Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Структура и функциональная роль TLR 12
1.2 Гены TLR и их полиморфизмы: закономерности распределения в популяциях 15
1.3 Популяции Челябинской области 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 27
2.1 Контингент обследуемых лиц 27
2.2 Иммуногенетическое типирование 28
2.3 Статистический анализ данных 29
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 36
3.1. Русские ЧО: частоты аллелей и генотипов TLR 36
3.2 Башкиры ЧО: частоты аллелей и генотипов TLR 41
3.3 Нагайбаки ЧО: частоты аллелей и генотипов TLR 44
3.4 Относительные частоты гаплотипов TLR10–TLR1–TLR6 в популяциях ЧО 47
3.5 Неравновесное сцепление между аллелями гаплотипов TLR10–TLR1– TLR6 в популяциях ЧО и евразийских популяциях 51
3.6 Анализ генетического сходства между популяциями 53
3.7 Анализ соответствий 54
3.8 Соответствие между генетическим и географическим расстояниями в изученных популяциях 58
Заключение 62
Выводы 65
Практические рекомендации 67
Список используемых сокращений 68
Список литературы
- Гены TLR и их полиморфизмы: закономерности распределения в популяциях
- Популяции Челябинской области
- Иммуногенетическое типирование
- Нагайбаки ЧО: частоты аллелей и генотипов TLR
Гены TLR и их полиморфизмы: закономерности распределения в популяциях
Система генов TLR. Гены TLR человека расположены на различных хромосомах. В то же время, некоторые гены TLR отличаются большим сходством в нуклеотидной последовательности и располагаются на хромосомах в непосредственной близости друг от друга. Степень гомологии может быть очень значительной и связана с явлением дупликации этих генов в процессе эволюции системы TLR [118]. Существующие гены толл-подобных рецепторов можно разделить на 5 подсемейств соответственно происходившей в ходе эволюции дивергенции. Гомология генов одного подсемейства связана со сходством в аминокислотной последовательности, присутствующим в каждом подсемействе рецепторов, и определяет специфичность в наборе лигандов, с которыми связываются данные рецепторы [118, 129]. На основе степени гомологии можно выделить 5 подсемейств генов TLR:
1). Подсемейство TLR1. Включает в себя гены TLR1, 6 и 10, а также 2. Эти гены располагаются на 4 хромосоме, причём TLR2 находится на длинном плече (4q32), а остальные 3 гена формируют очень компактный (54 килобазы) генный кластер на коротком плече 4 хромосомы (4p14). Гены этого кластера отличаются наибольшей степенью гомологии среди всех TLR. Гены подсемейства TLR1 объединены общей функцией – распознавание липопептидных бактериальных продуктов.
2). Подсемейство TLR3. Включает единственный ген – TLR3, располагающийся на длинном плече 4 хромосомы (4q35).
3). Подсемейство TLR4. Представлено одним геном – TLR4, находящимся на 9 хромосоме (9q32-33).
4). Подсемейство TLR5. Состоит из гена TLR5, который расположен на длинном плече 1 хромосомы (1q33.3).
5). Подсемейство TLR9. Включает гены TLR7, 8, 9. При этом гены TLR7 и 8 располагаются в тандеме на половой X-хромосоме (Xp22), а ген TLR9 локализуется на коротком плече 3 хромосомы (3p21.3). Гены данного подсемейства кодируют рецепторы, распознающие нуклеиновые кислоты (немитилированную дцДНК и оцРНК).
Семейство генов толл-подобных рецепторов отличается довольно низкой скоростью эволюции (по сравнению с другими мультигенными системами) и обладает большой гомологией в различных группах позвоночных животных [111, 118]. Подсемейство TLR1, находясь под действием негативного естественного отбора, характеризуется большим количеством видоспецифичных адаптаций по сравнению с другими семействами. В то же время, TLR2 отличается большой консервативностью и встречается у всех позвоночных животных [68].
Формирование генетического разнообразия генов TLR в ходе естественного отбора. На протяжении всего периода своего существования человеческая популяция находилась в контакте с возбудителями инфекционных заболеваний, которые являлись главной причиной смертности [31]. Микроорганизмы, таким образом, представляют собой один из важнейших факторов естественного отбора, формирующиего генетическое разнообразие в человеческих популяциях [39, 44].
