Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Иммунный статус у недоношенных новорожденных: патогенез изменений, последствия и перспективные направления коррекции (обзор литературы) 13
1.1. Иммунный статус у недоношенных новорожденных 13
1.1.1. Врожденный иммунитет у недоношенных новорожденных 15
1.1.2. Адаптивный иммунитет у недоношенных новорожденных 20
1.1.3.Дизрегуляция иммунного ответа у недоношенных новорожденных 25
1.1.4. Геномные, эпигеномные, транскриптомные, протеомные изменения в иммунокомпетентных клетках у недоношенных новорожденных 30
1.2. Методы коррекции иммунного статуса у недоношенных новорожденных 32
1.3.Эритропоэтин: общая характеристика и плейотропные эффекты 34
1.4. Эритропоэтин у недоношенных новорожденных: диагностическое значение концентрации в крови и перспективы применения 39
Глава 2 Материалы и методы исследования 42
2.1. Дизайн исследования 42
2.2.Экспериментальная часть исследований 49
2.3. Методы исследования 51
2.3.1. Гематологические методы исследования 51
2.3.2. Иммунологические методы исследования 51
2.3.3. Статистические методы 60
Глава 3 Результаты собственных исследований и их обсуждение 61
3.1. Иммунный статус и некоторые механизмы его формирования у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела 61
3.1.1. Гематологические показатели и концентрация эритропоэтина 61
3.1.2. Количественный состав лейкоцитов 71
3.1.3. Показатели гибели лимфоцитов 78
3.1.4. Функциональная активность нейтрофилов 81
3.1.5. Цитокиновый профиль 84
3.2. Иммунный статус и некоторые механизмы его формирования у недоношенных новорожденных с низкой массой тела 87
3.2.1. Гематологические показатели и концентрация эритропоэтина 87
3.2.2. Количественный состав лейкоцитов 93
3.2.3. Показатели гибели лимфоцитов 99
3.2.4. Функциональная активность нейтрофилов 101
3.2.5. Цитокиновый профиль 104
3.3. Влияние эритропоэтина на формирование иммунного статуса у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела 106
3.3.1. Влияние эритропоэтина на гематологические показатели и концентрацию эритропоэтина 106
3.3.2. Влияние эритропоэтина на количественный состав лейкоцитов 110
3.3.3. Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов 115
3.3.4. Влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов 117
3.3.5. Влияние эритропоэтина на цитокиновый профиль 119
3.4. Влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов и показатели гибели лимфоцитов крови у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела в экспериментальных условиях invitro 121
3.4.1. Влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов 121
3.4.2. Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов 125
Заключение 130
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список используемых сокращений 143
Список литературы 145
- Адаптивный иммунитет у недоношенных новорожденных
- Гематологические показатели и концентрация эритропоэтина
- Количественный состав лейкоцитов
- Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Ежегодно в мире 15 миллионов новорожденных (11% от всех родов) рождаются недоношенными. В Российской Федерации частота рождения детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) в 2017 году составила 0,2%, по Уральскому федеральному округу - 0,31%, по Челябинской области - 0,35%, аналогичные показатели рождения детей с очень низкой массой тела (ОНМТ) составили соответственно 0,64%, 0,76%, 0,78% (Челябинский областной медицинский информационно - аналитический центр. Информационный сборник показателей деятельности медицинских организаций и здоровья населения Челябинской области за 2017 год. Челябинск. 2018. 84с.). Ежегодно в мире более 1 миллиона недоношенных новорожденных умирают из-за последствий инфекций, показатели неуклонно растут на протяжении последних 20 лет ( Shane, A.L., Stoll, B.J. et al. Neonatal sepsis: progress towards improved outcomes. Journal of Infection. 2014. Vol.68. suppl. 1. P. 24-32) [2]. Заболеваемость сепсисом у новорожденных обратно коррелирует с гестационным возрастом (Liu, L., Oza, S., Hogan, D. et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. Lancet. 2015. Vol. 385. №. 9966. P. 430-440; Oza, S., Lawn, J.E., Hogan D.R. et al. Neonatal cause-of-death estimates for the early and late neonatal periods for 194 countries: 2000-2013. Bull World Health Organ. 2015. Vol.93, №1. P. 19-28).
Иммунная система у недоношенных детей несет черты функциональной незрелости, что, с одной стороны, является основой фетоплацентарной толерантности, с другой – ослабляет антимикробный ответ организма и вносит значительный вклад в неонатальную заболеваемость и смертность от инфекционных заболеваний, в проспективном плане имеет значение в патогенезе неинфекционной патологии (Fanaroff, A.A., Stoll, B.J., Wright, L.L. et al. Trends in neonatal morbidity and mortality for very low birthweight infants. Am J Obstet Gynecol. 2007. Vol.196. P. 147-148). Сведения о количественном составе и функциональной активности эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета, регуляции иммунного ответа, изменении цитокинового профиля и концентрации эритропоэтина в сыворотке у недоношенных новорожденных различного гестационного возраста малочисленны и противоречивы (Baxter, D., Ghebrehewet, S., Welfare, W. et al. Vaccinating premature infants in a Special Care Baby Unit in the UK: results of a prospective, non-inferiority based, pragmatic case series study. Hum Vaccin. 2010. Vol.6. №.6. P. 512-520; Nussbaum, C., Sperandio, M. et al. Innate immune cell recruitment in the fetus and neonate. J Reprod Immunol. 2011. Vol.90. P. 74-81; Kollmann, T.R., Levy, O., Montgomery R.R. et al. Innate immune function by Tolllike receptors: distinct responses in newborns and the elderly. Immunity. 2012. Vol.37. №.5. P. 771-783; Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 2014. Vol.10. №.9. P. 1171-1184; Buschmann, K., Tschada, R., Metzger, M. S. et al. RAGE controls leukocyte adhesion in preterm and term infants. BMC Immunol. 2014. Vol. 15. P. 53; Debock, I., Flamand, V. Unbalanced Neonatal CD4(+) T-Cell Immunity. Front Immunol. 2014. Vol.5. P. 393; Li, Y., Wei, Q.F., Pan X.N. et al. Cellular and humoral immunity in preterm infants of different gestational ages. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2014. Vol.16. №.11. P. 1118-1121).
