Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Сигнальные механизмы индукции синтеза ИФН 17
1.1.1 Рецепторы врождённого иммунитета TLRs, RLRs и NLRs 17
1.1.2 ДсРНК-зависимые пути активации генной транскрипции 24
1.1.3 Факторы транскрипции IRFs и NFkB 24
1.2 Сигнальные пути действия ИФН I, II и III типов .31
1.2.1 Рецепторы ИФН 31
1.2.2 Регуляция транскрипции генов гамма-ИФН 33
1.2.3 Активаторы транскрипции JAK-STATs 34
1.3. Гены и белки индуцированные ИФН и дсРНК .36
1.3.1 ДсРНК-зависимая протеинкиназа (дсПК - PKR) 38
1.3.2 Антивирусная система ферментов ОАS/RNasel .41
1.3.3 Белки ISG15, индуцированные ИФН 1.4 РНК-интерференция и фермент Dicer 45
1.5 Взаимосвязь системы ИФН с апоптозом 1.5.1 Рецепторный Fas-зависимый апоптоз 47
1.5.2 Митохондриальный Bcl-зависимый апоптоз 49
1.5.3 Сигнальные механизмы индукции апоптоза ИФН и дсРНК 51
1.5.4 Противоопухолевое действие ИФН и дсРНК 53
1.6 Резюме 58
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Рекомбинантные человеческие ИФН 59
2.1.2 Индукторы ИФН 59
2.1.3 Гриппозные вакцины 59 2.1.4 Вирусы 60
2.1.5 Клетки и клеточные культуры .60
2.1.6 Химические реактивы 62
2.1.7 Олигонуклеотидные ПЦР-праймеры 63
2.1.8 Лабораторное оборудование 63
2.2 Методы
2.2.1 Выделение РНК 64
2.2.2 Реакция обратной транскрипции (ОТ) 64
2.2.3 ПЦР - полуколичественный вариант 64
2.2.4 ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) 65
2.2.5 Расчёты уровней экспрессии генов 65
2.2.6 Иммуноферментный анализ (ИФА) 66
2.2.7 Титрование ИФН по противовирусной активности 66
2.2.8 Реакция нейтрализации активности ИФН 67
2.2.9 Размножение вирусов 67
2.2.10 Определение инфекционного титра вирусов по ЦПД .67
ГЛАВА 3. Результаты исследований
3.1 Конститутивные уровни экспрессии генов рецепторов врождённого иммунитета и активаторов транскрипции в клетках крови человека... 68
3.2 Стимуляция препаратами ИФН типа 1 экспрессии генов рецепторов врождённого иммунитета 69
3.3 Сравнение действия препаратов рекомбинантных ИФН типа 1 на экспрессию генов системы ИФН и апоптоза в нормальных и опухолевых клетках 70
3.4 Феномен супериндукции генов «домашнего хозяйства» в опухолевых клетках 77
3.5 Действие на вирусы рекомбинантного альфа2-ИФН 81
3.5.1 Вирус гриппа А H1N1 (Москва, 2009) 81
3.5.2 Вирус Карельской лихорадки (ВКЛ LEIV9298) 84 3.5.3 Активность генов ферментов системы ИФН в клетках обработанных Реафероном и заражённых ВКЛ .88
3.6. Стимуляция препаратами индукторами ИФН разной природы генов рецепторов врождённого иммунитета, системы ИФН и апоптоза
3.6.1 Ридостин (Рибонуклеат натрия) 90
3.6.2 Ридостин как иммуноадьювант гриппозных вакцин .94
3.6.3 Циклоферон 97
3.6.4 Иммуномакс 100
3.7. Индивидуальные реакции генов TLRs, RLRs и ИФН-генов на препараты 101
3.8.1 Кагоцел как индуктор генов системы ИФН и цитокинов у пациентов (сравнение с Ридостином ) .109
3.8.2 Кагоцел и Ридостин как регуляторы генов апоптоза 117
3.9 Нарушения экспрессии генов системы ИФН у больных бронхиальной астмой
4. Обсуждение результатов 120
5. Заключение 141
6. Выводы 143
7. Список используемой литературы
- Факторы транскрипции IRFs и NFkB
- Рекомбинантные человеческие ИФН
- Стимуляция препаратами ИФН типа 1 экспрессии генов рецепторов врождённого иммунитета
- Кагоцел как индуктор генов системы ИФН и цитокинов у пациентов (сравнение с Ридостином )
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности
Система интерферона (ИФН) является важнейшей составляющей врождённого
иммунитета и активатором реакций адаптивного иммунитета [A.Iwasaki, R.
Medzhitov, 2010; P.M. George et al., 2012]. Изучение механизмов ее
функционирования на молекулярном, клеточном и организменном уровнях
представляет большой научный интерес. Препараты ИФН и индукторы ИФН
имеют общую функциональную направленность в действии и, дополнительно,
могут проявлять прямое антивирусное действие [Ф.И. Ершов, О.И. Киселёв, 2005;
R.E. Randall, S.Goodbourn, 2008]. Большое значение имеют иммуноадьювантные
свойства этих препаратов [Bo Jin et al., 2010]. ИФН и их индукторы применяют в
лечении ряда видов опухолей (меланома, лимфомы и лейкозы [L.Zitvogel et al.,
2015]. Взаимодействие разных молекулярных структур с рецепторами
врождённого иммунитета TLRs и RLRs приводит к активации сигнальных путей индукции синтеза ИФН и провоспалительных цитокинов. Эти процессы описаны в литературе как сигнальная трансдукция [Horscroft et al., 2012; S.N. Lester a. K., 2013].
