Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
Глава 1. Обзор методов количественной диагностики антител к коклюшу, дифтерии и столбняку 10
1.1. Реакция нейтрализации токсинов in vivo 10
1.2 Реакция нейтрализации токсинов in vitro 11
1.3. Иммуноферментный анализ 12
1.4. Агглютинационные тесты 14
Глава 2. Современные подходы к твердофазному дот-иммуноанализу 15
2.1. Улеродные наночастицы в иммунодиагностике 15
2.2. Подходы к оценке результатов анализа 18
2.3. Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования 20
Материалы и методы исследования 22
Глава 3. Материалы 22
Глава 4. Методы 23
4.1.Количественное определение антител к коклюшу, дифтерии и столбняку в сыворотках крови 23
4.2. Оценка гомогенности белковых препаратов, использовавшихся в работе 23
4.3. Синтез углеродного диагностикума 23
4.4.Измерение обратного динамического светорассеяния 25
4.5. Измерение интенсивности диагностического сигнала в твердофазном анализе 25
4.6. Статистическая обработка данных 26
Результаты исследований и их обсуждение 27
Глава 5. Концепция и формат иммуноанализа, твердофазный реагент, диагностические пороги теста 27
Глава 6. Характеристика реагентов, использовавшихся при конструировании тест-системы 35
Глава 7. Оптимизация процедуры оценки результатов анализа 37
7.1. Воспроизводимость измерений интенсивности сигнала 37
7.2. Подбор фактора коррекции гаммы изображения 39
Глава 8. Оптимизация процедуры анализа 42
8.1. Подбор оптимальной концентрации диагностического реагента 42
8.2. Подбор режима блокирования неспецифических взаимодействий 46
8.3. Подбор оптимальных концентраций анти-лигандов и длительности инкубации с сыворотками крови 50
8.4. Оптимизация условий детекции противококлюшных антител 51
8.5. Подбор оптимальных условий детекции столбнячных и дифтерийных антител 54
Глава 9. Определение аналитических характеристик тест-системы 57
9.1. Воспроизводимость детекции антител к коклюшу, дифтерии и столбняку, профиль точности анализа 57
9.2. Параллелизм 60
Глава 10. Исследование сывороток крови при помощи референсных тест-систем
10.1. Содержание антител к коклюшу у детей различных возрастных групп 63
10.2. Содержание дифтерийного и столбнячного антитоксинов у детей 66
Глава 11. Апробация сконструированной дот-иммуноаналитической тест системы 67
Заключение 73
Выводы 79
Список принятых сокращений 80
Список литературы 81
- Реакция нейтрализации токсинов in vitro
- Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования
- Синтез углеродного диагностикума
- Подбор оптимальных концентраций анти-лигандов и длительности инкубации с сыворотками крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Вакцинация в настоящее время является основным инструментом профилактики целого ряда инфекционных заболеваний. В значительной степени благодаря стабильно высокому охвату населения прививками удалось добиться практически полной элиминации ряда опасных инфекционных заболеваний (Харит С.М. Вакцинация: современные возможности снижения заболеваемости. Фарматека. 2014. № 3. С. 8-13).
Эффективность вакцинопрофилактики обеспечивается высокими уровнями охвата
населения профилактическими прививками, а также проведением регулярного мониторинга
напряженности поствакцинального иммунитета на региональном уровне. Серологический
контроль позволяет выявлять территории с низким уровнем защиты от инфекций и
приступить к выяснению и ликвидации причин такого явления. Негативно влиять на
результативность вакцинации могут такие факторы, как высокий уровень техногенного
загрязнения, нарушения режимов транспортировки и хранения отдельных партий вакцин
(Антипов О.Н. и др. Проблемы организации непрерывного контроля температурного режима
при хранении и транспортировании. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009. №4. С.
70–72; Макарова В.Г. и др. Иммунологический профиль и состояние поствакцинального
иммунитета к инфекциям, управляемым средствами иммунопрофилактики у детей в
условиях комбинированной аэрогенной экспозиции химическими веществами техногенного
происхождения. Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 11. С. 27–29).
Серологический мониторинг является единственным инструментом контроля
вакцинопрофилактики инфекций, близких к полной элиминации или проявляющих себя лишь спорадически: дифтерии, столбняка, кори и т.д., когда изменение уровня заболеваемости не может быть использовано в качестве индикаторного показателя.