Результаты многоцентрового исследования ELGAN (Extremely Low Gestational Age
Newborn) у недоношенных детей показали ассоциацию между маркерами системного
воспалительного ответа (ИЛ-1b, ИЛ-6, ТНФ-альфа, ICAM-1, MMP-1, С-РБ, миелопероксидаза и
др., всего 25 показателей) и концентрацией эритропоэтина (ЭПО) в крови, а также между
гиперэритропоэтинемией и поражением ЦНС (Logan, J.W., Allred, E.N., Fichorova R.N. et al.
Endogenous erythropoietin varies significantly with inflammation-related proteins in extremely premature
newborns. Cytokine. 2014. Vol.69. №.1. P. 22-28; Korzeniewski, S.J., Allred, E., Logan, J.W. et al.
Elevated Endogenous Erythropoietin Concentrations Are Associated with Increased Risk of Brain
Damage in Extremely Preterm Neonates. PLoS One. 2015. Vol.10. №.3. P. e0115083). Установлены
нейропротекторные эффекты ЭПО у недоношенных детей, а также в экспериментальных условиях
invivo при моделировании повреждения ЦНС (Bierer, R., Peceny, M.C., Hartenberger, C.H. et al.
Erythropoietin concentrations and neurodevelopmental outcome in preterm infants. Pediatrics. 2006.
Vol.118. P. e635-640; Brown, M.S., Eichorst, D., LaLa-Black B. et al. Higher Cumulative Doses of
Erythropoietin and Developmental Outcomes in Preterm Infants. Pediatrics. 2009. Vol.124. P. E681-
E687; Neubauer, A.P., Voss, W., Wachtendorf, W.M. et al. Erythropoietin Improves Neurodevelopmental
Outcome of Extremely Preterm Infants. Annals of Neurology. 2010. Vol.67. P. 657-666; Ohls, R.K.,
Kamath-Rayne, B.D., Christensen, R.D. et al. Cognitive outcomes of preterm infants randomized to
darbepoetin, erythropoietin, or placebo. Pediatrics. 2014. Vol.133. №.6. P. 1023-1030). Раннее применение высоких доз эритропоэтина (3000 Ед/кг массы) у недоношенных новорожденных не вызывает увеличения смертности, осложнений, в том числе сепсиса, некротического энтероколита и бронхолегочной дисплазии (Fauchre, J.C., Koller, B.M., Tschopp A. et al. Safety of Early High Dose Recombinant Erythropoiet in for Neuroprotection in Very Preterm Infants. J Pediatr. 2015. Vol.167. №.1. P. 52-7.e1-3). Многочисленные клинические исследования свидетельствуют, что использование ЭПО может значительно снизить потребность в переливании крови у недоношенных новорожденных при анемии и предупредить ее возникновение (Jeon, G.W., Sin J.B. Risk factors of transfusion in anemia of very low birth weight infants. Yonsei Med J. 2013. Vol.54. №.2. P. 366-373; Aher, S.M., Ohlsson A. Late erythropoietin for preventing red blood cell transfusion in preterm and/or low birth weight infants. Cochrane Database Syst Rev. 2014. №.4. CD004868; Patel, S., Ohls R.K. Darbepoetin Administration in Term and Preterm Neonates. Clin Perinatol. 2015. Vol.42. №.3. P. 557-566).
Рецепторы для ЭПО представлены не только на эритроидных клетках костного мозга, но и на нейронах, глиальных клетках, кардиомиоцитах, клетках почек, эндотелиоцитах, клетках крови, в том числе Т- и В-лимфоцитах, моноцитах, дендритных клетках, что обусловливает наличие плейотропных эффектов ЭПО при различной патологии (Lisowska, K.A., Debska-Slizie, A., Bryl Bryl, E. et al. Erythropoietin receptor is expressed on human peripheral blood T and B lymphocytes and monocytes and is modulated by recombinant human erythropoietin treatment. Artif. Organs. 2010. Vol. 34. №.8. P. 654-662; Rocchetta, F., Solini, S., Mister, M. et al. Erythropoietin enhances immunostimulatory properties of immature dendritic cells. Clin Exp Immunol. 2011. Vol.165. Р. 202-210; Broxmeyer, H.E. Erythropoietin: multiple targets, actions, and modifying influences for biological
and clinical consideration. J Exp Med. 2013. Vol.210. №.2. P. 205-208; Zhang, Y., Wang, L., Dey, S. et
al. Erythropoietin action in stress response, tissue maintenance and metabolism. Int J Mol Sci. 2014.
Vol.15. №.6. P. 10296-333). Иммунотропные эффекты ЭПО продемонстрированы при
экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите, экспериментальной почечной
недостаточности, термической травме, церебральной ишемии и др. патологии (Осиков, М.В.,
Ахматов, К.В., Федосов, А.А. Дифференциация роли эритропоэтина и процедуры гемодиализа в
коррекции аффективных расстройств у больных хронической почечной недостаточностью.