Поиск чувствительных мишеней на рецепторном уровне является одним из
основных способов создания новых эффективных антивирусных и
антибактериальных препаратов и индукторов ИФН [M.J. Paul-Clark, 2012]. Знания о действии ИФН на систему врождённого иммунитета и клеточную регуляцию необходимы для создания усовершенствованных форм иммунобиологических препаратов и расширения спектра их применения в медицинской практике.
Исследования отечественных препаратов ИФН и их индукторов на протяжении
многих лет проводятся в Отделе интерферонов НИИ эпидемиологии и
микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи и в НИИ вирусологии Д.И. Ивановского (с 2014
г. Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и
микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). Отечественные ИФН и их индукторы в настоящее время широко применяются как профилактические и лечебные противовирусные и иммуномодулирующие препараты [Ф.И Ершов с соавт., 2005]. Молекулярно-генетическая характеристика действия отечественных ИФН и их индукторов является актуальной задачей. Особый интерес представляет сравнительный анализ их действия на транскрипцию генов TLRs и RLRs, факторов транскрипции, генов системы ИФН и апоптоза в нормальных и опухолевых клетках человека с нарушенной клеточной регуляцией.
ИФН I, II и III типов присущи выраженные противовирусные, иммуномодулирующие, антипролиферативные и противоопухолевые активности, [D. E. Levy et al., 2011; K. Gilbert et al., 2013]. Показана клиническая эффективность рекомбинантных ИФН и индукторов ИФН разной химической структуры в профилактике и лечении вирусных и бактериальных инфекций, изучены основные закономерности продукции и действия ИФН в культурах клеток и у экспериментальных животных. Однако знания о молекулярных
механизмах действия отечественных препаратов на генном уровне до сих пор очень ограничены. Для создания современного, эффективного, противовирусного и иммуномодулирующего препарата необходимо показать его влияние на многие клеточные гены, участвующие в процессах врожденного иммунитета.
Цель работы: Изучение ИФН-зависимого антивирусного и
иммуномодулирующего действия препаратов различной химической структуры на гены системы врожденного иммунитета в клетках человека.
Основные задачи проведенных исследований сводятся к:
1) Определению действия рекомбинантных ИФН на транскрипционную
активность генов рецепторов TLRs/RLRs, системы ИФН, апоптоза и
регуляторных интерлейкинов (ИЛ) в нормальных и опухолевых клетках человека. 2) Оценке антивирусного действия рекомбинантного альфа2-ИФН в отношении штаммов вирусов в клетках крови:
- пандемического гриппа А H1N1 (Москва, 2009) по влиянию на транскрипцию генов TLR-рецепторов врожденного иммунитета;
- вируса Карельской лихорадки (ВКЛ LEIV9298) по продукции инфекционного вируса и индукции генов ИФН-зависимых ферментов системы ИФН.
-
Изучению действия известных индукторов ИФН разной химической структуры на транскрипционную активность генов TLR/ RLR – рецепторов, генов системы ИФН и факторов транскрипции (IRF3/7, NF-kB, p53).
-
Выявлению иммуноадьювантных свойств рибонуклеата натрия в комбинации с субъединичными вакцинами Гриппол и Инфлювак на генном и цитокиновом уровнях в культуре клеток крови.
Научная новизна
Впервые на генном уровне изучен механизм действия рекомбинантных ИФН и индукторов ИФН, широко применяемых в отечественной медицине для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций.
Получены новые данные о стимулирующем влиянии рекомбинантных альфа2-ИФН (Реаферон), Рибонуклеата натрия (Ридостин), меглюминакриданон ацетата (Циклоферон) и растительного пептидогликана (Иммуномакс) на гены рецепторов сигнальных путей иммунного ответа.
- На модели клеток крови человека продемонстрированы иммуноадьювантные
свойства препарата Рибонуклеата натрия с субъединичными вакцинами Гриппол,
Инфлювак.
- Впервые обнаружено свойство растительного пептидогликана активировать
гены TLR/RLR рецепторов, универсальных факторов транскрипции р53 и NFkB
и гены ИФН типа 1 в клетках человека.
Впервые исследованы экспериментальные образцы растительного и бактериальных альфа2-ИФН, разработанные в РОНЦ им. Н.П. Блохина на опухолевых клетках аденокарциномы человека в сравнении с фибробластами человека (Кособокова и др., 2013).
Обнаружен феномен супериндукции генов “домашнего хозяйства” в опухолевой линии клеток HCT-116 в ответ на рекомбинантные ИФН типа 1.