Настоящая работа направлена на разработку серологической тест-системы, предназначенной для оценки состояния поствакцинального иммунитета, которая могла бы стать альтернативой традиционным иммуноферментным и агглютинационным тестам. Особенностью предлагаемой тест-системы является мультианалитность, т.е. возможность детекции антител к нескольким инфекциям, а именно коклюшу, дифтерии и столбняку в одной постановке. Коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина была выбрана в качестве модели ввиду высокой реактогенности ее цельноклеточного варианта, а также по причине сложной текущей ситуации с заболеваемостью коклюшем как в РФ, так и в других странах мира (Харит С.М. и др. Специфическая профилактика коклюша: проблемы и перспективы. Вопросы современной педиатрии. 2007. Т. 6. № 2. С. 71–77; Таточенко В.К. Коклюш -недоуправляемая инфекция. Вопросы современной педиатрии. 2014. Т. 13. № 2. С. 78-82).
Цель исследования
Создание системы серологической диагностики, предназначенной для оценки
напряженности поствакцинального иммунитета к коклюшу, дифтерии и столбняку на основе
треханалитного твердофазного иммуносорбента и диагностического реагента,
представляющего собой наноразмерные частицы углерода, конъюгированные с G белком стрептококка.
Задачи исследования
1. Подобрать компоненты систем анализа, а также условия его постановки, оптимальные одновременно для детекции антител к дифтерийному анатоксину, столбнячному анатоксину и антигенам коклюшного возбудителя;
-
Оформить сконструированную тест-систему в оптимальной для практического применения процедурной аранжировке, верифицировать её диагностическую значимость;
-
Провести испытания разработанной тест-систем на клиническом материале в параллельном сравнении с коммерческими аналогами.
Методология и методы исследования
Методологическую основу работы составляют принципы конструирования, оптимизации, валидации и апробации количественных, полуколичественных и качественных серологических тест-систем. В работе использованы иммунологические и статистические методы исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Результаты получены на сертифицированном оборудовании. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках по данной тематике. В работе использованы современные методики сбора и обработки исходной информации с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, США), GraphPad Prism (GraphPad Software, США).
Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на Юбилейной научно-практической конференции «40 лет НИИОЧБ», Санкт-Петербург, 2014; Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины», Екатеринбург, 2014; XII Конференции иммунологов Урала, Пермь, 2015.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах
диссертационного исследования. Планирование научной работы, определение методологии и
общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным
руководителем д.б.н. Михаилом Борисовичем Раевым, в.н.с. лаборатории экологической
иммунологии ИЭГМ УрО РАН. Цель и задачи сформулированы совместно с научным
руководителем. Дизайн исследования разработан лично диссертантом. Анализ современной
отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично
диссертантом. Получение и интерпретация клинико-анамнестических данных
осуществлялись лично диссертантом. Все экспериментальные и технологические исследования проведены лично диссертантом. Образцы сывороток крови детей были получены из ГДКП №5, г. Пермь (заведующий лабораторией к.м.н. Нина Борисовна Шемякина). Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично.
Положения, выносимые на защиту
-
Сконструированная и оптимизированная дот-иммуноаналитическая тест-система позволяет осуществлять полуколичественную детекцию противодифтерийных и противостолбнячных антител, а также качественную детекцию противококлюшных антител в одной постановке;
-
Разработанная тест-система пригодна для оценки напряженности поствакцинального иммунитета при введении коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины, что обеспечивает возможность ее использования для контроля эффективности иммунизации.
Научная новизна
Разработана оригинальная тест-система, предназначенная для одновременной
полуколичественной детекции противодифтерийных и противостолбнячных антител и
качественной детекции противококлюшных антител при помощи суспензии
функционализированных G белком стрептококка углеродных наночастиц.
Впервые синтезирован иммуносорбент на основе антигенов возбудителей коклюша, дифтерии и столбняка, предназначенный для постановки дот-иммуноанализа.