Фундаментальные исследования. 2013. №.3-1. С. 138-142; Осиков, М.В., Телешева, Л.Ф., Агеев
Ю.И. Антиоксидантный эффект эритропоэтина при экспериментальной хронической почечной
недостаточности. Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 2015. Т.160. №.8. С. 162-165;
Осиков, М.В., Телешева, Л.Ф., Агеев Ю.И. Влияние эритропоэтина на апоптоз лимфоцитов при
экспериментальной хронической почечной недостаточности. Бюл. экспериментальной биологии и
медицины. 2015. №.3. С. 326-329; Осиков, М.В., Симонян, Е.В., Саедгалина, О.Т. Влияние
эритропоэтина на содержание продуктов перекисного окисления липидов в лимфоцитах при
экспериментальной термической травме. Казанский медицинский журнал 2015.Т. 96. №.5. С. 849-
853; Осиков, М.В., Телешева, Л.Ф., Ахматов В.Ю. и др. Патогенез изменений гомеостаза и
перспективные направления их коррекции при терминальной стадии хронической почечной
недостаточности. Москва: ГЭОТАР-Медиа. 2016. 240 с.; Jantzie, L.L., Getsy, P.M., Firl D.J., et al.
Erythropoietin attenuates loss of potassium chloride co-transporters following prenatal brain injury. Mol
Cell Neurosci. 2014. Vol.61. P. 152-162; Liu, Y., Luo, B., Han F. et al. Erythropoietin-derived
nonerythropoietic peptide ameliorates experimental autoimmune neuritis by inflammation suppression
and tissue protection. PLoS One. 2014. Vol.9. №.3. P. e90942).
Вышесказанное является предпосылкой для проведения исследований у недоношенных новорожденных раличного гестационного возраста по изучению изменений иммунного статуса и роли ЭПО в его коррекции.
Цель исследования - изучить показатели иммунного статуса у недоношенных новорожденных различного гестационного возраста, а также иммунотропные эффекты эритропоэтина у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела.
Задачи исследования
1. Исследовать гематологические показатели, концентрацию эритропоэтина, прокальцитонина в
сыворотке у недоношенных новорожденныхс экстремально низкой, очень низкой и низкой массой
тела.
2. Изучить в крови количественный состав субпопуляций лейкоцитов, лимфоцитов с признаками
некроза и апоптоза, функциональную активность нейтрофилов, цитокиновый профиль у
недоношенных новорожденных с экстремально низкой, очень низкой и низкой массой тела.
3. Исследовать влияние эритропоэтина на гематологические показатели, концентрацию
эритропоэтина, прокальцитонина в сыворотке у недоношенных новорожденных с экстремально
низкой и очень низкой массой тела.
-
Исследовать влияние эритропоэтина на количественный состав субпопуляций лейкоцитов, лимфоцитов с признаками некроза и апоптоза, функциональную активность нейтрофилов, цитокиновый профиль у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела.
-
Изучить в экспериментальных условиях invitro влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов, экспрессию маркеров некроза и апоптоза лимфоцитов крови у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела.
Методология и методы исследования
Методология диссертационной работы была построена в соответствии с поставленной целью и задачами. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России (протоколы №11 от 17.11.16, №10 от 25.05.17). От родителей новорожденных было получено письменное информированное согласие. Клинический фрагмент работы выполнен на 105 новорожденных в Клинике ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России в период с мая 2015 года по февраль 2017 года; экспериментальная часть исследований выполнена на цельной крови 20 недоношенных новорожденных (эксперименты invitro). Группа I (n=22) представлена доношенными новорожденными с гестационным возрастом 37 недель, группа II (n=30) -недоношенными новорожденными со сроком гестации от 27 недель до 31 недели и 6 дней и массой 800-1500г (экстремально низкой, очень низкой массой тела), группа III (n=33) -недоношенными новорожденными со сроком гестации от 32 недель до 36 недель и 6 дней и массой 1500-2500г (низкой массой тела). Группа II была разделена на две подгруппы в зависимости от методов лечения. В подгруппе IIа новорожденным назначено симптоматическое лечение, в подгруппе IIб, кроме этого, применяли эритропоэтин в составе препарата «Эпокрин» с 6 дня жизни в дозе 200 МЕ/кг через 48 часов в течение 12 суток, суммарная доза ЭПО - 1200 МЕ\кг.
В работе использованы гематологические, иммунологические методы для оценки
количественного состава клеток в крови, абсолютного и относительного количества субпопуляций
лейкоцитов в крови методом проточной цитометрии и системы «CytoDiff», функциональной
активности нейтрофилов крови, концентрации в плазме ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-, ЭПО, С-РБ,
ферритина, прокальцитонина. Полученные результаты обрабатывали с использованием пакета
прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows». Характеристика выборок представлена в
формате «Me (Q25 – Q75)», где Мe-медиана, Q25, Q75 – значение нижнего и верхнего квартиля
соответственно. Проверку статистических гипотез в группах новорожденных проводили с
помощью критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, Краскела-Уоллиса. Для оценки связи между показателями использован корреляционный анализ с расчетом коэффициента Спирмена. Отличия считали значимыми при р <0,05.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, правомочность основных положений и выводов основаны на достаточном числе наблюдении клинического фрагмента работы, полноте и широте литературно-библиографической справки, использовании современных методов статистической обработки материалов исследования с применением программ «Statistica 6.0 for Windows».
Основные положения диссертации представлены на XIV конференции иммунологов Урала с международным участием (Челябинск, 2017), XXIII Всероссииской конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы патофизиологии и биохимии – 2017» (Санкт-Петербург, 2017).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы, постановка цели и задач проводились совместно с научными руководителями. Формирование групп новорожденных, выбор методов, набор клинического материала, научно-информационный поиск, анализ и обобщение данных научной литературы, анализ и интерпретация полученных данных, статистическая обработка, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях, написание и оформление рукописи выполнены лично автором. Гематологические, иммунологические исследования выполнены автором лично и при участии научных сотрудников НИИ Иммунологии ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, клинико-диагностической и иммунологической лаборатории Клиники ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России.