- Впервые показана репродукция ВКЛ (LEIV9298) в клетках крови человека, возможность выявления его РНК методом ОТ-ПЦР. Установлены механизмы антивирусного действие рекомбинантного альфа2-ИФН в отношении вирусов гриппа А (H1N1,Moscow,pdm09), связанные с ростом экспрессии генов рецепторов врождённого иммунитета (TLR3, TLR7), и альфавируса ВКЛ - с индукцией генов ферментов системы ИФН (ОАС1 и дсПК).
Теоретическая и практическая значимость работы
На модели клеток крови человека проведен сравнительный молекулярно-генетический анализ действия применяемых в России медицинских препаратов с помощью количественного ОТ-ПЦР. Метод стимуляции препаратами экспрессии TLR-генов предлагается для скрининга и оценки эффективности препаратов ИФН и индукторов ИФН. Выявлена индивидуальная чувствительность клеток и этот метод предлагается для оценки эффективности иммунного ответа как более специфический и менее затратный в дополнение к биологическому тестированию.
Впервые исследованы экспериментальные образцы рекомбинантных альфа2-ИФН, разработанные в РОНЦ им. Н.П. Блохина (Кособокова и др., 2013). Особый интерес представляет сравнительный анализ изученных препаратов индукторов ИФН (дсРНК и осРНК, ДНК-связывающий агент акриданон, растительный пептидогликан) на экспрессию генов системы ИФН и апоптоза в нормальных и опухолевых клетках человека с нарушенной регуляцией генов системы ИФН и апоптоза. Входящие в состав изученных препаратов индукторов ИФН молекулярные структуры (дсРНК и осРНК, ДНК-связывающий агент акриданон, растительный пептидогликан), согласно данным литературы, весьма вероятные лиганды рецепторов врождённого иммунитета. Полученные транскрипционные характеристики химических соединений в составе отечественных препаратов раскрывают их ИФН-индуцирующий и антивирусный потенциал, показывают отличия в механизмах действия на сигнальные пути врождённого иммунитета.
На основании полученных данных разработаны Методические
рекомендации: «Оценка стимуляции интерферонами, индукторами интерферонов и вакцинами экспрессии TLR-генов в пробах крови человека методом ОТ-ПЦР в реальном времени», утверждённые на «Совете по внедрению перспективных научных разработок в практику здравоохранения и серийное производство» ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 02 февраля 2015 г.
Методология и методы исследования
Проведение системного анализа экспрессии генов врожденного иммунитета и
противовирусного ответа использовано для оценки влияния препаратов на
метаболизм клеток. Методологической основой диссертационного исследования
послужили экспериментальные и специфические методы исследования:
иммунологические, молекулярно-биологические, генетические,
вирусологические, культуральные, биоинформационные и статистические. Исследования проводились на современном сертифицированном оборудовании.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Рекомбинантные ИФН альфа-2b, бета-1а, а так же образцы новых
рекомбинантных ИФН альфа-2b стимулируют транскрипцию генов рецепторов
TLRs и ИФН – зависимых ферментов в клетках человека.
2. Изучаемые ИФН альфа-2b оказывают противовирусное действие на
пандемический вирус гриппа А H1N1 (Москва, 2009) и вирус Карельской
лихорадки (ВКЛ LEIV9298).
-
Индукторы ИФН (рибонуклеат натрия, меглюминакридонацетат) и растительный иммуномодулятор (пептидогликан), оказывают стимулирующее действие в отношении TLR/ RLR – рецепторов и генов системы ИФН.
-
Рибонуклеат натрия в комбинации с субъединичными гриппозными вакцинами Гриппол и Инфлювак проявляет иммуноадъювантные свойства в виде стимулятора транскрипции TLR3-гена и индуктора синтеза ИФН типа 1, 2.
5. Разработана транскрипционная оценка экспрессии TLRs и ИФН – генов в
пробах крови человека методом ОТ-ПЦР в реальном времени, для скрининга
и изучения иммунобиологических и противовирусных препаратов.
Степень достоверности и апробация результатов
Научные результаты изложенные в диссертации, документально подтверждены
экспериментальными данными и опубликованы в открытой печати. В разделе
«Обсуждение» полученные результаты сопоставлены с современными данными
литературы по механизмам регуляции врождённого иммунитета и
противовирусного ответа. Проведена экспериментальная проверка
специфичности олигонуклеотидных праймеров.
Результаты диссертационной работы были доложены: Межрегиональный форум «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012 г.); Конференция молодых ученых ФГБУ НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи (Москва 2014 г.); Научно–практическая конференция – биеннале
«Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2014 г.). Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной конференции отделов Иммунологии, Интерферонов и Молекулярной вирусологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 3 декабря 2015 г.
Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано 13 научных статей в журналах, рекомендованных ВАК, 1 сообщение в Сборнике «Интерферон 2011» и в материалах международных конференций.
Объем и структура работы
Факторы транскрипции IRFs и NFkB
Многие мембранные TLR- рецепторы (1, 2, 4, 5, 6) передают сигналы через миелоидный белок MyD88, играющий ключевую роль в активации фактора транскрипции NF-kB и активации им генов воспалительных цитокинов.