Исследована зависимость кинетики взаимодействия антител с сорбированными на твердую фазу антигенами дифтерии, столбняка и коклюша от таких факторов как длительность инкубации с сывороткой крови и концентрация анти-лиганда.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость настоящей работы состоит в исследовании условий и
закономерностей взаимодействия противоинфекционных антител с соответствующими
антигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Разработка мультианалитных тест-
систем сопряжена с необходимостью подбора условий постановки анализа, которые
являлись бы оптимальными одновременно для каждого из аналитов (лигандов). Основная
сложность процесса оптимизации мультианалитных серологических тестов связана с
различным влиянием физико-химических факторов (температура, влажность, концентрация
белка, природа твердой фазы, состав буферов и т.д.) на кинетику взаимодействия каждой
отдельной пары антиген-антитело. Полученные данные и разработанные методологические
подходы являются теоретической базой для конструирования тест-систем,
предусматривающих одновременную детекцию антител к различным антигенам как в комплексном, так и в раздельном состоянии.
Практическая значимость работы заключается в возможности использования
сконструированной серологической тест-системы для оценки поствакцинального
иммунитета в аспекте наличия защитного уровня антител. Кроме того, по результатам тестирования возможно формулирование рекомендаций относительно сроков осуществления дальнейшего серологического контроля и вакцинации для дифтерии и столбняка. Разработанная тест-система предназначена для использования в клинических лабораториях независимо от их приборной оснащенности.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практику исследовательской деятельности лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН и используются для оценки продуктивности клеточных культур, продуцирующих иммуноглобулины (гибридомная технология), оценки интенсивности иммунного ответа у иммунизированных лабораторных животных, мониторинга процесса аффинной очистки иммуноглобулинов.
Публикации
Соискатель имеет 17 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 6 научных работ общим объёмом 2,6 печатных листа, в том числе 5 публикаций (2 статьи, 3 тезиса) в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, и 1 статья в журнале, зарегистрированном в базе РИНЦ.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 164 наименования работ, в том числе 40 в отечественных и 124 в зарубежных изданиях.
Реакция нейтрализации токсинов in vitro
Наиболее популярным методом определения антител к возбудителям коклюша, дифтерии и столбняка является иммуноферментный анализ (ИФА). Метод основан на количественной приборной оценке интенсивности цветной ферментативной реакции, происходящей при наличии в пробе аналита. Нет необходимости уделять внимание детальному описанию принципов ИФА, поскольку этот метод анализа применяется практически во всех современных диагностических лабораториях. Стоит лишь отметить, что наиболее обычным в серодиагностике коклюша, дифтерии и столбняка является непрямой вариант ИФА, в котором твердую фазу сенсибилизируют антигеном возбудителя, иммуносорбент инкубируют с исследуемым образцом, после чего связавшиеся с твердой фазой антитела детектируют при помощи антивидового ферментного конъюгата.
Методика постановки ИФА для количественного определения столбнячного антитоксина была впервые описана в работах [141, 91]. Длительность анализа могла достигать нескольких суток, однако результаты тестов демонстрировали хорошую корреляцию с титрами, полученными при помощи радиоиммуносорбентного теста. На несколько лет позднее были разработаны более оперативные варианты ИФА [99, 133]. В последние годы были предприняты попытки создать ИФА-тесты, основанные на применении авидин-биотиновой реакции [7, 17, 43]. В работах Вязниковой и Николаевой авидин-биотиновая система использована также для выявления антител к дифтерийному токсину и антигену возбудителя коклюша. Сравнение результатов ИФА и реакции нейтрализации in vivo выявило хорошую согласованность при высоких концентрациях столбнячного антитоксина в пробах ( 0,2 МЕ/мл) [136, 137]. Для низкотитражных сывороток в ИФА отмечаются завышенные результаты в сравнении с референсом. В 1987 г. была разработана методика конкурентного ИФА решившая проблемы расхождения результатов ИФА и РН [137, 79]. В дальнейшем эта методика была усовершенствована при помощи использования меченного ферментом анатоксина для ингибирования реакции «токсин-анатоксин» вместо антивидового конъюгата [88]. Аналогичный вариант конкурентного ИФА был разработан для количественного определения антител к дифтерийному токсину.
В ходе создания и совершенствования методики постановки ИФА для определения дифтерийного антитоксина была обнаружена аналогичная описанной выше взаимосвязь результатов ИФА и реакции нейтрализации in vitro: высокая степень согласованности для высокотитражных сывороток и низкая – для низкотитражных [100].
