Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патогенез диабетической ретинопатии 13
1.1. Роль хронического воспаления, полиольного пути, протеинкиназы С и ростовых факторов в развитии микрососудистых осложнений сахарного диабета .13
1.2. Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры прогрессирования диабетической ретинопатии .19
Глава 2. Иммунные механизмы возрастной макулярной дегенерации 26
2.1. Основные факторы патогенеза возрастной макулярной дегенерации .26
2.2. Система комплемента и возрастная макулярная дегенерация 28
2.3. Роль паравоспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации 30
2.4. Активация инфламмасом при возрастной макулярной дегенерации 31
2.5. Системные иммунологические маркеры прогрессирования возрастной макулярной дегенерации .32
Материалы и методы исследований результаты собственных исследований 43
Глава 1. Изменения системных иммунологических показателей у больных диабетической ретинопатией 43
1.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных диабетической ретинопатией 43
1.2. Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией 53
1.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией 56
Глава 2. Изменения системных иммунологических показателей у больных возрастной макулярной дегенерацией 63
2.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных возрастной макулярной дегенерацией .63
2.2. Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией .72
2.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией 74
Обсуждение 79
Выводы 88
Практические рекомендации 90 литература .
- Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры прогрессирования диабетической ретинопатии
- Роль паравоспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации
- Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией
- Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией
Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры прогрессирования диабетической ретинопатии
Однако в трактовке установленных фактов авторы двух вышеуказанных работ существенно разошлись. M.Urbani и соавторы делали заключение о патогенетическом значении Т-клеточной инфильтрации тканей глаза, тогда как A.Cantn с коллегами рассматривали это как саногенетическое (протективное) событие при прогрессировании ДР.
На наш взгляд, более аргументированной является интерпретация первой группы ученых, которые проводили параллели в патогенезе ДР и развитии аутоиммунного увеита, при котором также установлена патогенетическая роль CD4+-Т-лимфоцитов и выявлено 4-кратное увеличение соотношения CD4/CD8 в сравнении с таковым в периферической крови [Davis J.L. et al, 2012]. Увеличение же доли CD8+-Т-лимфоцитов связывают, наоборот, с регрессией аутоиммунного внутриглазного воспаления [Калюжин О.В. и др., 2011, Дикинов З.Х. и др., 2014].
N.Dong и соавторы сравнили с помощью мультиплексного анализа концентрации 27 цитокинов в водянистой влаге у больных СД 2 типа и недиабетических пациентов для того, чтобы установить связь этих цитокинов с развитием ДР [Dong N. et al, 2013]. Образцы водянистой влаги были получены от 102 пациентов без диабета (102 глаз) и 136 больных СД (136 глаз), которые были разделены на девять групп в соответствии с тяжестью ДР. По сравнению с недиабетическим контролем, диабетические пациенты имели значительно более высокие концентрации ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1), ИФН- индуцированного белка-10 (IP-10) и VEGF. Наоборот, содержание ИЛ-10 и ИЛ-12 было значительно ниже у больных СД. Уровень других цитокинов существенно не различался между диабетическими пациентами и контрольной группой. Внутриглазные концентрации ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 MCP-1 и IP-10 возрастали с увеличением тяжести ДР. В этом исследовании, как и в описанной в параграфе 1.1 работе [Blum A. et al, 2012], не выявлено прямой связи уровня VEGF с тяжестью ДР. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-12 в водянистой влаге уменьшалась по мере увеличения выраженности ДР.