Дополнительно, для TLR4, открыт TRIF-зависимый путь, осуществляемый с участием фактора IRF3, который приводит к синтезу ИФН типа 1 [Black K.E. et al., 2013]. Внутриклеточные TLR-рецепторы в эндосомах узнают разные формы чужеродных нуклеиновых кислот, в т.ч. отличающиеся по структуре от клеточных РНК и ДНК вирусов и бактерий. Эти рецепторы также делятся на MyD88-зависимые (TLR7 и TLR9) и TRIF-зависимый (TLR3). В случае взаимодействия TLR3 с дсРНК активируется фактор транскрипции IRF3 и индуцируется ИФН-бета. В случае связывания с TLR7 с осРНК вирусов и TLR9 с CpG-ДНК индуцируется фактор транскрипциии IRF7 и индуцируется альфа-ИФН [Diebold S.S., 2008]. Важно отметить, что с TLR-рецепторов плазматической мембраны преимущественно регулируются гены воспалительных цитокинов с участием фактора NFkB. В результате активации TLR3-сигнального каскада, наряду с геном ИФН-бета, дополнительно индуцируются гены IL10 и ISG15. При вирусной инфекции в индукции генов ИФН-альфа и провоспалительных цитокинов показана регуляторная роль фактора IRF5, ИЛ1-бета и ФНО-альфа [Boo K-H., Yang J-S., 2010]. Между сигнальными путями с разных TLRs возможны перекрёстные взаимодействия [Brown J.H. et al., 2011].
Для выявления внутриклеточных РНК-структур патогенов важное значение имеют, наряду с эндосомальными TLRs, цитоплазматические рецепторы -хеликазы семейства RLRs (RIG — like receptors) [Wilkins C., Gale M. Jr, 2010; Baum A., Garcia-Sastre, 2010]. Функциональные домены в их составе представлены на рисунке 3. Рисунок 3. Структура семейства RLRs (RIG-1, MDA5 и LGP2).
В центре локализован хеликазный домен, связывающий РНК. На С-конце расположен регуляторный домен, контролирующий процесс связывания, и на N – конце имеется важный для взаимодействия каспазный домен CARD. С участием RLRs-рецепторов осуществляется митохондриальный путь передачи сигналов. RIG-I взаимодействует с вирусной 5 ррр – осРНК лигандом и короткими дсРНК. MDA5 чаще связывает длинные дсРНК. LGF2 выполняет регуляторные функции. В результате активируется митохондриальный фактор IPS1 (также известный как MAVS) и транскрипционные факторы IRF3 и NF-kB, вызывающие индукцию генов ИФН типа 1и провоспалительных цитокинов. Синтезируемый ИФН секретируется из зараженных вирусом клеток и взаимодействует со специфическими рецепторами. Включаются сигнальные Jak/Tyk–STAT1/2 этапы индукции экспрессии ИФН-стимулируемых генов (ISG) (рисунок 4).
В таблице 1 суммированы данные о TLRs и RIG1 рецепторах врождённого иммунитета, которые узнают вирусные структуры и считаются лучшими мишенями для противовирусной терапии. Таблица 2. TLRs и RIG1 узнающие вирусные структуры [Horscroft N.J. et al., 2012]. PRR Virus Component recognized TLR2 MV haemagglutinin protein TLR3 RNA and DNA viruses dsRNA TLR4 RSV, VSV envelope proteins, glycoproteins TLR7/ 8 RNA viruses: HCV, FluV ssRNA TLR9 DNA viruses: HSV CpG DNA RIG-I RNA viruses: NDV, SV, VSV, FluV, MV dsRNA, ssRNA with a 5riphosphate Вирусы: MV- корь; RSV- респират. синцит; HCV-гепатит С; FluV- грипп; HSV - простого герпеса; NDV-болезни Ньюкасла; SV-Сендай.
Сигнальные пути RLRs при вирусной инфекции [Wilkins C. a. Gale M. Jr, 2010]. К цитоплазматическим сенсорам патогенов относятся и семейство NLRs рецепторов, узнающих фрагменты пептидогликанов (ПГ) грамположительных и грамотрицательных бактерий [Сorrea R. G. a, 2012]. Грамотрицательные бактерии взаимодействуют с NOD1, а грамположительные - с NOD2 и распознают бактерии, освобождающиеся из эндосомного пространства в цитоплазму клеток (рисунок 5). Активация рецепторов идет по 2-м путям с участием факторов NF-kB/АР1 и MAVS/IRF. Бактериальные ПГ и их производные пептиды (iE-DAP и MDP) связываются соответственно с NOD1 или NOD2 рецепторами через LRR домен. Эти взаимодействия индуцируют в них конформационные изменения, приводят к формированию олигомеров и дальнейшему взаимодействию рецепторов с многими эффекторными киназами. Активация NOD – рецепторов с помощью бактериальных продуктов инициирует связывание белка RIP2 с фактором TRAF3 и это индуцирует активацию киназ TBK1/IKK. За этим следует активация транскрипционного фактора IRF7 и индукция гена ИФН-бета. Недавно получены данные о способности вирусной осРНК взаимодействовать с NOD2 с участием фактора TRAF3. Далее происходит связывание с митохондриальным белком MAVS и активация IRF3-активатора промотора гена бета-ИФН. NOD2-дефeктная мышь не может синтезировать ИФН и имеет повышенную чувствительность к вирусам. Все это показывает важную роль NOD2 в антивирусной защите [Sabbah A. et al., 2009].
