Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Иммунологические аспекты формирования аутоиммунной патологии соединительной ткани 17
1.2. Популяционный состав лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии 21
1.3. Маркеры активации лимфоцитов, их экспрессия при аутоиммуннойпатологии 33
1.4. Экспрессия маркеров активации лимфоцитов при стимуляции in vitro 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 60
2.1. Исследованные группы 60
2.2. Методы исследования, использованные в работе
2.2.1. Методы проточной цитометрии 64
2.2.2. Методы серологических исследований 83
2.2.3. Методы статистического анализа данных 84
ГЛАВА 3. Иммунологические параметры у детей с аутоиммунной патологией 88
3.1. Гуморальные параметры иммунитета 89
3.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови 92
3.2.1. Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции 93
3.2.2. В-лимфоциты и их субпопуляции 102
3.2.3. Натуральные киллеры и их субпопуляции 105
3.3. Спонтанная экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической
крови 107
3.3.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах 108
3.3.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах 110
3.3.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах 119
3.3.4. Экспрессия CD95 на Т-лимфоцитах 122
3.3.5. Экспрессия HLA-DR на Т-лимфоцитах 126
3.4. Экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови при стимуляции in vitro 128
3.4.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 129
3.4.2. Экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 136
3.4.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 144
3.5. Резюме 148
ГЛАВА 4. Иммунологические параметры у больных с различной активностью ювенильного идиопатического артрита 154
4.1. Гуморальные параметры иммунитета 155
4.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови 157
4.2.1. Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции 157
4.2.2. В-лимфоциты и их субпопуляции 161
4.2.3. Натуральные киллеры и их субпопуляции 163
4.3. Спонтанная экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови 165
4.3.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах 165
4.3.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах 167
4.3.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах 171
4.3.4. Экспрессия CD95 на Т-лимфоцитах 172
3.3.1. Экспрессия HLA-DR на Т-лимфоцитах 174
4.4. Экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови при
стимуляции in vitro 176
4.4.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 176
4.4.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 181
4.4.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro 186
4.5. Резюме 189
ГЛАВА 5. Многомерный статистический анализ параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови 195
5.1. Оценка взаимосвязей между параметрами функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, хроническим гепатитом С и условно здоровых детей методом анализа главных компонент 196
5.2. Оценка различий между исследованными группами и информативности параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови методом дискриминантного анализа 205
5.2.1. Дискриминантный анализ результатов исследования больных с аутоиммунной патологией, хроническим гепатитом С и условно здоровых детей 206
5.2.2. Дискриминантный анализ результатов исследования больных с различной активностью ювенильного идиопатического артрита 213
Заключение 219
Выводы 233
Практические рекомендации 235
Список сокращений и условных обозначений 236
Список литературы 238
- Маркеры активации лимфоцитов, их экспрессия при аутоиммуннойпатологии
- Методы проточной цитометрии
- Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции
- Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Аутоиммунная патология является частой причиной нарушения качества жизни пациентов и их инвалидизации. Распространенность аутоиммунных заболеваний соединительной ткани, в медицинской практике часто называемых ревматическими, растет в последние десятилетия, в том числе и среди детского населения (Кардиология и ревматология детского возраста / Под ред. Г. А. Самсыгиной, М. Ю. Щербаковой. М.: ИД МЕДПРАКТИКА, 2004. 744 с.). Наиболее часто встречающимся аутоиммунно-аутовоспалительным заболеванием у детей является ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) (Espinosa M., Gottlieb B. S. Juvenile Idiopathic Arthritis // Pediatr. Rev. 2012. Vol. 33. P. 303-313). Реактивный артрит (РеА) – развивающееся в ответ на внесуставную инфекцию асептическое воспалительное заболевание суставов, по клиническим проявлениям близко к ЮИА и также имеет в своем патогенезе аутоиммунные механизмы воспаления, существует проблема дифференциальной диагностики этих двух нозологий (Алексеева, Е. И., Литвицкий П. Ф. Ювенильный ревматоидный артрит: этиология, патогенез, клиника, алгоритмы диагностики и лечения. М.: ВЕДИ, 2007. 368 с.).