Существует три основных типа отбора (селекции), оказывающих влияние на относительную частоту генетических полиморфизмов в популяциях:
1). Негативный отбор, также известный как очищающий отбор. Данный вид селекции приводит к удалению вредных для выживания аллелей из популяции. Это, вероятно, наиболее распространенная форма естественного отбора, действующая на геном. Подавляющая часть полиморфизмов в генах TLR подвергается этому типу отбора. У человека, в среднем 38-75% всех новых вновь возникающих мутаций, приводящих к аминокислотным заменам, подвергается умеренной или сильной негативной селекции [100, 112]. Основным последствием негативного отбора является локальное сокращение разнообразия и увеличение доли редких аллелей в том случае, когда отбор не является достаточно сильным, чтобы полностью устранить вредные аллели из популяции (то есть, слабый негативный отбор).
2). Положительный отбор (направленный, или дарвиновский отбор). Этот вид селекции влияет на вновь возникшие (или редкие) мутации, имеющие благоприятный эффект на выживаемость. При преимущественном увеличении частоты мутаций в популяции в результате положительного отбора, частота связанная с благоприятным аллелем нейтральной вариации также будет увеличиваться. В то же время, нейтральные аллели, не связанные с позитивно отбираемым полиморфизмом, начинают исчезать из популяции, что в конечном счёте приводит к общему снижению генетического разнообразия вокруг отобранного аллеля. Ещё одним следствием действия позитивного отбора является усиление прочности неравновесного сцепления, связанного с отобранными аллелями. Положительная селекция является достаточно редким событием для генов TLR и ограничивается практически исключительно генами, кодирующими поверхностные молекулы TLR [139, 140].
3). Балансирующий отбор. Это, своего рода, базовый режим естественного отбора, который способствует поддержанию разнообразия в популяции. Существуют два основных механизмов, с помощью которых балансирующий отбор сохраняет генетическое разнообразие в популяции: 1) эффект преимущества гетерозиготности (или сверхдоминирование); 2) обусловленный частотой отбор. Преимущество гетерозиготности относится к ситуации, в которой гетерозиготные в определенном генном локусе особи характеризуются лучшей выживаемостью по сравнению с гомозиготами. Обусловленный частотой балансирующий отбор происходит в тех случаях, когда адаптивные преимущества, определённого фенотипа зависит от его распространённости по сравнению с другими фенотипами в данной популяции. В конечном итоге, балансирующий отбор приводит к увеличению распространённости аллельных вариантов с промежуточной частотой встречаемости, что повышает уровень генетического разнообразия в популяции [106, 140].
Многочисленные исследования указывают на различия в эволюции между генами TLR, расположенных на поверхности клетки и внутриклеточных [140]. Эти различия связаны с биологической ролью, которые выполняют эти два класса рецепторов. Предполагают, что внутриклеточные TLR находятся под сильным эволюционным ограничением. Такие TLR демонстрируют более низкие уровни полиморфизма и более низкие темпы эволюции белка, по сравнению с поверхностными TLR. Для внутриклеточных TLR также характерно меньшее количество нуклеотидных полиморфизмов, связанных с ухудшением функциональной активности молекулы TLR [61, 64]. Внутриклеточные TLR связываются с нуклеиновыми кислотами, которые характеризуются более консервативным строением у самых разных групп микроорганизмов. Кроме того, излишняя изменчивость генов внутриклеточных TLR может приводить к появлению форм рецепторов, способных взаимодействовать с собственными нуклеиновыми кислотами человека. Такая «неспецифическая» активация TLR может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний. Таким образом, строгий негативный тип селекции способствовал выбраковыванию вновь возникающих мутаций в генах, кодирующих внутриклеточные TLR, делая их более консервативными, что, по-видимому, является эволюционно выработанным механизмом защиты от чрезмерно выраженной реактивности (аутореактивности) [61, 140].