Рекомбинантные человеческие ИФН
РНК-интерференция - это важная составляющая врожденного иммунитета к вирусным патогенам, обеспечивающая антивирусный ответ при вирусной инфекции [Aliyari R., Ding S.W., 2009; Kariko K. et al., 2004]. Система РНК-и защищает клеточный геном от вирусного воздействия и проникновения мобильных генетических элементов путем деградации экзогенного геномного материала (в т. ч. вирусных РНК). Контроль РНК-и осуществляется на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. В настоящее время роль РНК-и в антивирусном ответе активно изучается. На протяжении последних лет достигнут значительный прогресс в знаниях о специфических механизмах регуляции генной активности в живых организмах с участием РНК-и [Cullen B.R., 2006]. Внутриклеточное образование и накопление дсРНК-структур осуществляется при транскрипции клеточного и вирусного геномов и контролируется семейством РНКазы III, известной как DICER. МиРНК (малые ингибиторные или small inhibitory - siRNA) образуются после деградации ферментом Dicer (семейство РНКазы III) длинных дсРНК транскриптов, интегрированных в геном транспозонов, или других типов РНК-инвертированных повторов, а также вирусных дсРНК или синтетических дсРНК, трасфецированных в клетки. МиРНК полностью комплементарны мРНК-мишеням [Ji X., 2009].
Наличие высококонсервативного фермента Dicer у многих организмов дает основание полагать, что РНК-и имеет общее эволюционное происхождение. Мутации в гене белка Dicer ослабляют клеточный иммунитет и могут быть летальными для организмов. Поэтому РНК-и жизненно необходимый механизм генной регуляции. Два белка TRBP и PACT, регулирующие активность дсРНК-протеинкиназы, взаимодействуют с Dicer и усиливают расщепление дсРНК и предшественников микроРНК. PAZ-домен Dicer действует как дсРНК-связывающий, узнающий 2-нуклеотидный выступ на 3 -конце миРНК. Внутриклеточные уровни РНКазы Dicer варьируют в разных типах клеток и изменяются при стрессовых воздействиях. ИФН регулируют активность фермента [Wiesen J.L., Tomasi T.B., 2009].
Воздействие на клетки длинных дсРНК и ИФН 1-го типа подавляет внутриклеточный синтез Dicer-белка, что может ослаблять механизм РНК-и. Система РНК-и и система ИФН работают в клетках одновременно и направлены на контроль процессов транскрипции и трансляции мРНК с участием специфических и неспецифических механизмов [Sledz C.A., 2003; Соколова Т.М., Ершов Ф.И., 2011].
Среди сотен ИФН-стимулированных генов обнаружена специальная группа с апоптотическими функциями [Chawla-Sarkar M. et al., 2003]. Апоптотические эффекты играют важную роль в дифференцировке и элиминации клеток, имеющих генетические повреждения или бесконтрольно делящихся [Hergartner M.O., 2000]. Особое значение этот процесс приобретает при вирусной или бактериальной инфекциях, когда путем элиминации инфицированных клеток достигается защитный эффект [Galluzzi et al., 2008, 2010]. В опухолевых клетках механизмы апоптоза подавлены либо в результате отсутствия экспрессии гена FasAg/FasL или высоких уровней синтеза Bcl-2 [Thyrell L. et al., 2002].
Инициация апоптоза зависит от вида апоптотического стимула (специфический лиганд или стрессовое воздействие), но последующие каспазные этапы развития процессов клеточной гибели во многом подобны (рисунок 18). Внешний апоптотический путь включает активацию рецепторов смерти на клеточной поверхности, формируется комплекс DISC (death-inducing signaling complex), за которым следует каспазный каскад и активация нуклеаз, приводящие к клеточному разрушению. Различные проапоптотические стимулы (повреждение ДНК, стрессовые воздействия, вирусная инфекция) инициируют внутренние пути, усиливающие митохондриальную мембранную проницаемость (MMP - mitochondrial membrane permeabilization). В результате этого внутримембранные белки освобождаются в цитоплазму, митохондриальный трансмембранный потенциал (Dym) падает до 0, развивается биоэнергетический кризис, сочетающейся с активацией каспаз и завершающей апоптозом. Два пути апоптоза (рецепторный и митохондриальный) связаны с ВН3 содержащим белком Bid, который активируется каспазой 8 в форме tBid. Этот белок нарушает защитные мембранные функции антипролиферативного митохондриального белка Bcl-2 и вызывает освобождение цитохрома С в цитоплазму.
Стимуляция препаратами ИФН типа 1 экспрессии генов рецепторов врождённого иммунитета
Индивидуальная чувствительность к препаратам ИФН и их индукторам представляет серьезную медицинскую проблему. Причины различий в индивидуальном ответе людей на лекарства в большинстве случаев остаются неизвестными.