Для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний чаще всего используется определение аутоантител (Лапин С. В., Тотолян А. А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний. СПб: Человек, 2010. 272 с.). Достаточно хорошо изучен спектр аутоантител, характерных для системной красной волчанки (СКВ), менее исследованы антитела, встречающиеся при локализованной форме ювенильной склеродермии (ЮСД), аутоантитела - маркеры ЮИА, фактически, отсутствуют, т.к. распространенность ревматоидного фактора и антител к цитруллинированным пептидам при ЮИА крайне низка, а антинуклеарные антитела неспецифичны для этого заболевания (Malleson P. N., Mackinnon M., Sailer–Hoeck M. et al. Review for the generalist: The antinuclear antibody test in children – When to use it and what to do with a positive titer [Электронный ресурс] // Pediatric Rheumatology. 2010. Vol. 8(27). Режим доступа: ). Не менее серьезную проблему представляет собой мониторинг состояния больных с аутоиммунной патологией и оценка эффективности терапии. Чаще всего для этой цели используется определение скорости оседания эритроцитов и концентрации С-реактивного белка, однако, эти лабораторные методы далеко не всегда коррелируют с активностью воспалительного процесса при ревматической патологии (Ревматология: Клинические рекомендации / Под ред. акад. РАМН Е. Л. Насонова. 2–е изд., испр. и доп. М.: ГЭОТАР–Медиа, 2010. 752 с.). В связи с этим, актуален поиск информативных лабораторных тестов для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний соединительной ткани у детей и для контроля за состоянием больных.
Несовершенство лабораторной диагностики аутоиммунной патологии, не в последнюю очередь, связано с тем, что этиология и патогенез аутоиммунных заболеваний в настоящее время не вполне ясны. Большое значение при исследовании патогенеза аутоиммунной патологии придается балансу про- и противовоспалительных факторов иммунной системы, пристальное внимание приковано к лимфоцитам, как центральным клеткам иммунной системы,
осуществляющим регуляцию ее функций (Черешнев В. А., Шмагель К. В. Иммунология. М.: Издательский дом «МАГИСТР–ПРЕСС», 2013. 448 с.). Множество исследований посвящено регуляторным Т-клеткам и другим субпопуляциям лимфоцитов, участвующим в регуляции функций иммунной системы при аутоиммунной патологии, однако их результаты зачастую, противоречивы: некоторые авторы сообщают о снижении численности супрессорных популяций, другие, наоборот, - об их повышении при одних и тех же аутоиммунных заболеваниях (Торгашина А. В., Быковская С. Ю., Соловьев С. К. и др. Т-регуляторные клетки при системной красной волчанке и ревматоидном артрите // Научно–практическая ревматология. 2009. № 3. С. 50-59; Cvetanovich, G. L., Hafler D. A. Human regulatory T cells in autoimmune diseases // Current Opinion in Immunology. 2010. Vol. 22. P. 753-760).
Экспрессия различных маркеров активации Т-лимфоцитов характеризует
функциональное состояние иммунокомпетентных клеток. В литературных источниках приводятся противоречивые сведения, как о снижении, так и о повышении экспрессии различных активационных маркеров при ревматических заболеваниях (Bijl M., Horst G., Limburg P. C. et al. Expression of costimulatory molecules on peripheral blood lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. 2001. Vol. 60. P. 523-526; Contin– Bordes C., Lazaro E., Richez C. et al. Expansion of myelin autoreactive CD8+ T lymphocytes in patients with neuropsychiatric systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. 2011. Vol. 70. P. 868-871). Кроме того, большинство исследований, посвященных функционированию лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии соединительной ткани, проведено у взрослых больных с СКВ и ревматоидным артритом. Функциональному состоянию лимфоцитов при ревматических заболеваниях у детей посвящены лишь немногочисленные работы, которых недостаточно для полноценного понимания роли этих клеток в патогенезе аутоиммунных нарушений у пациентов детского возраста.