Также проводилось исследование уровня 27 цитокинов в слезной жидкости больных СД 2 типа с ДР или без нее [Liu J. et al, 2010]. Образцы слезы были собраны у 15 больных СД без ретинопатии, 15 пациентов с ДР и 15 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными. Мультиплексный анализ показал, что IP-10 был преобладающим цитокином, выявляемым в слезной жидкости. Уровни IP-10 и МСР-1 были значительно выше у пациентов с ДР по сравнению с контрольной группой и больных СД без ДР. Содержание IL-1Ra существенно увеличивалось у пациентов с СД без ретинопатии. Соотношение Th1/Th2-цитокинов – ИФН-/ИЛ-5 и ИЛ-2/ИЛ-5 – было значительно выше у больных СД с ДР по сравнению с недиабетическим контролем и диабетиками без ДР. Баланс антиангиогенных/проангиогенных цитокинов – ИФН-/MCP-1 и ИЛ-4/MCP-1 – существенно снижался по сравнению с контролем у диабетиков вне зависимости от наличия/отсутствия ДР. Коэффициенты ИЛ-4/IL-8 и ИЛ-12p70/ИЛ-8 у больных с ретинопатией были значительно ниже, чем в контроле. Не установлено связи между концентрациями цитокинов в слезной жидкости и уровнями гликированного гемоглобина или глюкозы в плазме крови натощак. Таким образом, в слезной жидкости больных СД 2 типа обнаружено преобладание проангиогенных цитокинов над антиангиогенными медиаторами, а развитие ДР сопровождалось повышением концентрации IP-10 и МСР-1, а также сдвигом функционального баланса Th1/Th2 в направлении Th1.
Большой интерес вызывают исследования, в которых внутриглазные концентрации факторов воспаления и ангиогенеза сопоставляются с таковыми в сыворотке или плазме крови. Данные таких работ привлекают внимание с точки зрения выявления в более доступных биологических образцах системных иммунологических показателей, которые не только отражают внутриглазные патогенетические/саногенетические события, но и могут использоваться для диагностики и прогноза течения ДР.
R.Maier и соавторы определяли концентрации в стекловидном теле и сыворотке крови IP-10, МСР-1, макрофагальных воспалительных белков-1 и -1 (MIP-1 и -1), хемокина, экспрессируемого и секретируемого T-клетками при активации (RANTES) и VEGF у 36 больных СД 2 типа и 69 недиабетических пациентов контрольной группы [Maier R. et al, 2008]. У больных СД интравитреальные уровни IP-10, MCP-1 и VEGF были значительно выше по сравнению с контролем. При этом концентрация VEGF коррелировала с таковыми IP-10 и МСР-1. Содержание в сыворотке крови MIP-1, RANTES и VEGF также существенно возрастало у пациентов с СД, а концентрации IP-10, MCP-1 и MIP-1 статистически значимо не изменялись. Таким образом, интравитреальный уровень VEGF коррелировал с таковым в сыворотке, тогда как концентрации IP-10 и MCP-1 возрастали только внутри глаза, а MIP-1 и RANTES – лишь в системном кровотоке.
Повышение уровней провоспалительных и ангиогенных факторов в стекловидном теле может быть результатом трех путей. Во-первых, это прорыв гематоретинального барьера, приводящий к повышению внутриглазного уровня воспалительных и ангиогенных факторов у диабетиков [Yoshida S. et al, 2004]. Вторым вариантом является экспрессия воспалительных и ангиогенных факторов клетками (макрофагами, моноцитами, глиальными клетками, пигментными эпителиоцитами) непосредственно внутри стекловидного тела. В-третьих, хемокины и ангиогенные факторы индуцируются в сетчатке в результате гипоксии, что было показано на модели ретинальной ишемии-реперфузии [Jo N. et al, 2003]. Наличие различных путей объясняет отличия уровней некоторых медиаторов воспаления и ангиогенеза в сыворотке крови и стекловидном теле [Maier R. et al, 2008].
Роль паравоспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации
Патогенез ДР, в частности прогрессирование заболевания от препролиферативной к пролиферативной форме, в значительной степени связывают с иммунными механизмами. Пролиферативная ДР характеризуется развитием неоваскуляризации сетчатки и сопровождается существенным снижением или даже потерей зрения. В этой связи выявление четких иммунологических маркеров развития пролиферативной ДР у больных СД 2 типа не только проливает свет на многие дискуссионные вопросы патогенеза этого заболевания, но и вносит вклад в оптимизацию ранней диагностики пролиферативной ДР и предопределяет рациональный поиск эффективных средств патогенетической (в том числе специфической) иммунотерапии.