В нашей работе в сравнительном плане изучено действие препаратов и Генфаксон, Циклоферон и Иммуномакс на TLRs и RLRs гены у 3-х случайных людей с разными патологиями. На рисунке 46 представлены различные транскрипционные эффекты препаратов на гены TLR3, TLR4, IRF3, В2М, RIG1 и IPS в клетках крови (мужчина 27 лет - донор 1, носитель вируса Эпштейн-Барра; женщина 65 лет - донор 2, онкология 1 стадия; женщина 50 лет -донор 3, сердечно-сосудистая недостаточность).
Высокая доза Генфаксона (ИФН 105 МЕ/мл) давала 100-кратный рост транскрипции гена TLR3 у женщины с онкологическим заболеванием (донор №2), но ингибировала конститутивную активность TLR4-гена у мужчины (донор 1). При этом у женщины с онкологией наблюдалась прямая дозовая зависимость стимулирующего эффекта Генфаксона на ген TLR3. Снижение концентрации Генфаксона до 104 МЕ/мл в клетках этих 2-х доноров оказывало на гены TLR3 и TLR4 выраженное стимулирующее действие. Вместе с тем в клетках крови донора 3 (женщина с сердечно-сосудистой патологией) Генфаксон оказывал на гены TLR3 и TLR4 очень слабый стимулирующий эффект. Рисунок 46. Экспрессия генов TLR3 и TLR4 в клетках крови человека, индуцированная препаратами Генфаксон, Циклоферон и Иммуномакс. По оси абсцисс: доноры 1, 2, 3. Генфаксон 105 МЕ/мл, Циклоферон 600 мкг/мл; Иммуномакс 5 ед/мл (черные столбики); Генфаксон 104 МЕ/мл; Циклоферон 103 125 мкг/мл; Иммуномакс 0,5 ед/мл (серые столбики); Генфаксон 103 МЕ/мл (белые столбики). Стимулирующие эффекты Циклоферона на гены рецепторов TLR3 и TLR4 были низкими и варьировали от 2 до 4 раз. Действие препарата выявлялось в клетках крови 3-х доноров избирательно в ответ на дозы 600 мкг/мл и 125 мкг/мл. При этом высокие концентрации Циклоферона ингибировали конститутивную экспрессию гена TLR4. Иммуномакс избирательно стимулировал гены рецепторов TLR3 и TLR4 в клетках крови донора 1. Максимальный эффект Иммуномакс проявлял в более низкой дозе 0,5 ед/мл. У доноров 2 и 3 исследованные гены TLR3 и TLR4 либо не реагировали на Иммуномакс или активация этих генов была слабой.
Выявленные различия в действии препаратов на гены TLR3 и TLR4 могли быть обусловлены у доноров отличиями в исходных конститутивных уровнях генной активности. Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы амплификации генов TLR3 и TLR4 у 3-х доноров значительно варьировали (рисунок 47). Наибольшие значения Cq-генов TLR3 и TLR4 были у донора 1, донор 2 имел средние показатели Cq и наименьшие значения Cq наблюдались у донора 3. Это означает, что донор 1 имеет самые низкие уровни экспрессии генов TLR3 и TLR4, а донор 3 - самые высокие. При этом, по данным плавления, у донора 1 отсутствовал специфический амплификат гена TLR3 и, следовательно, конститутивный синтез мРНК TLR3 был не выявляемым, а у донора 2, по данным плавления, содержал дополнительные неспецифические амплификаты. Различия между донорами в конститутивных уровнях экспрессии для гена TLR4 составили 210 . Следует отметить, что ген TLR4, по сравнению с геном TLR3, в клетках крови всех доноров имел более высокие конститутивные уровни экспрессии (средние значения TLR4Cq=25 и TLR3Cq=35). Можно сделать вывод, что донор 1, с более низкими уровнями экспрессии генов TLR3 и TLR4, отличается от доноров 2 и 3 более высокой индивидуальной чувствительностью к препаратам Генфаксон и Иммуномакс. Наоборот донор 3, с более высокими конститутивными активностями этих генов, имеет низкую чувствительность к препаратам ИФН и их индукторов. продуктов в реальном времени. По оси абсцисс - циклы (Сq). По оси ординат – величины нарастания флуоресцентного сигнала. Показаны пики Т-плавления специфических ДНК-продуктов.
Дальнейший ПЦР-анализ в клетках крови этих 3-х доноров экспрессии генов факторов транскрипции IRF3 и В2М подтвердил описанные выше закономерности регуляции генов TLR3 и TLR4 (рисунок 48). По-прежнему гены донора 1 имели наибольшую чувствительность к препаратам Генфаксон и Иммуномакс и гены донора 3 - минимальную. Гены донора 2 проявляли промежуточную чувствительность к рекомбинантному бета1-ИФН.