При исследовании маркеров активации лимфоцитов в клинической практике, чаще всего ограничиваются оценкой экспрессии CD25 и HLA-DR на Т-клетках. За гранью внимания остаются другие активационные маркеры, кроме того, практически не используются методы стимуляции клеток. Спонтанный уровень экспрессии маркеров активации, зачастую, составляет лишь несколько процентов или даже равен нулю (Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. Т. II / под. ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. М.: ГЭОТАР–Медиа, 2012. 808 с.), тогда как стимуляция позволяет выявить как повышение, так и снижение числа клеток, экспрессирующих различные рецепторы, в ответ на внешний стимул.
Таким образом, литературные данные о спонтанной и стимулированной экспрессии активационных маркеров лимфоцитов при аутоиммунной патологии у детей недостаточны для полноценного понимания роли клеточной активации в развитии аутоиммунных реакций. Исследование функционального состояния лимфоцитов периферической крови при аутоиммунных заболеваниях у пациентов детского возраста должно способствовать как пониманию патогенеза этих состояний, так и разработке новых, более информативных и эффективных методов их диагностики.
Целью исследования явилась комплексная оценка функционального состояния лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии у детей.
Задачи исследования:
-
Оценить информативность определения количества и соотношения основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) для диагностики аутоиммунной патологии у пациентов детского возраста.
-
Охарактеризовать спонтанный уровень маркеров активации Т-лимфоцитов CD69, CD25, CD38, CD95, HLA-DR в периферической крови при аутоиммунной патологии у детей.
-
Проанализировать характер реакции Т-лимфоцитов периферической крови на стимуляцию in vitro фитогемагглютинином, антителами к CD3, антителами к CD3 в сочетании с антителами к CD28 при аутоиммунной патологии у детей.
-
Оценить информативность совокупного определения спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации CD69, CD25, CD38 в общем пуле Т-лимфоцитов и их отдельного определения на Т-хелперах и цитотоксических Т-клетках.
-
Провести сравнительный анализ функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, с хроническим инфекционным процессом (вирусный гепатит С) и условно здоровых детей.
-
Оценить функциональное состояние лимфоцитов периферической крови при различной активности аутоиммунного процесса на примере ювенильного идиопатического артрита.
Методология и методы исследования. Проведено исследование функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией соединительной ткани (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит, реактивный артрит) в активной стадии заболевания по сравнению с условно здоровыми детьми и больными с хроническим вирусным гепатитом С. Оценено функциональное состояние лимфоцитов периферической крови при различной активности аутоиммунного процесса на примере ювенильного идиопатического артрита.
Для оценки функционального состояния лимфоцитов при аутоиммунной патологии у детей применен комплекс иммунологических методов исследования. Проведена оценка субпопуляционного состава и экспрессии маркеров активации лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии. Экспрессия активационных маркеров Т-лимфоцитов исследована в спонтанном и стимулированном вариантах, стимуляция клеток проводилась in vitro с помощью различных индукторов (фитогемагглютинином, антителами к CD3, антителами CD3 в сочетании с антителами к CD28). В диссертационном исследовании также использованы серологические методы, включавшие определение титра антинуклеарного фактора для оценки уровня аутоантител и концентрации С-реактивного белка как характеристики интенсивности воспалительного процесса.
Работа проведена в соответствии с принципами доказательной медицины и одобрена Локальным этическим комитетом Государственного Бюджетного учреждения Свердловской
области «Областная детская клиническая больница №1».
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.
Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных
теоретических позиций, достаточным количеством пациентов и формированием групп сравнения, использованием адекватных и апробированных лабораторных методов и сертифицированных наборов реагентов, воспроизводимостью результатов, применением современных методов и компьютерных программ статистического анализа полученных данных.
Основные результаты работы доложены и обсуждены на различных научных форумах
международного, российского и регионального уровней: I Объединенный научно-практический
форум детских врачей, Орел, 2008; II и III Объединенные иммунологические Форумы, СПб,
2008, Н. Новгород, 2013; I, II Конгрессы педиатров Урала с международным участием
«Актуальные проблемы педиатрии», Екатеринбург, 2008, 2012; III, IV, VI, VII, VIII, IX, X
Российские конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.