Иммуноферментные тесты для детекции антител к очищенным антигенам коклюшного микроба описаны в целом ряде работ [42, 46, 70, 101, 163]. Существуют также публикации, в которых продемонстрировано использование цельных [63, 107] и разрушенных ультразвуком [90] клеток коклюшного микроба в качестве анти-лиганда в ИФА. Отсутствие «золотого стандарта» в серологической диагностике коклюша, а также недостаточные знания о вкладе антител к отдельным антигенам в противококлюшный иммунитет не позволяют объективно оценить и сравнить перечисленные методы. Более подробно этот вопрос обсуждается в главе, посвященной подбору коклюшного антигена, который будет использован в качестве анти-лиганда.
Иммуноферментный анализ по праву является наиболее популярным методом серологической диагностики. Для ИФА-тестов характерна оперативность (длительность теста, включая пробоподготовку, в пределах трех часов), возможность автоматизации, большой выбор считывающей аппаратуры, объективность анализа. Тем не менее иммуноферментный анализ не дает возможности документировать и сохранять результаты теста, его применение ограничено наличием специализированного оборудования и специалистов с достаточно высокой квалификацией. Немало важным фактом является токсичность и ограниченная годность используемых в наборах хромогенов. Кроме того, не стоит забывать, что инструментальные тесты требуют не только наличия прибора, но и его исправной работы. Выход прибора из строя может помешать нормальной работе лаборатории. По этим причинам в нашей стране в настоящее время остаются популярными неинструментальные агглютинационные тесты.
Реакция агглютинации (РА) – традиционный метод серодиагностики коклюша. Суть метода заключается в длительной (около суток) инкубации взвеси коклюшного микроба с кратными разведениями исследуемой сыворотки крови. При наличии в ней антител к B. pertussis иммунные комплексы «бактерия-антитело» выпадают в осадок, который можно разглядеть невооруженным взглядом. Снижение концентрации антител в ходе титрования сыворотки сопровождается снижением объема осадка и исчезновением его в лунках с высокими разведениями сыворотки. Разведение сыворотки крови, дающее снижение объема осадка до определенного уровня соответствует титру антител. Согласно данным ВОЗ, РА позволяет выявить в первую очередь антитела к фимбриям, пертактину и липоолигосахариду [65].
Для полуколичественной оценки уровня антител к дифтерии и столбняку традиционно используется реакция пассивной гемагглютинации. Для ее постановки используют иммуносорбент, представляющий собой эритроциты человека, барана или лошади, сенсибилизированные дифтерийным или столбнячным анатоксином. Фиксированный объем эритроцитов инкубируют с кратными разведениями исследуемых сывороток крови. Титр антител определяют по разведению, в котором степень агглютинации падает до указанного уровня. Для корректной постановки теста требуется предварительное удаление из нее неспецифических гемагглютининов, методом истощающей инкубации с несенсибилизированными эритроцитами барана. Процедура истощения занимает несколько часов, усложняет процесс подготовки пробы, а также отсрочивает получение результата. В целом, результаты агглютинационных тестов достаточно слабо коррелируют с результатами, полученными при помощи культуральных тестов и тестов in vivo, в особенности для низких значений титров [45, 138].
Очевидным преимуществом агглютинационных тестов является независимость от наличия приборов, доступность для лаборатории любого уровня. Негативными сторонами их являются длительность постановки, необходимость титрования сыворотки, субъективность оценки результатов (последняя может быть преодолена при помощи приборной обработки результатов анализа).
Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования
Целью настоящей работы является разработка диагностического инструмента, предназначенного для контроля над эффективностью вакцинации, доступного для лаборатории любого уровня материально-технической оснащенности. Изначально мы рассчитывали, что учет результатов анализа, а именно определение титров антител, будет производиться визуально, без применения какой-либо аппаратуры. Изменение концепции тест-системы, предполагающее анализ одного разведения образца сыворотки крови вместо серии разведений, поставило нас перед выбором: либо придерживаться направленности на визуальную детекцию результатов, либо перейти к приборной обработке результатов теста. В первом случае возможно было позаимствовать принцип работы современных коммерческих тест-систем, в частности системы «ImmunoComb» от Biogal. Он заключается в визуальном сравнении интенсивности аналитического сигнала образца с прилагаемым к набору графическим изображением (стандартом). Подобный подход весьма удобен для конечного пользователя и интуитивно понятен, однако сохраняет значительную долю субъективности. Кроме того, его реализация требует значительной степени автоматизации производства твердофазных реагентов и других компонентов анализа для обеспечения надлежащей правильности и воспроизводимости результатов.