Кагоцел – полимер натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и 3% госсипола относится к иммуноактивным противовирусным препаратам, который назначают взрослым и детям в качестве профилактического и лечебного средства [Полонский В.О., 2003; Машкова С., 2004]. Клиническое применение препарата Кагоцел свидетельствует о его позитивном влиянии на реакции врожденного и адаптивного иммунитета у больных гриппом, ОРВИ и герпесом. Препарат обладает выраженной противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса 1 и 2 типов, устойчивых к ацикловиру [Галегов Г.А. и др., 2009]. Ранее показано, что Кагоцел влияет на транскрипционную активность группы генов ИФН и ИЛ в трансформированных культурах моноцитов и Т-лимфоцитов [Вершинина М.Ю., 2002].
Нами [ Соколова Т.М., Шувалов А.Н., 2012 ] сделана количественная оценка действия препарата Кагоцел на группу ключевых генов системы ИФН и апоптоза в лимфоцитах и фибробластах человека (рисунки 51-54). Действие Кагоцела сравнили с препаратом Ридостин. Исследовано действие 3-х доз препаратов. Кагоцел стимулировал в фибробластах активность генов системы ИФН (ОАС1, РНК-азы, дсПК, альфа-ИФН и бета1-ИФН) намного слабее, чем Ридостин. В ответ на Ридостин прирост активности гена ОАС1 достигал 2000 раз, гена дсПК - 64 раза. Ответ на Кагоцел ИФН-зависимых генов не превышал 7 раз. Большинство активирующих генных эффектов Кагоцела было вызвано дозой 180 мкг/мл, которая для этих клеток близка к субтоксической. Наиболее выраженный эффект Кагоцел оказывал на гены ОАС1 и РНК-азы L.
Кагоцел как индуктор генов системы ИФН и цитокинов у пациентов (сравнение с Ридостином )
В последнее время ИФН- и дсРНК-зависимые механизмы апоптоза активно изучаются на уровне сигнальной трансдукции и недавно были открыты два новых прямых пути активации апоптоза - дсРНК/TLR3/TRIF-зависимый и RIG/Bax/IRF3 [Estornes et al., 2012; Chattopadhyay et al., 2010]. В их реализации участвуют гены ИФН-регулируемых факторов транскрипции IRFs и STATs и гены дсРНК-зависимых ферментов. Показано, что в антивирусных и апоптотических эффектах проявляемых ИФН и дсРНК имеется определённое сходство, но наблюдаются и отличия. Изучение сигнальных механизмов апоптоза с участием рецепторов врождённого иммунитета представляет большой интерес в будущем.
Две системы клеточной защиты – система ИФН и апоптоз функционируют взаимосвязано и регулируются на уровне транскрипции генов. Нами показано стимулирующее действие Ридостина и Иммуномакса на ген р53, который имеет в промоторе ИФН-регулируемые последовательности (ISRE). Поэтому апоптозное действие индукторов ИФН в клетках сочетается с антивирусным [Pestka S., 2003; Vilcek J., 2003; Volate S.R. et al., 2010].
За рубежом Госсипол рассматривается как перспективный противораковый препарат. Изучаются молекулярные механизмы его апоптозного действия [Yurtsu E. et al., 2003; Huang Y.-W. et al., 2006]. Наиболее сильное действие проявляют изомер (-)Госсипол. В дозе 5-10 мкг/мл он вызывают фрагментацию клеточной ДНК, подавляет экспрессию пролиферативного гена Bcl-2, стимулирует апоптозные гены Bax и Fas-рецептор/лиганд, активирует экcпрессию ключевого регулятора апоптоза р53 [Chang J.S. et al., 2004; Volate S.R. et al., 2010].
Ведущая роль в контроле рецепторного и митоходриального путей развития апоптоза принадлежит генам Bcl-2 и Fas-рецептора (CD95) [Rossi D., Gaidano G., 2003]. Мы изучили действие препаратов Кагоцел и Ридостин на эти гены. Наши данные впервые показывают, что препараты по-разному влияют на экспрессию регуляторов апоптоза [Соколова Т.М. и др., 2011]. Ридостин в лимфоцитах активировал ген Fas-рецептора. Такой же результат сообщили Liu D. еt al. c препаратом полиИЦ. Апоптозное действие Кагоцела выражалось в подавлении активности протонкогена Bcl-2. Bcl-2 относится к ингибиторам митоходриального апоптоза и является мишенью для создания противоопухолевых лекарств [Chipuk J. E. et al., 2008; Azmi A.S., Mohammad R.M., 2009]. Высокие уровни экспрессии гена Bcl-2 защищают клетки от апоптоза, вызванного разными цитотоксическими воздействиями и вирусами [Глазунова В.А., Штиль А.А., 2008; Федорова Н.Е. и др, 2010].