Для поверхностных TLR характерно связывание с молекулами, входящими в состав поверхностных структур микроорганизмов (фрагменты клеточных оболочек, жгутики). Такие структуры подвержены наибольшему изменению у микроорганизмов. Для генов поверхностных TLR характерно действие слабого негативного или даже позитивного отбора, способствующего увеличению частоты вновь возникающих мутаций. Ослабление селективных ограничений, влияющих на гены поверхностных TLR, что выражается в более высоких частотах несинонимичных и стоп-мутаций, показывает более высокий уровень биологической избыточности для этих рецепторов. Несмотря на то, что, зачастую, возникающие мутации в этих генах приводят к ослаблению их функциональной активности, в определённых условиях сниженный иммунный ответ, обусловленный такими полиморфизмами, может иметь благоприятное значение для выживаемости популяции в целом [47]. В таких случаях генетические полиморфизмы выполняют роль модуляторов восприимчивости к инфекционным заболеваниям [30].
Популяции Челябинской области
Для каждого полученного значения D с помощью критерия 2 Пирсона была рассчитана статистическая значимость. Стандартизованная величина коэффициента неравновесного сцепления D , не зависит от относительных частот аллелей, что позволяет сравнивать неравновесное сцепление между гаплотипами, образованными как частыми, так и редкими аллелями. Коэффициент неравновесного сцепления D может принимать значения от -1 до 1: при D 0 можно говорить о наличии сцепления между генными локусами. Чем ближе положительное значение D к 1, тем выше степень сцепления. Трёхлокусные гаплотипы признавались сцепленными в том случае, если сцепление наблюдалось для всех трёх пар аллелей, составляющих эти гаплотипы.
На основе распределения частот трёхлокусных гаплотипов в популяциях был проведён анализ их генетического сходства. Генетическое сходство было определено в ходе кластерного анализа (Cluster Analysis), который позволяет выделить среди совокупности объектов (в данном случае - популяций) группы (кластеры), характеризующиеся наибольшим внутренним сходством. В качестве параметров при сравнении популяций служили относительные частоты трёхлокусных гаплотипов TLR10LR1LR6. Эти параметры ложатся в основу меры сходства между популяциями. В нашем исследовании в качестве меры сходства были использованы евклидовы расстояния. Евклидово расстояние определяется по формуле: dxy=(x-yi)2, (7) где dxy - евклидово расстояние между популяциями x и y; xi и yi -относительные частоты гаплотипа i в популяциях x y, соответственно.
В качестве метода объединения для популяционных кластеров был использован метод невзвешенного попарного арифметического среднего (unweighted pair-group method using arithmetic averages, UPGMA). Данный метод определяет расстояние между двумя различными кластерами как среднее расстояние между всеми парами объектов (популяций) в них. Графическим выражением кластерного анализа является дендрограмма - древообразная схема, конечные ветви которой соответствуют отдельным популяциям, при этом наиболее близко расположенные друг к другу популяции характеризуются наибольшим сходством. Кластерный анализ с построением дендрограммы выполнен в программном пакете Past v.2.17 [59].
Для визуализации взаимоположения различных популяций в соответствии с распределением в них гаплотипов TLR10LR1LR6 был проведён анализ соответствий (Correspondence Analysis). Данный метод является разновидностью многомерных методов и позволяет представить изучаемые объекты как точки в многомерном координатном пространстве. Из всех осей выбираются две, суммарно позволяющие объяснить максимальную долю наблюдаемых различий, и популяции изображаются в виде точек в прямоугольной системе координат на плоскости. Чем ближе расположены друг к другу точки на графике, тем более близкими генетически являются популяции, обозначаемые этими точками. Отличительным признаком анализа соответствий является возможность изображения на той же координатной плоскости параметров сравнения (трёхлокусных гаплотипов). Анализ соответствий был выполнен в программном пакете Past v.2.17 [59].