Челябинске», Челябинск, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015; XIII и XIV Всероссийские
научные форумы с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2009,
2011; 14th International Congress of Immunology, Cobe, Japan, 2010; VII, IX, X Российские
конференции иммунологов Урала, Архангельск 2009; Челябинск, 2011; Тюмень, 2012; III
Московская Международная научно-практическая конференция «Иммунофизиология.
Аутоиммунитет в норме и патологии и вопросы предиктивно-превентивной медицины», Москва, 2012; II International congress on Controversies in rheumatology & autoimmunity, Budapest, Hungary, 2013; Евразийский конгресс с международным участием «Медицина, фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2013; Научно-практическая школа с международным участием «Иммунология в клинической практике», г. Красноярск, 2013, 16th Asia Pacific League of Association for Rheumatology Congress «Sustanable Rheumatology in Asia», Cebu, Philippines, 2014; Научно-практическая конференция «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокинововй регуляции», г. Санкт-Петербург, 2014; Российский научный форум на Урале с международным участием, г. Екатеринбург, 2014; Пермский научный форум, Пермь, 2015.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Автором лично проведен научно-информационный поиск и анализ литературных данных по проблематике диссертационной работы; разработан дизайн исследования, выполнено 97% лабораторных тестов, включая этапы пробоподготовки, проведения исследований и оценки результатов (серологические тесты, составившие 3% от всего объема лабораторных исследований, выполнены совместно с младшим научным сотрудником лаборатории иммунологии воспаления ИИФ УрО РАН Криволаповой И.М.). Статистический анализ первичных данных, интерпретация полученных результатов, написание глав диссертации выполнены лично диссертантом. Публикации по материалам диссертации подготовлены лично автором и в соавторстве.
Положения, выносимые на защиту:
-
Изменения количества и соотношения основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) при аутоиммунной патологии у детей клинически не значимы.
-
Стимуляция лимфоцитов периферической крови различными агентами in vitro позволяет выявить особенности экспрессии маркеров активации, которые не проявляются при исследовании спонтанной экспрессии этих молекул.
-
Изменения функционального состояния Т-лимфоцитов при реактивном артрите аналогичны таковым при аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит), что свидетельствует об общности их патогенетических механизмов.
-
Клиническая ремиссия ювенильного идиопатического артрита не сопровождается восстановлением функционального состояния лимфоцитов периферической крови, что может свидетельствовать о сохраняющейся активности патологического процесса.
Научная новизна исследования. Впервые дана комплексная характеристика функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией соединительной ткани, включающая определение субпопуляционного состава лимфоцитов и оценку экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов. Доказана малая информативность определения основных популяций и субпопуляций лимфоцитов (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) как для дифференциации между аутоиммунной патологией и физиологической нормой, так и для оценки восстановления функционирования иммунной системы при ремиссии аутоиммунного заболевания. Выявлено снижение количества субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови, обладающих способностью к негативной регуляции функционирования иммунной системы: регуляторных Т-клеток и Т-натуральных киллеров. Снижение численности этих субпопуляций при аутоиммунной патологии было устойчивым и, как показано на примере ювенильного идиопатического артрита, не нивелировалось даже при развитии стойкой длительной ремиссии заболевания.
Впервые у детей с ревматическими заболеваниями проведено исследование экспрессии
активационных маркеров Т-лимфоцитов, включающее определение их уровня в
периферической крови и уровня при инкубации in vitro – спонтанного и стимулированного различными агентами. Это позволило получить характеристику функционального состояния Т-лимфоцитов с оценкой их реактивности в ответ на стимуляторы различной природы и наличия резервных возможностей клеток. Разработана схема изменения при стимуляции in vitro количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры, в зависимости от их исходного функционального состояния. С помощью использованного методического подхода выявлено снижение резервных возможностей Т-лимфоцитов, проявлявшееся в менее интенсивной экспрессии CD69 в ответ на стимуляцию митогеном у детей с аутоиммунной патологией по сравнению с клинически здоровыми детьми, при отсутствии изменений спонтанного уровня экспрессии этого маркера. Более глубокая стадия истощения ресурсов
экспрессии активационных маркеров выявлена для CD25 и CD38, что проявлялось в снижении по сравнению с контрольной группой у больных с аутоиммунной патологией спонтанного и стимулированного количества Т-лимфоцитов, экспрессировавших эти активационные молекулы.