Положения, выносимые на защиту
1. У недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела
зафиксированы признаки анемии, повышение концентрации эритропоэтина и интерлейкина-10 в
сыворотке, снижение в крови количества тромбоцитов, нейтрофилов, моноцитов, В- и Т-
лимфоцитов, Т-хелперов, NK-клеток, увеличение числа лимфоцитов с признаками апоптоза и
некроза, предшественников лейкоцитов; снижение поглотительной способности и кислород-
зависимого метаболизма нейтрофилов.
2. У недоношенных новорожденных с низкой массой тела в крови снижается количество
тромбоцитов и тромбокрит, концентрация ферритина, повышается концентрация прокальцитонина
и интерлейкина-10; снижается количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т и NK-
клеток, эозинофилов, зрелых и незрелых нейтрофилов, активность кислород-зависимого
метаболизма нейтрофилов.
3. Применение эритропоэтина у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень
низкой массой тела повышает в крови концентрацию гемоглобина, гематокрит, количество
эритроцитов и тромбоцитов, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов,
предшественников В- и Т-лимфоцитов, снижает в крови количество лимфоцитов с признаками
некроза и апоптоза, повышает активность фагоцитоза нейтрофилов; в эксперименте invitro
эритропоэтин у недоношенных новорожденных повышает поглотительную и нитросиний
тетразолий-редуцирующую способности нейтрофилов, снижает количество лимфоцитов с признаками некроза и апоптоза.
Научная новизна
Впервые показано, что у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела в крови снижается количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т и NK-клеток, нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, увеличивается количество предшественников В- лимфоцитов, Т-лимфоцитов, моноцитов; снижается поглотительная способность и внутриклеточный кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов; снижение в крови количества лимфоцитов ассоциировано с увеличением в крови количества лимфоцитов с признаками апоптоза и некроза. У недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела признаки анемии нарастают по мере снижения гестационного возраста, в крови снижается количество тромбоцитов, концентрация ферритина, повышается концентрация эритропоэтина, прокальцитонина, ИЛ-10. Выявлено, что у недоношенных новорожденных с низкой массой тела в крови снижается количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т и NK-клеток, эозинофилов, зрелых и незрелых нейтрофилов, активность кислород-зависимого метаболизма нейтрофилов; в крови снижается количество тромбоцитов и тромбокрит, концентрация ферритина, повышается концентрация прокальцитонина и ИЛ-10. Впервые установлено, что применение у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела с 6 суток жизни ЭПО в суммарной дозе 1200 МЕ/кг увеличивает в крови количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т и NK СD16- клеток, предшественников В- и Т-лимфоцитов, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, повышает поглотительную способность нейтрофилов крови. Увеличение количества лимфоцитов в крови, в том числе, обусловлено снижением в крови количества лимфоцитов с признаками некроза и апоптоза. Указано, что ЭПО у недоношенных новорожденных снижает концентрацию в сыворотке прокальцитонина и ИЛ-10. ЭПО в экспериментах invitro увеличивает поглотительную и НСТ-редуцирующую способность нейтрофилов, выделенных из крови недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела; снижает количество в крови лимфоцитов с признаками некроза и апоптозау недоношенных новорожденных с экстремально низкой массой тела.
Теоретическая и практическая значимость работы
В ходе проведенного исследования получены новые сведения об иммунном статусе и регуляции иммунного ответа у недоношенных новорожденных различного гестационного возраста, в том числе количества в крови В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, NK-клеток с фенотипом CD16- и CD16+, моноцитов с фенотипом CD16- и CD16+, нейтрофилов, незрелых гранулоцитов, предшественников В-и Т-лимфоцитов, моноцитов, лимфоцитов с признаками некроза и апотоза, функциональной активности нейтрофилов, концентрации ИФН -, ИЛ-4, ИЛ-10, прокальцитонина. Это позволит пополнить имеющиеся представления об иммунных аспектах патогенеза
инфекционной и неинфекционной патологии у недоношенных новорожденных. Данные о влиянии экзогенного ЭПО на показатели иммунного статуса у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела углубляют имеющиеся представления о плейотропных эффектах ЭПО и являются предпосылкой для проведения дальнейших экспериментальных и клинических исследований по изучению эффективности и обоснования применения ЭПО для коррекции иммунного статуса у недоношенных новорожденных.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в учебную работу кафедры Патологической физиологии, кафедры Микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры Факультетской педиатрии, в научную работу НОЦ «Проблемы фундаментальной медицины» ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России.
Публикации
Соискатель имеет 11 опубликованных работ, в том числе по теме диссертации - 11, из них 9публикаций в научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертации, 1 работа представлена в Материалах Всероссийской конференции, 1 статья в медицинском журнале.
Структура и объем и диссертации
Диссертация изложена на 179страницах, содержит 46 таблиц и 8 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 324 источника (15 – отечественных и 309 – зарубежных авторов).
Адаптивный иммунитет у недоношенных новорожденных
У плода имеется 2 подгруппы Т-клеток, экспрессирующих рецепторы / и /. Т-клетки с / рецепторами не мигрируют в тимус из печени плода, способны активировать дендритные клетки во время иммунного ответа на микробные антигены и являются предшественниками В-лимфоцитов [268, 275]. / Т-клетки мигрируют в тимус, где созревают и являются источником функционально и фенотипически незрелых последних эмигрантов тимуса (recent thymic emigrants, RTEs), в том числе CD4+ и CD8+ [99]. RTEs в присутствии ИЛ-7 дифференцируются в CD4+ [35]. Источником Th17 лимфоцитов у новорожденного является популяция CD161+CD4+.