Для определения наличия связи между географическими и генетическими расстояниями был использован Прокрустов анализ (Procrustes analysis). Это многомерная процедура, которая позволяет максимально совместить многомерные конфигурации объектов в пространстве. В нашем случае такими конфигурациями являлись матрицы географических и генетических расстояний. В ходе анализа одна из конфигураций выбирается в качестве целевой и не изменяется, а вторая - подгоночная - подгоняется под целевую с помощью простейших геометрических операций. Остаточные величины несовпадения (матрица остатков) позволяют судить о степени нетождественности двух конфигураций. На основании остатков вычисляют коэффициент пропорциональности. Для оценки статистической значимости сходства конфигураций используется рандомизационная процедура Монте-Карло (Monte-Carlo permutation test). При этом проверяется нулевая гипотеза, что точкам подгоночной конфигурации в пару были назначены произвольные точки целевой конфигурации. Таким образом, чем меньше значение p, тем меньше вероятность случайного сходства конфигураций по строкам, по столбцам или целиком. Этот метод является непараметрическим и не предъявляет требований к типу распределения данных. В качестве генетических расстояний для Прокрустова анализа были использованы расстояния между точками на графике анализа соответствий, рассчитанные по направлению оси, позволяющей объяснить наибольшую долю наблюдаемых генетических различий между популяциями, то есть были использованы прямоугольны проекции на данную координатную ось. Географическое положение популяций (широта и долгота) было определено на основании данных о популяциях, представленных на сайте проекта 1000genomes. Исходя из координат, обозначающих положение популяций, были рассчитаны географические расстояния между ними в широтном направлении по следующей формуле:
Иммуногенетическое типирование
Ген TLR1. В результате определения частоты встречаемости полиморфизма 1805T G гена TLR1 в популяции нагайбаков выявлено, что аллель 1805 G гена наблюдается в этой популяции с частотой (af=0,557), что достоверно отличает нагайбаков от популяции русских (2=25,59, p 0,001) и башкир ЧО (2=30,16, p 0,001). В результате определения частоты встречаемости полиморфизма 1805T G гена TLR1 в популяции нагайбаков выявлено, что аллель 1805 G гена наблюдается в этой популяции с частотой (af=0,557), сходной с аналогичными значениями в южно-европейских популяциях. Аналогичные аллельные частоты были обнаружены в популяции адыгейцев.
В ходе анализа частот встречаемости генотипов 1805 T G гена TLR1 в популяции нагайбаков было определено, что преобладающим генотипом является гетерозиготный 1805 TG (gf=0,535). Из гомозигот более частыми были 1805 GG (gf=0,289) по сравнению с 1805 TT (gf=0,175). Полученные для нагайбаков частоты генотипов 1805T G TLR1 достоверно отличают их от русских (2=27,40, p 0,001) и башкир (2=30,73, p 0,001). По распределению частот генотипов 1805T G гена TLR1 популяция нагайбаков наиболее близка к популяциям тосканцев и иберийцев.
Ген TLR6. В ходе типирования нагайбаков по точковой замене 745C T гена TLR6 обнаружено, что аллель 745 T в этой популяции встречается с частотой (af=0,298). Указанное значение частоты имеет достоверное различие с соответствующим показателем для популяции башкир ЧО (2=13,48, p 0,001). При сравнении популяции нагайбаков с популяциями Евразии по частоте встречаемости точковой замены 745C T гена TLR6 обнаружено, что аллель 745 T в этой популяции встречается с частотой, близкой к частоте этого аллеля в популяциях русских ВО и адыгейцев. Близкие частоты наблюдаются также в южно-европейских популяциях тосканцев и иберийцев, хотя для этих двух популяций характерны более высокие значения.
Распределение генотипов 745 C T гена TLR6 в популяции нагайбаков характеризуется наличием гомозигот 745 CC и гетерозигот 745 CT с близкими высокими частотами встречаемости (gf=0,491 и gf=0,421, соответственно). Гомозиготы 745 TT среди нагайбаков являются относительно редкими (gf=0,088). Относительные частоты генотипов 745C T TLR6 достоверно отличают популяцию нагайбаков от башкир ЧО (2=14,34, p 0,001). Относительные частоты генотипов 745C T гена TLR6, характерные для нагайбаков, схожи с аналогичными показателями южно-европейских популяций (тосканцы и иберийцы).