В литературе содержатся результаты изучения ИФН-индуцирующей активности препарата Кагоцел [Ершов Ф.И., Киселев О.И., 2005; Сайиткулов А.М., 1995; Tazulakhova E.B. и др., 2001; Полонский В.О., 2003]. В меньшей степени изучены иммуномодулирующие активности Кагоцела в клетках крови человека. Как известно, ИЛ1-бета и его рецепторный антагонист (РА-ИЛ1бета), реагируют на стрессовые воздействия и сигналы опасности [Schiff M.H., 2000]. ФНО-альфа индуцирует апоптозный ответ клеток. ИФН-гамма и ИЛ4 - активаторы Т-хелперов типа 1 и 2 (Тх1 и Тх2), соответственно [Wong C.K. et al., 2001]. ИЛ17 – продукт субпопуляции Т-хелперов (Тх17), активированных при аутоиммунных процессах [Samson M. et al., 2011]. Полифункциональный провоспалительный ИЛ6 влияет на дифференцировку Т- и В-лимфоцитов и гуморальный иммунитет [Schaper F., Rose-John S., 2015]. ИЛ8 - важный хемокин иммунных реакций макрофагов и цитотоксических Т-лимфоцитов в местах поражений, а также ключевой регулятор ангиогенеза и «состояния здоровья» сосудов в организме [Apostolakis S. et al., 2009].
Известно, что между действием ИФН типа 1 и ИЛ1-бета на клетки существуют антагонистические отношения. ИФН типа 1 ингибируют продукцию ИЛ1-бета и активацию инфламасомы, в которой осуществляется протеолитическое превращение неактивного ИЛ1 в зрелую форму [Man S.M., Kanneganti T.D., 2015]. Поэтому индукция препаратами ИФН типа 1 может быть способом контроля уровня воспалительной реакции в тканях. Это особенно важно при патологиях, когда ИЛ1-бета быстро секретируется из клеток и, взаимодействуя с рецептором, вызывает STAT1 зависимую активацию митогеновых киназ (JNK, ERK и p38) и усиленную продукцию группы цитокинов [Hedl M., Abraham C., 2011].
Сравнили индукцию цитокинов в лимфоцитах здорового донора и больного ребёнка препаратами Кагоцел и Ридостин (клиническое наблюдение). Между здоровым донором и ребёнком с нейробластомой выявлены значительные отличия в цитокиновых реакциях. Лимфоциты больного ребёнка не продуцировали ИЛ6 и имели очень низкую продукцию ИЛ1-бета и ИЛ8. Кагоцел и Ридостин вызывали в лимфоцитах ребенка сверхактивный цитокиновый ответ. При этом количество синтезированного ФНО-альфа у больного ребенка становилось доминирующим и возрастало почти в 300 раз. Ридостин в лимфоцитах здорового взрослого донора индуцировал гамма-ИФН, а в лимфоцитах больного ребенка преимущественно – альфаИФН. Обнаруженный факт смены индуцируемого типа ИФН в ответ на один вид индуктора является неожиданным. По видимому, это обусловлено особенностями клеточной регуляции онкологического больного. ИФН, синтезируемые в лимфоцитах, обладали противовирусной активностью.
Астма широко распространённое аллергическое заболевание верхних дыхательных путей с малопонятными механизмами возникновения [Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006]. Специальный раздел работы посвящён нарушениям экспрессии генов системы ИФН и апоптоза при бронхиальной астме (БА). Раскрытие механизмов повышенной восприимчивости больных бронхиальной астмой (БА) к респираторным вирусам является крайне важной задачей. Проведенные нами в этом направлении исследования восполняют имеющийся пробел в знаниях об активности генов системы ИФН при этом заболевании. В изучении бронхиальной астмы (БА) основное внимание уделялось изменениям цитокинового и хемокинового профиля, влияющего на дифференциацию субпопуляций Тh1/Th2/Th17 лимфоцитов [Чучалин А.Г. др., 2007; Аллахвердиева Л.И.и др., 2011; Бибкова А.А и др., 2012]. Мало сообщенй в отношении экспрессии ИФН-генов в мокроте и крови больных БА [Hamzaoul A., et al., 2000; Iikura K. et al., 2011; Bjornsdottir U. S., 2013]. Риновирусная инфекция считается наиболее значимой в развитии воспалительной реакции в бронхах [Papadopoulos N.G. et al., 2002; Martinez F.D., 2009]. Известно, что многие вирусы, в том числе риновирусы и вирусы герпеса, вызывают подавление экспрессии генов системы ИФН, вместе с тем, активируя гуморальное звено иммунитета.
У обследованных нами 8 больных бронхиальной астмой (БА), наряду с частыми респираторными инфекциями, наблюдались рецидивы герпеса. Восприимчивость к вирусам контролируется, прежде всего, врожденным иммунитетом, первостепенную роль в котором играет система ИФН [Ершов Ф.И., Киселев О.И., 2005]. В нашей работе получены количественные показатели уровней генной экспрессии в группе больных по сравнению с группой здоровых, которые демонстрируют снижение транскрипции 4-х антивирусных генов (альфа-ИФН, ферментов ОАС1, дсПК), апоптозного Fas гена, ИФН-регулируемого гена ИСГ15. Наши данные согласуются с заключением, что в клетках периферической крови у больных БА наблюдается ослабление защитных цитокиновых реакций, которые проявляется сниженными показателями системы ИФН. Повышенные уровни транскрипции гена ИЛ4 у больных БА указывают на стимуляцию Тh2 лимфоцитарной функции [Hamzaoul A. et al., 2000]. Нарушения в системе ИФН на транскрипционном уровне могут быть у обследованных пациентов врожденными, но весьма вероятно, что они возникают в процессе жизни вследствие многократно повторяющихся вирусных инфекций.