Показатели клеточного и гуморального адаптивного иммунитета у недоношенных детей различного гестационного возраста с отсутствием инфекционной патологии снижены при сравнении с доношенными детьми. Иммунная функция постепенно улучшается с увеличением гестационного возраста. Количество CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, отношение CD4+/CD8+, сывороточная концентрация IgG снижаются при сравнении с группой доношенных детей, детей школьного возраста и взрослых [302]. Указанные показатели в группе недоношенных с гестационным возрастом от 34 до 37 недель были значительно выше, чем в группе новорожденных с гестационным возрастом от 28 до 34 недель [172]. У недоношенных детей с ЗВУР показатели клеточного иммунитета (CD3+, CD4+, CD4+/ CD8+) значительно снижены по сравнению с группой недоношенных без ЗВУР. Данные различия сохраняются только до 38 недель откорректированного гестационного возраста [233].
Недоношенные дети имеют очень низкое количество или отсутствие Th17 клеток. Полагают, что это может быть связано со снижением транскрипции гена RORS (RetinoicAcid-RelatedOrphanReceptorCgene) и синтеза транскрипционного фактора RORT.
Как правило, дифференциация Т-клеток в отношении Th17 или регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) является несовместимой и зависит от эффектов цитокинов (рисунок 2). У недоношенных детей наличие TGF- вместе с ИЛ-6, ИЛ-21 способствует трансформации Th0 в Th17, тогда как ИЛ-2 активизирует дифференцировку в Treg (CD4+CD8+FOXP3+), приводящих отрицательное влияние иммунного ответа и поддержание иммунологической аутотолерантности[322]. Количество Treg у недоношенных повышено как в крови, так и в лимфатических узлах[262, 118]. Недифференцированные Т-клетки (CD4+CD8-FOXP3-) плода обладают повышенной склонностью к дифференцировке в Treg в отклик на материнские антигены, диффундирующие через плаценту [208, 289].
Фолликулярные Т-хелперы (TFH), субпопуляция CD4+, регулируют пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов. Маркерами данных клеток являются Bcl6 CXCR5, PD-1, SAP (SH2D1A). Факторами пролиферации выступают ИЛ-4, ИЛ-21 и ИЛ-6 (CrottyS., 2014). Наряду с этим, TFH частично подавляют Th1, Th2, Th17. Ограничение пролиферации и дифференцировки TFH у новорожденных вносит определенный вклад в изменение иммунного ответа, а сами TFHпредставляют интерес при разработке неонатальных вакцин [82, 278].
Особенностями субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у недоношенных детей является увеличение количества Th9 клеток и продукции ИЛ-9. Плейотропные эффекты последнего участвуют в реализации аллергических реакций, пролиферации клеток, воспаления [143]. Показано, что неонатальные Th0 являются дефектными в их способности дифференцироваться в Th9 без участия TGF- и ИЛ-4 [178].
Указано на снижение функциональной активности и количества в крови недоношенных детей CD8+ лимфоцитов. Это обусловлено в том числе дефицитом синтеза ИЛ-12 [201] и взаимодействия с дендритными и другими АПК (рисунок 3). Дисфункция неонатальных CD8+ лимфоцитов определена нарушением их активации из-за снижения CD28-опосредованной костимуляции как результат снижения экспрессии CD80 и CD86 на АПК, а также изменения поглощения и процессинга антигена CD103+ дендритными клетками [260, 261]. В отличие от других субпопуляций Т-лимфоцитов цитотоксические CD8+ клетки новорожденных более состоятельны в функциональном плане и обеспечивают иммунный ответ на вирус-инфицированные, опухолевые клетки и вакцины [31].
Так, неэффективное фосфорилирование тирозинкиназы Lck, нарушения взаимодействия CD40 на АПК c костимулирующей молекулой CD154 на Т-лимфоцитах приводят, к снижению передачи сигнала с участием CR/CD3, индукции анергии, возможно из-за сильной экспрессии убиквитин лигаз. Так же ведут к снижению активности фосфолипазы С и впоследующем изращению синтеза ИЛ-2, ИФН-гамма. И приводят к нарушению переключения синтеза иммуноглобулинов в неонатальных В-клетках [227,240]. С использованием модели новорожденных мышей показано, что для дифференцировки и эмиграции Т-клеток имеют значение рецепторы для хемокинов CCR7 и CCL19. Так же лимфоциты с фенотипом CCR7+CD27+ могут быть использованы для типирования Т-клеток на ранней стадии специфического антигенного ответа[274, 293].
В-клетки недоношенных новорожденных имеют ограниченный репертуар иммуноглобулинов. В основном они представлены В-1, снижением экспрессии [111]. Неонатальные В1-клетки экспрессируют высокие уровни IgM (sIgM), низкие уровни IgD (sIgD) Они эффективно независимо от Т-клеток защищают организм новорожденного от таких бактериальных инфекций как Borreliahermsii и Streptococcuspneumonia[25, 115]. По другим данным, В-клетки новорожденных функционально дефектны и синтезируют недостаточное количество антител без дополнительной Т-клеточной костимуляции [145]. Целый ряд механизмов обеспечивают дефектные пути внутриклеточной сигнализации, зависимой от В-клеточного рецептора и низкий ответ В-клеток недоношенных новорожденных (рисунок 4). Во-первых, на поверхности неонатальных В-клеток снижена экспрессия CD21 и повышена экспрессия рецептора негативной регуляции CD22. Данный факт снижает интенсивность сигнализации от В-клеточного рецептора и индуцирует апоптоз [240]. Во-вторых, высокая плотностьIgM на клеточной мембране приводит к сшиванию их с молекулами В-клеточного рецептора. Имеющийся фактор снижает пролиферативный потенциал и взаимодействие с Т-лимфоцитами через HLA II[210]. Наконец, в неонатальных В-клетках липидная структура мембраны, фосфорилирование и экспрессияSrc-связанных киназ, в том числе p55fgr.Это предполагает изменение интернализации антигена [269].