Несмотря на многочисленные попытки установить иммунофенотипические особенности лимфоцитов у больных различными клиническими формами/стадиями ДР, результаты ранее выполненных исследований отличаются крайней противоречивостью (см. раздел «Обзор литературы»).
Полученные в рамках настоящей работы данные говорят, что в большинстве случаев отсутствуют однонаправленные линейные изменения числа тех или иных популяций и субпопуляций лимфоцитов, отражающие прогрессирование заболевания и последовательное развитие препроплиферативной и пролиферативной ДР. Так, если общее число лимфоцитов и их CD38+- и CD54+-субпопуляций у большинства больных возрастало в препролиферативную стадию ДР, дальнейшего роста содержания этих клеток при пролиферативной форме заболевания не наблюдалось. Это отчасти не совпадало с ранее опубликованными данным о неуклонном характере возрастания числа CD54+-лимфоцитов и CD54+-гранулоцитов по мере прогрессирования ДР [Кочемасова Т.В. и др., 2001]. Более того, восходящий тренд количества Т-лимфоцитов (CD3+ клеток), а также CD4+-, CD8+-, CD11b+- и CD71+-клеток, выявленный у больных препролиферативной ДР, при развитии пролиферативной формы заболевания сменял вектор на нисходящий. Очевидно, что в таком случае использовать степень падения числа указанных клеточных популяций/субпопуляций как критерий прогрессирования заболевания весьма затруднительно, так как оно может отражать не только начало пролиферативных процессов на глазном дне, но и эффективность лечения препролиферативной ДР и/или степень контроля СД 2 типа как фонового заболевания.
В этом плане как более информативные маркеры развития пролиферативной ДР можно рассматривать снижение количества CD25+-лимфоцитов и повышение числа CD95+-, HLA-DR+-клеток, а также (с меньшей обоснованностью) рост содержания CD16+-лимфоцитов. Помимо того, что эти показатели в математически подтверждённой степени отличались между группами с разными формами ДР, изменения количества указанных клеток в пролиферативную фазу заболевания еще больше увеличивало степень различия с контролем, которая наблюдалась у больных с препролиферативной ДР.
Дисбаланс числа CD25+-, CD95+- и HLA-DR+-лимфоцитов при пролиферативной ДР можно рассматривать как проявление активации хронического воспаления, при котором истощается пул клеток с ранними активационными маркерами (CD25) и увеличивается количество клеток, экспрессирующих молекулы, свидетельствующие о поздних этапах активации (HLA-DR) и готовности к апоптозу (CD95).
Если изменения сывороточных и внутриглазных концентраций VEGF и ряда провоспалительных медиаторов, таких как ФНО, ИЛ-6, ИЛ-8, MIP-1, MСP-1, при различных формах ДР детально описаны в литературе [Abcouwer S.F., 2013; Hang H. et al, 2014], то в отношении продуктов хелперных/регуляторных подтипов Т-клеток четких данных литературы не обнаружено, за исключением повышения уровня ИЛ-22 в сыворотке крови и надосадочной жидкости культуры мононуклеаров, выделенных у больных пролиферативной ДР [Chen H. et al, 2012]. Раскрыты некоторые особенности баланса Th1/Th2-цитокинов при различных формах аутоиммунного СД [Саприна Т.В. и др., 2012]. Вместе с тем оставался открытым вопрос о изменениях сывороточного профиля этих цитокинов при прогрессировании ДР на фоне СД 2 типа.
Осуществлённый нами поиск иммунологических критериев перехода препролиферативной формы заболевания в пролиферативную при изучении концентраций в сыворотке крови цитокинов, отражающих функцию ключевых субпопуляций CD4+-лимфоцитов, не увенчался успехом.