Установлено, что больные с различными ревматическими заболеваниями (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит, реактивный артрит) по параметрам функционального состояния лимфоцитов периферической крови были более сходны между собой, чем с условно здоровыми детьми и больными с хроническим инфекционным заболеванием – вирусным гепатитом С. Это подтверждено с помощью дискриминантного анализа: группы больных с ревматическими заболеваниями были в меньшей степени удалены друг от друга в пространстве канонических дискриминантных функций, чем от клинически здоровых детей и больных с хроническим гепатитом С. Для групп с ювенильным идиопатическим артритом и реактивным артритом по результатам дискриминантного анализа выявлена наименьшая удаленность в пространстве канонических дискриминантных функций, подтверждающая общность патогенеза данных заболеваний.
Впервые представлены данные комплексной оценки параметров субпопуляционного состава лимфоцитов, спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов у детей с различной активностью аутоиммунного заболевания на примере ювенильного идиопатического артрита. Доказано, что при клинической ремиссии функциональное состояние лимфоцитов периферической крови не восстанавливается в полной мере. Это подтверждено результатами дискриминантного анализа, согласно которому группы больных с медикаментозной и со стойкой ремиссией по параметрам популяционного состава и экспрессии маркеров активации лимфоцитов в пространстве канонических дискриминантных функций были ближе к группе больных в активной стадии ЮИА, чем к здоровым детям.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования
позволили расширить представление о функциональном состоянии лимфоцитов
периферической крови при аутоиммунной патологии у детей. Выявленное снижение численности субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы, с учетом анализа литературных данных, свидетельствующих о возможной роли этих клеток в негативной регуляции функционирования иммунной системы, формируют новый взгляд на роль указанных лимфоцитарных субпопуляций в развитии аутоиммунной патологии.
Установлены закономерности изменения субпопуляционного состава и спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации лимфоцитов при различной активности аутоиммунного заболевания на примере ювенильного идиопатического артрита. Выявлено, что при клинической ремиссии аутоиммунной патологии не наступает полного восстановления функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Полученные данные необходимы для понимания функционирования иммунокомпетентных клеток при хроническом воспалительном процессе, для оценки их резервных возможностей. Результаты работы могут быть использованы в процессе постдипломной подготовки врачей аллергологов-иммунологов,
ревматологов и врачей клинической лабораторной диагностики.
Использованный в диссертационной работе комплексный подход к оценке экспрессии
маркеров активации лимфоцитов, включающий определение их спонтанного и
стимулированного уровня, открывает новые возможности для научных исследований, как при аутоиммунных нарушениях, так и при другой иммунозависимой патологии. Разработанная схема изменения при стимуляции in vitro количества лимфоцитов, экспрессировавших активационные маркеры, в зависимости от их исходного функционального состояния, позволяет интерпретировать результаты исследований и оценивать степень истощения резервов иммунокомпетентных клеток.
Выделенный в работе комплекс параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови, подверженных наибольшим изменениям при аутоиммунной патологии соединительной ткани у детей, может быть использован как основа для разработки диагностических алгоритмов в детской ревматологии. Полученные данные могут применяться в работе клинико-диагностических лабораторий лечебных учреждений для дифференциальной диагностики аутоиммунной патологии и других состояний. Предложенный в работе подход к оценке функционального состояния лимфоцитов периферической крови применим для оценки полноты восстановления иммунной системы при клинической ремиссии аутоиммунных заболеваний.
Внедрение результатов исследования в практику:
Результаты диссертационного исследования включены в методические материалы для врачей, утвержденные Министерством здравоохранения Свердловской области.
