TNF-a.
У новорожденных в подгруппе 1а содержания IL-1(3 в пуповинной крови превысило показатели контрольной группы в 2,1 раз, при этом выявлена зависимость между уровнем IL-1(3 и S100(3 в пуповинной крови (R=-0,82, р 0,01), данная взаимосвязь не прослеживается в подгруппах с отсроченной манифестацией перинатального поражения ЦНС, что может быть маркером ранних неврологических нарушений.