Уровень ИФН- и ИЛ-10 повышался примерно в равной степени у больных обеими формами заболевания. Концентрация ИЛ-4 при пролиферативной ДР была ниже нормальных значений, однако не отличалась от таковой у пациентов с препролиферативной ДР. Сывороточный уровень ИЛ-2 не отражал ни форму ДР, ни наличия/отсутствия этого заболевания. Более того, содержание последнего цитокина у многих обследованных, особенно у больных с пролиферативной ДР, было ниже уровня детекции используемой тест-системы для высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа.
Отсутствие корреляции между концентрациями Th1-продуктов – ИЛ-2 и ИФН- – можно объяснить тем, что последний цитокин вырабатывается не только Th1-лимфоцитами, но и в значительной степени NK-клетками, особенно в стадии их терминальной дифференцировки [Luetke-Eversloh M. et al, 2014].
Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией
При изучении уровня растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных ДР не установлено линейной закономерности их возрастания или снижения по мере прогрессирования заболевания от препролиферативной к пролиферативной форме заболевания.
Концентрация sCD38 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией Концентрации растворимых форм мембранных молекул адгезии sCD38 и sCD50, во многом благодаря высокой индивидуальной вариативности этих показателей, практически не отличались во всех группах обследованных пациентов с ДР и здоровых доноров (Рис.19 и 20).
Напротив, содержание растворимой формы другой адгезионной молекулы – sCD54 – в сыворотке крови больных ДР возрастало. И хотя математически подтверждённых отличий между двумя группами пациентов с ДР не обнаружено, следует отметить тенденцию к снижению концентрации этой молекулы при переходе препролиферативной ДР в пролиферативную форму заболевания (Рис. 21).
Уровень sCD8 – молекулы, мембранная форма которой является дифференцировочным маркером ЦТЛ и, взаимодействуя с HLA-I, ассоциированным с презентируемыми антигенами, обеспечивает распознавание этих антигенов Т-клеточным рецепторным комплексом, – повышался только у больных пролиферативной ДР (Рис. 22). Рисунок 21. Концентрация sCD54 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,004 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,005 (критерий Манна-Уитни) или p=0,004 (критерий Данна), – p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,049 (критерий Данна)
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,041 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,021 (критерий Манна-Уитни) или p=0,132 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # – p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,059 (критерий Данна) Медиана концентрации sCD8 была выше таковой не только в контроле, но и у больных препролиферативной формой заболевания.
В целом сходные закономерности изменения содержания в сыворотке крови отмечены и для sHLA-I. Концентрация этой молекулы у больных пролиферативной ДР была выше, чем в контрольной группе и у больных препролиферативной ДР (Рис. 23).
Рисунок 23. Концентрация sHLA-I (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,021 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,010 (критерий Манна-Уитни) или p=0,030 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # – p=0,028 (критерий Манна-Уитни) или p=0,085 (критерий Данна)
Уровень растворимых комплексов sHLA-I+CD8 статистически значимо не различался между группами (Рис. 24). Вместе с тем следует отметить тенденцию к снижению концентрации sHLA-I+CD8 у больных препролиферативной ДР и к повышению – у пациентов с пролиферативной формой болезни. Рисунок 24. Концентрация sHLA-I+CD8 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,078 (критерий Данна), – p 0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,001 (критерий Данна) Содержание sHLA-DR в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной ДР превышало соответственно в два и полтора раза таковое в группе здоровых доноров (Рис. 25). Парное сравнение не выявило отличий по уровню sHLA-DR между группами с разными формами заболевания. Концентрация sCD25 возрастала только у больных препролиферативной ДР, однако из-за высокой вариативности указанного показателя это повышение подтверждалось лишь с помощью критерия Манна-Уитни при сравнении с контролем (Рис. 26). При множественном сравнении различия между группами опровергались.
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,083 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,038 (критерий Манна-Уитни) или p=0,111 (критерий Данна)
Уровень sCD95 в сыворотке крови увеличивался в полтора раза только у больных препролиферативной ДР (Рис. 27). В пролиферативную фазу заболевания содержание этой молекулы не отличалось от контроля и было в математически подтверждённой степени ниже, чем при препролиферативной ДР.
Установлена прямая корреляционная связь между концентрациями sCD25 и sCD95.