Относительные частоты аллелей и генотипов TLR в популяции нагайбаков характеризуются значениями, сближающими эту популяцию как с популяциями Южной Европы, так с и южно-азиатскими популяциями. В целом, популяция нагайбаков более близка к южно-европейским популяциям. Интересно, что ранее для популяции нагайбаков было показано сходство по генам HLA I с популяциями Южной Европы [16]. Вероятно, на близость популяции нагайбаков к популяциям Европы повлияло как проживание предков нагайбаков на территории Европы, так и их особое социальное положение. Значительную часть нагайбаков составляло сословие казаков, поставленных по приказу правительства Российской Империи на стражу границ государства [2]. В составе Оренбургского казачества нагайбаки участвовали в многочисленных продолжительных военных кампаниях, в том числе и на территории Европы [2, 3]. Таким образом, предки нагайбаков, имея азиатское происхождение, в ходе проживания на территории Европы оказались подвержены определённому действию натуральной позитивной селекции в ходе ряда эпидемий чумы, и в результате миграции на территорию Южного Урала (XVI-XVIII вв.) привели к высокой частоте встречаемости отобранных позитивной селекцией аллельных вариантов TLR у нагайбаков [8]. 3.4 Относительные частоты гаплотипов TLR10–TLR1–TLR6 в популяциях ЧО
Анализ относительных частот трёхлокусных гаплотипов TLR10–TLR1– TLR6 в исследуемых популяциях позволяет выделить гаплотипы, различающиеся по географической распространённости. Гаплотипы 721 A– 1805 G–745 T, 721 A–1805 G–745 C и 721 C–1805 G–745 C наиболее часто встречаются в европейских популяциях, при этом гаплотип 721 C–1805 G– 745 C отличает европейские популяции северо-западного происхождения. Гаплотипы 721 A–1805 T–745 C и 721 C–1805 T–745 C с наиболее распространены в популяциях Азии. Остальные гаплотипы для всех изученных популяций являются редкими и встречаются с частотой не превышающей 0,02-0,03.
Русские ЧО. Из 8 гаплотипов, обнаруженных в популяции русских ЧО, наиболее часто встречаются 4 гаплотипа: 721 A–1805 G–745 T (hf=0,362), 721 A–1805 G–745 C (hf=0,240), 721 C–1805 T–745 C (hf=0,198) и 721 C– 1805 G–745 C (hf=0,150) (таблица 3). Частота остальных гаплотипов составляет менее 0,10. Полученные частоты достоверно отличают популяцию русских от нагайбаков (2=34,88, p 0,001) и башкир ЧО ( 2=138,75, p 0,001).
Наиболее распространёнными в популяции русских ЧО являются гаплотипы 721 A–1805 G–745 T (hf=0,362) и 721 A–1805 G–745 C (hf=0,240), которые встречаются в других европейских популяциях с близкими частотами. Два других частых гаплотипа 721 C–1805 G–745 C и 721 C–1805 T–745 C в популяции русских ЧО схожи с соответствующими частотами для популяций северо-западной Европы (финнов, британцев, европейцев Северо-Запада). Гаплотип 721 C–1805 T–745 C в популяции русских ЧО встречается приблизительно в 2 раза реже, чем в южно-европейских популяциях иберийцев и тосканцев, у которых его распределение приближено к популяциям Азии, в то время как гаплотип 721 C–1805 G–745 C в 5 и более раз чаще встречается среди русских ЧО по сравнению с этими же популяциями.
Нагайбаки ЧО: частоты аллелей и генотипов TLR
Для визуализации взаиморасположения изученных популяций в зависимости от распределения в них гаплотипов TLR10–TLR1–TLR6 был применён анализ соответствий. В результате получено графическое представление популяций в виде точек на прямоугольной координатной плоскости, оси которой отражают наблюдаемые различия в частотах гаплотипов TLR10–TLR1–TLR6 между популяциями. На графике совместно с популяциями изображены наиболее часто встречающиеся гаплотипы, что позволяет оценить их вклад в формирование различий между популяциями. На рисунке 2 представлен соответствующий график, на котором кластеры популяций, полученные на предыдущем этапе, окружены эллипсами.
При рассмотрении графика анализа соответствий обращает на себя внимание то обстоятельство, что совокупно две выбранные координатные оси позволяют практически полностью объяснить наблюдаемые различия (94%) между популяциями, при этом практически полностью вся информативность приходится на долю оси 1 (87%). Анализ направления, задаваемого этой осью позволяет заключить, что оно, в целом, соответствует географическому направлению Запад–Восток. Таким образом, кластеры популяций можно охарактеризовать следующим образом:
1). «Северо-Западный Европейский» кластер, включающий в себя популяции британцев, финнов, смешанную европейскую популяцию северозападного происхождения и популяцию русских ЧО. Такое положение русских ЧО, выявленное на основании анализа аллельных и гаплотипических частот генов TLR, вполне согласуется с данными, полученными при изучении генетического разнообразия русских по другим генетическим системам.