У недоношенных детей наблюдается низкая концентрация в крови материнских IgG, которые в максимальном количестве поступают через плаценту после 32 недель беременности. Это поступление приводит к нарушению опсонизации антигенов и дефициту фагоцитоза [295].
C 1950-х гг. после знаменитых экспериментов сэра Питера Медавара неонатальный период рассматривается в качестве «окна возможностей» для индукции толерантности к конкретному антигену [37]. В 80-90-е гг. ХХ столетия после открытия субпопуляций Т-хелперов стало ясно, что восприимчивость новорожденных одновременно к инфекционным заболеваниям и аллергическим реакциям объясняется дихотомией иммунного ответа. Последствиями депрессии функции Th1 является восприимчивость новорожденных, особенно недоношенных к инфекционным агентам. Одновременно активация Th2 ответственна за предрасположенность к аллергическим реакциям [315].
Особенностями реализации Th2-зависимого иммунного ответа у недоношенных детей является быстрое (в течение 24 ч, а не 72 ч и более, как у взрослых) увеличение синтеза ИЛ-4,10,5,13 [258, 125]. Гиперактивация Th2 и избыточная продукция ИЛ-4 инициирует апоптоз Th1 и потенциирует поляризацию иммунного ответа в сторону Th2-зависимых реакций. Таким образом замыкаетсяcirculusvitiosus[315].
Гематологические показатели и концентрация эритропоэтина
Изначально проанализировали гематологические показатели у недоношенных новорожденных (таблицы 1, 2).
Не зафиксировано на 1 сутки у недоношенных новорожденныхдостоверных изменений количества эритроцитов, концентрации гемоглобина, гематокрита, среднего эритроцитарного объема, среднего содержания гемоглобина и средней концентрации гемоглобина в эритроците. Выявляется направленность к увеличению концентрации гемоглобина и гематокрита, которая скорее всеговызвана гемоконцентрацией в первые сутки жизни.
Вызывает интерес падение количества тромбоцитов и тромбокрита, они не превышают границы референсных значений для новорожденных детей [5]. Полученные данные могут быть связаны с ограничением тромбоцитопоэза и/или мекариоцитопоэза, повышением потребления тромбоцитов или ускорением разрушения тромбоцитов в кровотоке.
На 3 сутки у недоношенных новорожденных относительно доношенных исследуемые гематологические показатели оставались прежними , снижалось количество тромбоцитов, тромбокрита, увеличивался средний тромбоцитарный объем, ширина распределения тромбоцитов по размеру. Крупный размер тромбоцитов подтверждает об усилении синтеза тромбоцитов и выходе молодых.
Снижается количество эритроцитов на 8 сутки жизни у недоношенных новорожденных, так же снижается концентрация гемоглобина, гематокрит. Указанные показатели были снижены и относительно референсных значений для новорожденных [5]. Показатели, характеризующие размер эритроцитов (MCV), а также содержание гемоглобина в эритроците (MCHC, MCH) достоверно не различались. Данный факт свидетельствует о нормохромном и нормоцитарном характере анемии. На 8 сутки сохраняется снижение тромбоцитов, снижение тромбокрита, увеличение размера и ширины распределения тромбоцитов. На 18 день сохраняется прежние результаты.
Таким образом, у недоношенных новорожденных с экстремально низкой и очень низкой массой тела во все сроки наблюдения отмечается снижение количества тромбоцитов, тромбокрита, увеличение среднего размера тромбоцитов и ширины распределения тромбоцитов. На 8 сутки жизни зафиксирована нормоцитарная, нормохромная анемия.
Уменьшение количества тромбоцитов у недоношенных новорожденных подтверждает незрелость мегариоцитопоэза и/или тромбоцитопоэза. Пятикратное увеличение размера неонатальных тромбоцитов по сравнению с тромбоцитами взрослых людей может приводить к уменьшению срока жизни и повышенной элиминации из кровотока тромбоцитов [216].
Тромбопоэтин является основным регулятором мегакариоцитопоэза у новорожденных, который синтезируется в печени. У новорожденных, принято считать, способность синтезировать тромбопоэтинснижена в ответ на тромбоцитопению. Тромбоциты недоношенных дисфункциональны, У них нарушена адгезивная, агрегационная способности, дегрануляция и др. функции. Данный факт рассматривается как адаптационный механизм в условиях внутриутробного развития. Он не дает активизировать гемостаз при контакте с материнскими тканями [280, 98]. Анализ транскриптома показал онтогенетические особенности неонатальных тромбоцитов.[55]. Таким образом, у недоношенных детей наблюдаются качественные и количественные нарушения тромбоцитов периферической крови.
Тромбоциты имеют огромный спектр функций, в том числе регуляцию функций и кооперацию с иммунокомпетентными клетками.Поэтому тромбоцитопения может быть риском возникновения воспалительных осложнений [290, 284]. В частности, нейтрофилы становятся более активными за счет гена протромбоцитарного основного белка (РРВР) в тромбоцитах , который кодирует синтез тромбоцитарного фактора роста из семейства хемокинов СХС, который активирует [259, 152]. Указана роль тромбоцитов в регуляции функции Т-лимфоцитов, NK-клеток [146, 144]. Признаки нормохромной, нормоцитарной анемии у недоношенных новорожденных на 8 день , зафиксированные нами, являются проявлением анемии недоношенных новорожденных. Существует мнение, что почти все доношенные новорожденные имеют различной степени тяжести анемию.[21]. Для недоношенных новорожденных характерна более выраженная по степени тяжести анемия, чем у доношенных, концентрация гемоглобина может достигать значений 90 г/л и ниже [56].