Результаты исследования используются при проведении научных исследований ФБГУН Института иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург; внедрены в работу ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница №1», г. Екатеринбург; в работу МАУ «Клинико-диагностический центр», г. Екатеринбург.
Результаты работы включены в педагогический процесс кафедры терапии факультета постдипломного образования ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет», г. Екатеринбург; кафедры клинической лабораторной диагностики и кафедры клинической иммунологии частного учреждения дополнительного профессионального образования медицинских работников «Новый уровень», г. Тюмень; Международной школы «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике», г. Челябинск.
Публикации. Соискатель имеет более 100 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 39 научных работ общим объемом 12,2 печатных листов, в том числе 35 публикаций (9 статей, 26 тезисов) в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликованы 2 работы в материалах международных конференций; 1 методические рекомендации для врачей, утвержденные Министерством Здравоохранения Свердловской области; 1 статья в сборнике научных трудов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 319 страницах, содержит 78 таблиц и 27 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 427 источников (60 отечественных и 367 – зарубежных публикаций), приложения.
Маркеры активации лимфоцитов, их экспрессия при аутоиммуннойпатологии
Аутоиммунные заболевания соединительной ткани (ревматические) являются обширной группой, включающей разнообразные нозологические формы, и, зачастую, характеризующиеся поражением многих органов и систем [36, 38]. Это определяется тем, что соединительная ткань присутствует во всех органах и системах организма и, таким образом, в патологический процесс может быть вовлечено значительное количество разнообразных структур. Симптомы аутоиммунных заболеваний, зачастую, неспецифичны, и могут перекрываться как между различными нозологическими формами аутоиммунной патологии соединительной ткани, так и с болезнями неаутоиммунной природы [12, 15, 38, 58]. Все это обуславливает потребность в адекватных и информативных методах диагностики, в том числе лабораторной, для своевременной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.
Несмотря на обширный фактический материал и обилие гипотез, объясняющих механизмы аутоагрессии, понимание этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний в настоящее время далеко от оптимального. В качестве причин этих болезней называют генетические и средовые факторы, обсуждается роль инфекций в качестве триггеров [320]. Не вызывает сомнения участие наследственной предрасположенности в развитии аутоиммунных заболеваний. Известно, что частота возникновения системных аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ, склеродермия, дерматомиозит, у девочек и женщин в несколько раз выше, чем у мальчиков и мужчин [8, 16]. В пользу генетической обусловленности аутоиммунной патологии свидетельствует повышение вероятности ее развития у пациентов с отягощенным семейным анамнезом [38]. Выявлено множество ассоциаций между наличием различных аутоиммунных заболеваний и аллелей генов системы HLA, а также различных полиморфизмов генов [7, 24, 34, 50]. Однако диагностическое значение имеют лишь немногие из них в силу плохой воспроизводимости результатов исследований в рамках «генетики предрасположенностей» [56]. Кроме того, большое значение придается эпигенетическим механизмам реализации патологии [23].
Роль средовых факторов, таких как курение и промышленные загрязнители в развитии аутоиммунных заболеваний также имеет свои доказательства [118]. Различные инфекционные возбудители, как вирусные, так и бактериальные рассматриваются в качестве триггеров СКВ [37, 127, 194]. Считается, что вирусы могут способствовать презентации аутоантигенов, а также запускать воспалительные реакции, что в дальнейшем может стать основой аутоагрессии [27, 105, 245]. Молекулярная мимикрия, то есть, сходство антигенных детерминант некоторых микроорганизмов и аутоантигенов, также называется в качестве одной из причин развития аутоагрессии [17]. Однако, существует точка зрения, согласно которой распространение аутоиммунной патологии в последние десятилетия связано со снижением заболеваемости инфекционными болезнями [296]. В рамках этой гипотезы высказывается предположение, что инфекционные агенты, в том числе стимулируя систему Toll-подобных рецепторов, запускают естественные регуляторные механизмы и «тренируют» иммунную систему.