Согласно анализу распределения в популяциях Евразии генов системы HLA I класса популяция русских очень близка к европейским популяциям, особенно западного происхождения [5, 16]. Размещение популяции русских ЧО на графике вблизи от европейских популяций свидетельствует, что она сформировалась на территории Европы и после этапов позитивной селекции, обусловленных неоднократными эпидемиями чумы на её территории мигрировала на земли Южного Урала. На формирование «Северо-Западного Европейского» кластера наибольшее влияние оказал «гипоотвечающий» гаплотип 721A–1805G–745T, располагающийся наиболее близко к центру кластера. Рисунок 2 – Анализ соответствий в изученных популяциях с представлением наиболее частых трёхлокусных гаплотипов
2). «Южно-Европейский» кластер, состоящий из популяций иберийцев, тосканцев, популяции нагайбаков и башкир ЧО. Из гаплотипов TLR10–TLR1– TLR6 наиболее близко к кластеру располагается гаплотип 721A–1805G–745C, характерный для европейских популяций. В то же время, более отдалённо от «Южно-Европейского» кластера расположен «азиатский» гаплотип 721 C– 1805 T–745 C. Представляет интерес тот факт, что полученные ранее данные генотипирования нагайбаков ЧО по генам HLA I типа, указывают на значительное южно-европейское генетическое влияние при формировании популяции нагайбаков [16]. Известно, что значительный влияние на формирование нагайбаков оказали тюркские племена булгар [8, 10]. Булгары проходили через несколько раундов миграций на территории Евразии и основали в IX веке на государство Волжская Булгария, отчасти ассимилировав местное население смешанного мадьярского и славянского происхождения. Кроме того, сами нагайбаки ввиду своего особого социального положения (воинское казачье сословие) принимали участие значительных военных кампаниях на территории Европы [2]. Согласно полученному нами графику, нагайбаки по сравнению с другими популяциями своего кластера располагаются наиболее приближенно к «Северо-Западному Европейскому» кластеру, а именно к популяции русских ЧО, что, вероятно, свидетельствует не столько о значительном европейском генетическом компоненте в генофонде нагайбаков, сколько о схожих исторических путях миграции с Запада на Восток и о синхронных событиях натуральной позитивной селекции на территории Европы. Примечательно, что популяция башкир ЧО на графике находится на противоположной границе этого же кластера, приближаясь к южно-азиатским популяциям бенгальцев и гуджаратцев. Подобное положение башкир было получено при изучении генетического профиля по системе генов HLA I [16]. Пограничное положение башкир на графике отражает особенность их географического положения на протяжении истории формирования популяции: являясь автохтонной для территории Южного Урала, популяция башкир испытывала на себе генетическое влияние со стороны народов, мигрировавших как с востока, так и с Запада.
3). «Азиатский» кластер, представленный популяциями как Южной Азии (гуджаратцы, пенджабцы, бенгальцы), так и Восточной Азии (китайцы Хань, китайцы Дай, вьетнамцы, японцы). При формировании этого кластера наибольший вклад внёс гаплотип 721A–1805T–745C.
Таким образом, полученные результаты частотного распределения аллелей, гаплотипов TLR10–TLR1–TLR6 в популяциях ЧО и популяциях Евразии на основании кластерного анализа и анализа соответствий свидетельствуют о том, что представленные трёхлокусные гаплотипы являются географически кластерированными.
Известно, что географическая экспансия человека в ходе преисторического и исторического времени играла большую роль в формировании генетической географии человека, сопряжённой с натуральной селекцией. В свете данной информации, на заключительном этапе исследования для определения связи между генетическим и географическим расстояниями был проведён Прокрустов анализ. Исходя из того, что наблюдаемые в популяциях генетические различия демонстрируют сильную обусловленность (на 87%) определённым направлением (Запад–Восток), для выявления соответствия между географическим и генетическим расстояниями были использованы географические расстояния, взятые в широтном направлении. В качестве генетических расстояний были использованы расстояния между точками, обозначающими популяции, на графике анализа соответствий. В таблице 1 представлены результаты анализа в виде коэффициентов пропорциональности (CPR) и значений p.