Мы решили обратиться к другому подходу оценки результатов анализа, который впервые был предложен еще в 1982 г. в статье Hawkes с соавт. [75]. Он заключается в использовании сканера для оцифровки результатов теста, последующего измерения интенсивности окрашивания аналитической зоны при помощи специализированной программы и построения калибровочной кривой на основе полученных данных. Наиболее подробно применение такого подхода применительно к тестам на основе углеродных диагностикумов было рассмотрено Lonnberg и Carlsson [95]. Как отмечают сами авторы, применение сканера представляет собой компромисс между упрощением процедуры анализа и сохранением объективности оценки результатов. С момента публикации работы применение сканера в иммунодиагностике стало достаточно обычным явлением. В частности, упомянутая выше тест-система «ImmunoComb» предполагает возможность оцифровки результатов при помощи TWAIN-совместимого сканера и последующей их обработки в программе «CombScan», которая предоставляется производителем. Стоит также упомянуть наличие на рынке специализированных программно-аппаратных комплексов для обработки результатов анализа point-of-care тестов, выполненных в различных форматах (тест-полоски, кассеты, иммунохроматографические стрипы и т.д.): Scannex (Норвегия), EDCO (США).
Многочисленные публикации посвящены использованию сканеров для оценки результатов иммуноанализа [49, 96, 105, 111, 114, 121, 144]. Использование сканера позволяет сделать оценку результатов объективной, обеспечить получение количественного результата с минимальными финансовыми затратами. Значительную роль играет доступность программ обработки цифровых изображений, позволяющих производить собственно измерение интенсивности сигнала, фона для дальнейшего построения калибровочных кривых. Подобную роль могут выполнять мощные графические редакторы (Adobe Photoshop, Gimp и др.), однако более практично использовать «легковесные» и простые специализированные программы. Примерами таковых являются бесплатные Image Studio Lite (LI-COR Biosciences, США) и ImageJ (NIH, США), доступные для свободного скачивания из сети Интернет или платная TotalLab TL100 (Nonlinear USA Inc., США) [49]. Наличие бесплатных программ анализа изображений от надежных разработчиков, несомненно, способствует возможности повсеместного использования тестов, требующих оцифровки результатов анализа.
Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования
Идея одновременной детекции антител к целому спектру антигенов в одной постановке не является новостью в области имммуноанализа. Разработчики формата дот-иммуноанализа Hawkes, Niday и Gordon в своей пионерской работе [75] продемонстрировали возможность одновременной детекции антител к целому ряду инфекций в сыворотке крови человека. В дальнейшем мультианалитные дот аналитические, иммунохроматографические тесты были описаны в целом ряде научных публикаций. В качестве меток в этих работах использовали ферменты [48, 56, 59; 67, 106], золотые наночастицы [19, 52, 87, 127], частицы коллоидного угля [111]. Привлекательной особенностью мультианалитных тестов является возможность оперативного определения антител к широкому спектру антигенов за короткий промежуток времени. Это является большим преимуществом как для пациента, ввиду быстроты получения результата, так и для лабораторий, ввиду значительного снижения нагрузки на персонал и повышения пропускной способности. Однако, разработка и применение мультианалитных тестов имеет и свои подводные камни, которые рассмотрены в обзоре [147]. Одной из серьезнейших проблем является подбор одинаковых условий для количественной/полуколичественной детекции каждого из аналитов. Разумеется, гораздо более острой эта проблема является в сфере создания биочипов, где количество одновременно детектируемых аналитов может насчитывать десятки и даже сотни. Тем, не менее, разработка треханалитной дот-иммуноаналитической системы требует решения идентичной проблемы по подбору единых оптимальных условий анализа: разведения сыворотки, длительности инкубации, блокирующего реагента и т.д., что и составило одну из основных проблем, решение которой было найдено при выполнении представленной работы.