Механизмы формирования анемии недоношенных включают: кровопотерю в результате забора крови для многочисленных лабораторных исследований (что особенно выражено в первые 2 недели жизни), нарушения эритропоэза и гемолиз в связи с небольшой продолжительностью жизни (40-60 суток) [141, 306, 307, 308, 206]. Снижение этого объема за счет перехода на использование методов с микрообъемами крови, использование пуповинной крови и др. являются приоритетными в неонатологии в плане профилактики анемического синдрома.
Дисэритропоэтический механизм может являться ведущим в развитии анемического синдрома в связи с низкой чувствительностью к гипоксии клеток продуцентов ЭПО в почках и в печени. Из-за нарушения баланса про- и антиоксидантных механизмов и активации пероксидации липидов в эритроцитарных мембранах,дефицит витамина Е вносит вклад в снижение продолжительности жизни эритроцитов у недоношенных.
Нами у недоношенных на 8 сутки жизни установлена прямая средней силы взаимосвязь между выраженностью анемии и гестацией недоношенных новорожденных: по эритроцитам (коэффициент корреляции Спирмена R=0,54; р 0,05), концентрации гемоглобина (R=0,51; р 0,05), гематокриту (R=0,57; р 0,05). По данным других исследователей также отмечается, что тяжесть анемии нарастает по мере снижения гестации[306, 285, 121].
Одним из факторов патогенеза AOP является дефицит железа [312]. Недостаток железа у недоношенных новорожденных обусловлен, прежде всего, тем, что транспорт и аккумуляция железа происходит на 80% в третьем триместре беременности при увеличении концентрации ферритина.И потомпосле рождения происходит сниженное поступления железа [247, 248].
Нами отмечено, что у недоношенных новорожденных во все сроки наблюдения концентрация ферритина в сыворотке снижается (таблицы 3, 4). Так, на 1 сутки концентрация ферритина по медиане снижается на 84% по сравнению с группой доношенных новорожденных, на 3 сутки – на 84%, на 8 сутки – на 65%, на 18 сутки – на 59%. По данным других исследований, ферритин является ключевым маркером запасов железа в организме и более информативен, чем концентрация сывороточного железа, зависящая от наличия воспалительного процесса, стресса, гемолиза и других факторов [137, 312].
Дефицит количества или эффектов ЭПО – еще один механизм формирования АОР. Сведения по концентрации сывороточного ЭПО у недоношенных новорожденных противоречивы [22]. Нами отмечено, что у недоношенных концентрация ЭПО в сыворотке достоверно возрастает на 1 сутки жизни в 11 раз, на 3 сутки – в 3,3 раза, на 8 сутки – в 4,4 раза, на 18 сутки – в 4,6 раза (таблицы 3, 4). Считаем, что данный факт является отражением включения компенсаторных механизмов в условиях гемической гипоксии и ответа острой фазы у недоношенных новорожденных.
ЭПО матери не проникает через плаценту в организм плода [183].
Принято, что эритропоэтическая активность ЭПО соответствует гестационному возрасту [266]. Эффекты ЭПО на предшественники эритроцитов в костном мозге ограничивают некоторые факторы как воспаление (С-РБ, ИЛ-6, ИЛ-2, эластаза плазмы), окислительный стресс и дефицит железа существенно [74, 75, 76]. В экспериментальных условиях на крысах установлено, что увеличение продукции ЭПО при скипидар-индуцированном воспалении обусловлено эффектами ИЛ-6 на гепатоциты и повышением экспрессии гипоксия-индуцированного фактора – 1альфа [246].
Нами проведена оценка концентрации С-РБ и прокальцитонина (ПКТ) в сыворотке у новорожденных (таблицы 5, 6). Как известно, у доношенных новорожденных уровень ПКТ и С-РБ в плазме повышены в ранние сроки после рождения [264, 292, 66]. В контрольной группе доношенных новорожденных концентрация ПКТ прогрессивно снижалась от 1 к 18 суткам после рождения, почти достигнув на 18 сутки жизни нормальных значений у взрослых (0,1 мкг/л). У недоношенных новорожденных концентрация ПКТ в сыворотке была статистически значимо: на 1 сутки – в 2 раза, на 3 – на 86%, на 8 – в 3,3 раза, на 18 – в 2,4 раза. Концентрация С-РБ у недоношенных новорожденных значимо увеличивалась только на 1 сутки жизни, на 3, 8, 18 сутки – достоверно не изменялась. Полученные нами изменения концентрации С-РБ и ПКТ у новорожденных подтверждают данные других исследователей. Они также отмечают высокую информационную ценность ПКТ, но не С-РБ при воспалительных и инфекционных процессах у недоношенных детей [100, 231].
Количественный состав лейкоцитов
При оценке количественного состава лейкоцитов в крови нами обнаружено, что на 1 сутки жизни у недоношенных новорожденных снижается общее количество лейкоцитов в крови (таблица 23). Концентрация Т-лимфоцитов в крови уменьшается за счет Т-хелперов, T- и NK-клеток СD16-. Общее количество нейтрофилов уменьшается как за счет зрелых форм нейтрофилов, так и за счет незрелых гранулоцитов.
На 3, 8, 18 сутки общее количество лейкоцитов не изменяется. На 3 сутки количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т- и NK-клеток не отличается от группы доношенных новорожденных (таблица 23). Статистически значимые отличия выявлены по общему количеству нейтрофилов, количеству зрелых нейтрофилов, незрелых гранулоцитов. На 8 сутки наблюдения общее количество лимфоцитов снижается за счет В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т- и NK-клеток. Кроме этого, снижается количество эозинофилов в крови (таблица 24). На 18 сутки жизни у недоношенных новорожденных обнаружено только снижение количества эозинофилов и базофилов, другие показатели по содержанию лейкоцитов в крови статистически значимо не отличаются от контрольной группы доношенных новорожденных (таблица 24).