Рисунок 27. Концентрация sCD95 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией
Значимость различия при множественном сравнении: p=0,002 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: – p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,003 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # – p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,022 (критерий Данна) Глава 2. Изменения системных иммунологических показателей у больных возрастной макулярной дегенерацией
Концентрации Th1/Th2/Tr1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией
Поиск этих критериев был построен по тому же алгоритму, что и выявление маркеров прогрессирования ДР.
Общее число лейкоцитов, лимфоцитов, В-клеток и СD4+-лимфоцитов и клеток, экспрессирующий активационный маркер HLA-DR , в крови больных разными формами ВМД не отличалось от нормальных значений.
Незначительная тенденция к увеличению общего количества лимфоцитов и их СD11b+-субпопуляции при влажной ВМД вряд ли имеет существенное диагностическое/прогностическое значение.
Выявление разных тенденций изменения числа лимфоцитов с активационными маркерами – снижения содержания клеток, экспрессирующих -цепь рецептора ИЛ-2 (CD25), и экспансии лимфоцитов с рецепторами трансферрина (CD71) при сухой ВМД с нормализацией количества обеих субпопуляций при влажной ВМД – также не имело высокой ценности в контексте поиска предикторов развития влажной формы заболевания.
Число СD54+-лимфоцитов, экспрессирующих межклеточную молекулу адгезии ICAM-1, и CD16+-лимфоцитов (NK-клеток) повышалось примерно в равной степени при сухой и влажной ВМД. Данные об увеличении числа СD54+-лимфоцитов при обеих формах заболевания подтверждали результаты диссертационного исследования О.Г.Фотиади [Фотиади О.Г., 2009].
Количество лимфоцитов с маркером готовности к апоптозу – СD95 – возрастало при сухой ВМД и имело дальнейший восходящий (математически не подтверждённый) тренд у больных влажной ВМД.
Более четким было повышение числа Т-клеток, преимущественно за счет СD8+-лимфоцитов, а также СD38+-клеток именно у пациентов с влажной ВМД. Однако и эти показатели с учетом их высокой индивидуальной вариативности могут быть лишь дополнительными критериями прогрессирования ВМД в совокупности с другими клинико инструментальными и лабораторными данными. Среди всех изученных в сыворотке крови цитокинов, характеризующих функцию хелперных/регуляторных субпопуляций CD4+-клеток, статистически значимые изменения выявлены только в отношении провоспалительного Th1-продукта ИФН-, концентрация которого возрастала у больных сухой ВМД. Вместе с тем при влажной форме заболевания уровень этого цитокина не отличался от такового у здоровых доноров. Результаты наших исследований в целом не противоречат данным Р.А.Азнабаева и соавторов, которые установили, что уровень ИФН- в сыворотке крови в предисциморфную стадию заболевания имеет тенденцию к росту, но при развитии влажной формы ВМД заметно снижается [Азнабаев Р.А., 2008].
Концентрация sCD38 в сыворотке крови снижалась примерно в равной степени при обеих формах ВМД, не отражая прогрессирование заболевания. Развитие влажной ВМД сопровождалось существенным повышением содержания sСD25 и sСD54 (sICAM-1), которое превосходило соответствующие показатели не только у здоровых доноров, но и у больных сухой ВМД. Результаты нашей работы подтверждают ранее опубликованные данные о патогенетическом значении sICAM-1, внутриглазная концентрация которого существенно увеличивалась при экссудативной форме ВМД даже на фоне нормального уровня VEGF [Jonas J.B. et al, 2010].
Таким образом, проведенное исследование уточняет характер изменений иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови, сывороточного уровня ключевых цитокинов, характеризующих функцию Th1-, Th2- и Tr1-клеток, а также содержания растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток при различных клинических формах ДР и ВМД. Тщательная математическая обработка полученных данных позволила выделить ряд системных иммунологических показателей, которые могут использоваться как дополнительные критерии прогрессирования ДР и ВМД, в частности оптимизировать раннюю диагностику пролиферативной ДР и влажной ВМД.