Диагностические тест-системы, предназначенные для детекции нескольких аналитов и особенности их конструирования
Приборы: хроматографическая колонка 1,5х12 см «Bio-Rad» (США), перистальтический насос Pump P-1, ультразвуковой дезинтегратор Soniprep 150 Plus «MSE» (Великобритания), приборно-аппаратный комплекс для измерения размеров частиц Zetasizer NanoZS «Malvern» (Англия), центрифуга 5804 R «Eppendorf» (Германия), спектрофотометр Shimadzu UV-VIS UVmini 1240 (Япония), сканер Canoscan Lide 600F «Canon» (США)
Реагенты: сефароза CL-6B «Pharmacia Fine Chemicals» (Швеция), нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,45 мкм «Bio-Rad» (США), бычий сывороточный альбумин (БСА), IgG человека, G белок стрептококка, казеин, сухое обезжиренное молоко «Sigma» (США), азид натрия, глутаровый альдегид «AppliChem» (Германия), глицерин, хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, твин-20 «Panreac» (Испания), диализные мешки «Serva», (Германия), фиколл 400 «Fluka» (Германия), суспензия инактивированных клеток Bordetella pertussis, включающая клетки вакцинных штаммов 1.2.3, 1.2.0 и 1.0.3, в концентрации 60 МОЕ, столбнячный и дифтерийный анатоксины «Микроген» (Россия), стандартные образцы столбнячного (ТЕ-3, 1-й Международный стандарт ВОЗ) и дифтерийного (10/262, 1-й Международный стандарт ВОЗ) антитоксинов «NIBSC» (Великобритания)
Из ГДКП №5, г. Пермь были получены 155 образцов сывороток венозной крови детей в возрасте от 2 недель до 17 включительно лет. Дети были вакцинированы цельноклеточными отечественными вакцинами АКДС или БУБО согласно Национальному календарю прививок и не имели диагноза «коклюш», «дифтерия» или «столбняк» в анамнезе. Сыворотки крови аликвотировали и хранили при температуре -20С.
Количественное определение дифтерийного и столбнячного антитоксина, а также антител против коклюшного токсина проводили методом непрямого ИФА при помощи тест-наборов производства «Euroimmun» (Германия) согласно инструкции производителя.
Титр антител к цельным клеткам коклюшного микроба выявляли при помощи реакции агглютинации, согласно инструкции, приложенной к диагностическому набору производства «Эколаб» (Россия).
Степень гомогенности препаратов G белка стрептококка, дифтерийного и столбнячного анатоксинов проводили при помощи электрофореза в 10%-ном ПААГ по методике, предложенной Laemmli [89]. Исследуемые препараты наносили на гель в концентрации 1 мг/мл, либо в концентрации, обозначенной отдельно.
Конъюгат углеродных наночастиц с G белком стрептококка был синтезирован по двустадийной технологии, подробно рассмотренной в работе [21]. Далее приведено краткое ее описание, заимствованное из статьи [26].
Этап 1. Один грамм аморфного углерода суспендировали в 19 мл 2% БСА в ЗФР в течение суток при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре (КТ). Концентрация углерода в пересчёте на сухой вес составила 5% (здесь и далее указаны массовые доли углеродных частиц). Полученную суспензию гидрофилизированных частиц подвергали ультразвуковой дезинтеграции при частоте 22 кГц (диаметр зонда 6 мм) в ячейке с охлаждающей рубашкой без перерывов. Общее время озвучивания составило один час. Температуру суспензии в ячейке контролировали при помощи термометра, в течение проведения ультразвуковой обработки она находилась в диапазоне 20-25С. С целью удаления оставшихся крупных частиц озвученную суспензию центрифугировали 5 мин при 1600g при КТ. Из полученного супернатанта отбирали пробу и исследовали ее при помощи анализатора частиц.
Этап 2. Порцию супернатанта объемом 4,5 мл инкубировали в течение 40 минут при КТ с равным объемом 25%-ного раствора глутарового альдегида при мягком перемешивании на ротационном встряхивателе (25 об/мин). По окончании инкубации смесь центрифугировали 5 минут при 1600g при КТ. Далее проводили хроматографию супернатанта на колонке с Sepharose CL-6B (объем геля 160 мл, колонка XK 16/40, элюирующий буфер: ЗФР, скорость элюции 80 мл/час) для удаления не связавшегося БСА и глутарового альдегида. Вышедшие в холостом объёме фракции, содержащие углеродные частицы объединяли и концентрировали до объема 4,5 мл. Для этого их переносили в диализный мешок диаметром 16 мм. Мешок помещали в пластиковую ванночку, заполненную фиколлом 400, и присыпали сверху дополнительным слоем фиколла. Ванночку ставили на качалку на 3-4 часа. Полученную концентрированную суспензию активированных глутаральдегидом углеродных частиц центрифугировали 5 минут при 1600g при КТ, супернатант использовали на третьем этапе синтеза.