Итак, у недоношенных новорожденных с низкой массой тела в крови снижается количество зрелых и незрелых нейтрофилов на 1 и 3 сутки жизни, снижается количество В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т- и NK-клеток, эозинофилов на 1 и 8 сутки жизни. Таким образом, увеличение гестационного возраста новорожденных с низкой массой тела по сравнению с недоношенными с экстремально низкой и очень низкой массой тела приводит к менее выраженным изменениям количественного состава лейкоцитов в крови и практически полному восстановлению количества различных популяций и субпопуляций лейкоцитов в крови на 18 сутки жизни.
Раннее в главе 3.1.2. нами было отмечено, что ведущими механизмами снижения количества лейкоцитов в крови у недоношенных новорожденных выступают снижение их продукции в костном мозге в условиях снижения продукции миелопоэз- и лимфопоэз активирующих цитокинов, активация гибели путем некроза и апоптоза.
Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов
Ранее зафиксировано, что применение ЭПО у недоношенных новорожденных ограничивает гибель лимфоцитов крови путем апоптоза и некроза на 8 сутки жизни. На данном этапе исследования нами в экспериментальных условиях in vitro проведена оценка влияния различных доз ЭПО на показатели гибели лимфоцитов, выделенных из крови недоношенных новорожденных экстремально низкой и очень низкой массы тела. Результаты представлены в таблицах 40, 41 .
Установлено, что у недоношенных новорожденных с очень низкой массой тела ЭПО в дозах 3,75 МЕ/л, 7,5 МЕ/л, 15 МЕ/л, 30 МЕ/л не оказывает статистически значимого влияния на количество интактных лимфоцитов, лимфоцитов с фенотипом раннего апоптоза, фентотипом позднего апоптоза и некроза. Инкубация в течение 30 мин суспензии лимфоцитов, выделенных из крови, с ЭПО в дозе 3,75 МЕ/л, 7,5 МЕ/л, 30 МЕ/л статистически значимо снижает абсолютное количество лимфоцитов с признаками раннего апоптоза, а также позднего апоптоза и некроза. Применение ЭПО в дозе 15 МЕ/л достоверно снижает только количество лимфоцитов с признаками раннего апоптоза, количество лимфоцитов с признаками позднего апоптоза и некроза значимо не изменяется. Наиболее выраженный эффект зафиксирован при использовании ЭПО в дозе 7,5 МЕ/л.
Таким образом, эффект ЭПО на экспрессию маркеров апоптоза и некроза в лимфоцитах, выделенных из пуповинной крови недоношенных новорожденных, зависит от степени недоношенности (т.е. структурно-функциональных изменений лимфоцитов) и дозы ЭПО. У недоношенных новорожденных с очень низкой массой тела ЭПО не оказывает влияния на показатели гибели клеток. В отношении лимфоцитов, выделенных из крови недоношенных ЭПО с максимальным эффектом в дозе 7,5 МЕ/л выступает в роли протекторного фактора, ограничивающего гибель клеток путем апоптоза и некроза.
Результаты главы опубликованы:
1. Осиков, М.В. Концентрация эритропоэтина в сыворотке у недоношенных детей / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 3. – Режим доступа : www.science education.ru/123-20129.
2. Осиков, М.В. Патогенез изменений и перспективные методы коррекции иммунного статуса у недоношенных новорожденных / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова // Вестник ЮУрГУ. – 2015. – Т.15, №4. – С. 30-36. – (Cepия«Oбpaзовaниe, здpaвooxpaнeниe, физичecкaя кyльтypa»).
3. Осиков, М.В. гематологические показатели у недоношенных новорожденных с очень низкой массой тела / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, И.А. Федоров // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – №5. – Режим доступа : http://science-education.ru/ru/article/view?id=25129.
4. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов в крови у недоношенных новорожденных с очень низкой массой тела / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, И.А. Федоров, Е.Ю. Ванин // Здоровье и образование в XXI веке. – 2016. – Т.18, №10. – С. 24-27.
5. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на гибель лимфоцитов крови недоношенных новорожденных в условиях in vitro / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, И.А. Федоров // Медицинская иммунология. – 2017. – Т.19, № 3. – С. 246-247.
6. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на цитокиновый профиль крови у недоношенных новорожденных / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова // Медицинская иммунология. – 2017. – Т.19, № 3. – С. 245-246.
7. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на показатели клеточного иммунитета у недоношенных новорожденных от ранних преждевременных родов с использованием системы cytodiff / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, С.В. Квятковская // Рос. иммунологический журнал. – 2017. – Т. 11(20), № 3. – С. 452-454.
8. Осиков, М.В. Количественный состав субпопуляций и гибель лимфоцитов в крови у недоношенных новорожденных от преждевременных родов / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова // Аллергология и иммунология. – 2017. – Т.18, № 1. – С. 58.
9. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность нейтрофилов крови недоношенных новорожденных в эксперименте invitro / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, Л.В. Воргова // Рос. иммунологический журнал. – 2017. – Т. 11(20), № 2. – С. 182-185.
10. Осиков, М.В. Ассоциация некоторых цитокинов и эритропоэтина в крови у недоношенных новорожденных / М.В. Осиков, О.Н. Альмухаметова, Федоров И.А. // Новости Вектор-Бест. – 2017. – № 4 (86). – С. 9-13.
11. Листик, Е.В. Популяционный состав и показатели гибели лимфоцитов у недоношенных новорожденных с очень низкой массой тела / Е.В. Листик, О.Н. Альмухаметова // Актуальные проблемы патофизиологии и биохимии – 2017 [Электронный ресурс] : Сборник тезисов XXIII Всероссийской конференции молодых учных с международным участием, Санкт-Петербург, 13-14 апреля 2017 г. / под ред. Т.Д. Власова, В.И. Николаева, И.Л. Соловцовой. – СПб.: РИЦ ПСПбГМУ, 2017. – С. 120-122.