3 этап. Активированную глутаральдегидом концентрированную суспензию объемом 4,5 мл инкубировали с 0,5 мл G белка с концентрацией 10 мг/мл в течение ночи на ротационном встряхивателе (25 об/мин) при 4С, после чего центрифугировали 5 мин при 1600g при КТ. Не связавшийся G белок удаляли гель-хроматографией на колонке с Sepharose CL-6B (объем геля 100 мл, колонка XK 16/40, элюирующий буфер: ЗФР, скорость элюции 80 мл/час). Вышедшие в холостом объёме фракции подвергали спектрофотометрическому исследованию. Для этого аликвоты объемом по 100 мкл помещали в лунки круглодонного 96-луночного планшета и регистрировали оптическую плотность при помощи планшетного ридера при 450 нм. Фракции с оптической плотностью выше 0,6 объединяли, добавляли БСА и глицерин до конечной концентрации 1% и 20% соответственно. Синтезированный конъюгат хранили при 4С.
Структурные свойства конъюгата оценивали методами измерения обратного динамического светорассеяния и спектрофотометрии. Функциональную активность диагностикума определяли по способности специфически связывать человеческий IgG, сорбированный на твердую фазу. Массовую долю углеродных частиц в суспензиях вычисляли, зная, что 0,03%-ная суспензия углеродных частиц имеет оптическую плотность 14 оптических единиц при длине волны 450 нм [21]. Расчетным рабочим титром диагностикума считали разведение, при котором концентрация углеродных наночастиц в конечном растворе составляет 0,03%.
Для оценки функционализированных углеродных частиц использовали метод измерения обратного динамического рассеяния света (ИОДРС) раствора конъюгата углерод-G белок под углом 173 при помощи программно-аппаратного комплекса Malvern ZetaSizer NanoZS. Суспензию углеродных частиц разводили в ЗФР до концентрации 0,01%. Показатель количества измерений в секунду («Count rate») находился в диапазоне 300-400 тыс.
Подбор оптимальных концентраций анти-лигандов и длительности инкубации с сыворотками крови
Далее тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и вносили в лунки на 30 мин по 150 мкл сывороток крови, разведенных 1:10 и 1:100 в соответствующем блокирующем растворе. По окончании инкубации с сыворотками тест-полоски вновь промывали и производили часовую детекцию антител при помощи 150 мкл углеродного диагностикума, разведенного в ЗФРТ до рабочего титра. Спустя час диски промывали ЗФРТ, высушивали и производили учет результатов.
Блокаторы оценивали по двум критериям: уровень сигнал/фон (по оптической плотности точек) и однородность фонового сигнала (отсутствие различий между окрашиванием фона в пределах как одной тест-полоски, так и различных тест-полосок). Для сравнения соотношения сигнал/фон суммировали оптические плотности точек и сравнивали полученные суммы для каждого блокатора. Однородность сигнала оценивали, рассчитывая коэффициенты вариации для фонового сигнала тест-полосок. Равномерность фонового сигнала, отсутствие пятен, разводов имеет немалое значение для удобства измерений, а также получение корректных и воспроизводимых результатов. При этом КВ для тест-полосок, которые инкубировали с разведениями сывороток 1:10 и 1:100 вычисляли отдельно.
На гистограмме суммированы данные по оптическим плотностям для каждого из блокаторов. В каждом случае наибольшее соотношение сигнал/фон было достигнуто при использовании БСА в качестве блокатора (Рисунок 13). Применение БСА также позволило добиться наибольшей однородности фонового сигнала: коэффициенты вариации были наименьшими как при разведении сывороток 1:10, так и 1:100, кроме единственного случая: детекции антител к коклюшному антигену в сыворотках крови, разведенных 1:10. В целом, стоит отметить, что при большем разведении сывороток крови разброс значений фонового сигнала снижался для БСА и сухого молока. Для казеина четкой закономерности выявлено не было (Рисунок 14).
После того, как БСА был выбран для дальнейшего использования в качестве белкового блокатора, мы проверили, будет ли эффективным увеличить концентрацию белка в блокирующем буфере. Мы повторили эксперимент, но на этот раз сравнивали между собой блокирующие растворы, содержащие 1, 2 и 4% БСА. Какого-либо эффекта от изменения концентрации белка нами выявлено не было. В последующих экспериментах в качестве блокирующего буфера использовали ЗФРТ, содержащий 1% БСА.
Концентрации анти-лигандов подбирали методом шахматного титрования и последующего сравнения полученных калибровочных кривых. Форму калибровочной кривой выбирали, исходя из того, что диагностически значимые точки должны находится на крутых участках калибровочных кривых, абсолютная разница в оптической плотности между ними должна быть как можно более велика, но при этом они должны попадать в диапазон максимально высоких оптических плотностей для улучшения воспроизводимости результатов. При этом следует учитывать тот факт, что в анализе желательно использовать большое разведение сыворотки крови для снижения влияния сывороточных белков на результаты теста. Кроме того, время инкубации с образцом должно быть одинаковым для каждого аналита, следовательно, конечный выбор будет представлять не идеальный, а компромиссный вариант, который позволит добиться приемлемых аналитических характеристик тест-системы в детекции каждого из аналитов.
Для проведения процедуры калибровки использовали международные стандарты столбнячного и дифтерийного антитоксинов с изначальными концентрациями 120 и 2 МЕ/мл соответственно. Стандарты представляют собой лиофильно высушенные препараты фракции IgG, полученные из пула человеческих сывороток. Данные стандарты используются при конструировании серологических тест-систем на дифтерию и столбняк.
Получение калибровочных кривых детекции коклюшных антител проводили при помощи пулов сывороток крови детей, вакцинированных цельноклеточной противококлюшной вакциной. Всего использовали 4 пула сывороток с титрами антител в реакции агглютинации 1:10, 1:40, 1:160 и 1:640. Каждый пул включал в себя по 200 мкл сыворотки от 10 детей с соответствующим титром противококлюшных антител. Полученные пулы были тщательно перемешаны и в каждый из них внесли по 1 мкл концентрированного раствора азида натрия в ЗФР. Конечная концентрация азида натрия составила 0,01%. Анализ на антитела к коклюшу мы планировали выполнить в качественном варианте (протективный титр 1:160: да/нет). Предварительные испытания, а также опыт предыдущих исследований свидетельствовали о том, что чувствительность детекции антител будет достаточна для работы с сыворотками крови в титрах не более 1:40-1:80. Именно поэтому подбор условий для детекции противококлюшных антител производили в пределах этих разведений.
На стрипы из нитроцеллюлозной мембраны в дублях сорбировали суспензию клеток коклюшного микроба в концентрациях 20, 10, 5 и 2,5 МОЕ. Суспензию разводили в ЗФР, объем наносимой на подложку суспензии составлял 3,5 мкл. Стрипы высушивали при комнатной температуре в течение двух часов и помещали в лунки планшета, изготовленного из ABS-пластика. После часового блокирования 150 мкл раствора 1% БСА в ЗФРТ тест-полоски трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и инкубировали со 150 мкл пулированных сывороток крови, разведенных в блокирующем растворе 1:20, 1:40 и 1:80 в течение 15, 30 и 60 мин. По окончании инкубации стрипы трехкратно промывали 300 мкл ЗФРТ и производили детекцию 150 мкл углеродного диагностикума в течение часа. Затем тест-полоски вновь промывали, высушивали и производили учет результатов (Рисунок 17).
При подборе наилучшей калибровочной кривой учитывали ее форму в диапазоне титров 1:40 – 1:160 – 1:640. Оптимальными условиями считали такие, при которых будет наблюдаться наибольшая разница абсолютных значений оптических плотностей для точек 1:40 и 1:640, а кривая будет наиболее равномерной. Степень равномерности оценивали по формуле Р=(ОП 1:640-ОП 1:160)-(ОП 1:160-ОП 1:40), чем меньше полученное число, тем более равномерный наклон кривой в целевом диапазоне. Значение обоих параметров иллюстрирует рисунок 15.
Оба графика 1 и 2 прирастают практически на одинаковую величину, однако кривая 1 имеет одинаковый наклон на всем протяжении (показатель Р=6,2), график 2 на первом отрезке пологий, а на втором круто возрастает (показатель Р=47,1). Наличие пологих участков приводит к низкой разрешающей способности анализа, поскольку разница в значениях оптической плотности между соседними точка становится сравнима с вариацией значений оптической плотности для отдельной точки.
Наилучшие результаты был получены при получасовой инкубации твердой фазы, на которую сорбирована суспензия клеток коклюшного микроба в концентрации 20 МОЕ, с сывороткой крови в разведении 1:40 (Рисунок 16).