Какова бы ни была этиология аутоиммунных заболеваний, в настоящее время не вызывает сомнений, что ключевую роль в их патогенезе играют потеря иммунологической толерантности к собственным органам и тканям и развитие воспаления [35, 224, 357]. В качестве маркеров развития аутоиммунного процесса чаще всего используют аутоантитела [32, 356]. Для некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ и ревматоидный артрит, разработаны эффективные алгоритмы диагностики с помощью определения аутоантител [32, 164, 260, 399]. Однако, маркеры ювенильного идиопатического артрита в настоящее время не определены, поскольку ревматоидный фактор и антитела к цитруллинированным пептидам, значимые для ревматоидного артрита у взрослых, редко встречаются у детей [1, 40, 253]. Не разработаны эффективные критерии дифференциальной диагностики реактивного артрита и ювенильного идиопатического артрита, не ясно, насколько значимо участие аутоиммунных механизмов в патогенезе реактивного артрита [1].
Поскольку потеря иммунологической толерантности при аутоиммунной патологии предполагает неэффективность негативной регуляции в иммунной системе, большое внимание уделяется исследованию регуляторных Т-клеток и других субпопуляций, участвующих в такой регуляции [65, 237, 242, 267, 325, 400]. В связи с этим, исследование лимфоидных клеток, потенциально имеющих супрессорные свойства, должно способствовать пониманию патогенеза аутоиммунных заболеваний.
У детей аутоиммунные заболевания зачастую протекают в более тяжелой форме, чем у взрослых и характеризуются быстрой генерализацией патологического процесса [12, 37]. Оценка тяжести состояния у детей с аутоиммунной патологией представляет определенную трудность. Различные индексы активности, используемые в ревматологии, созданы для оценки состояния взрослых пациентов и могут быть применены к детям лишь ограниченно. В связи с этим, предпринимаются попытки создания новых индексов, более подходящих для педиатрической практики. Например, для оценки состояния детей с СКВ был предложен индекс SMILEY (Simple Measure of the Impact of Lupus Erythematosus in Youngsters) [277], величина которого коррелировала с оценкой качества жизни пациента, но с традиционно применяемым при СКВ индексом SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index).
Для оценки общей активности воспалительного процесса при ревматических заболеваниях наиболее часто используются определение С-реактивного белка (СРБ) и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) [38]. При ревматоидном артрите концентрация СРБ является чувствительным индикатором активности воспалительного процесса в синовии и системных воспалительных изменений в целом [12]. Однако, у детей с ювенильным идиопатическим артритом величина СОЭ и концентрация СРБ не всегда коррелируют с активностью заболевания [1]. Увеличение СОЭ часто наблюдается при СКВ, однако оно плохо соотносится с активностью патологического процесса, [38, 148]. Увеличение СРБ не коррелирует с клинической активностью СКВ и склеродермии и может быть следствием вторичной инфекции [38, 80, 210]. Таким образом, актуален поиск лабораторных тестов для оценки интенсивности воспаления и общей активации иммунной системы при аутоиммунных заболеваниях.
Методы проточной цитометрии
Все исследования методом проточной цитометрии осуществляли на проточном цитофлюориметре FC-500 (Beckman Coulter, США), оснащенном диодным лазером 488 нм. Математическую обработку цитофлюориметрических данных проводили с помощью программного обеспечения CXP-Analysis (Beckman Coulter, США). Получение образцов крови, пробоподготовка и настройка проточного цитофлюориметра проводилась согласно рекомендациям стандартизованной технологии исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови [53].
Забор крови для исследований методом проточной цитометрии проводился путем пункции локтевой вены в утренние часы строго натощак. Кровь забиралась в вакуумные пробирки, содержащие литиевую соль гепарина в качестве антикоагулянта. После забора и до начала лабораторных исследований кровь транспортировалась и хранилась при комнатной температуре, в защищенном от солнечного света месте. С момента взятия крови до начала исследований проходило от 30 минут до одного часа.
Окрашивание клеток и лизис эритроцитов. Экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов оценивали с помощью прямого пятипараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием моноклональных антител согласно инструкции производителя. Для этого моноклональные антитела вносили в образец крови с помощью автоматических дозаторов в объеме, рекомендованном производителем, образец крови после внесения антител инкубировали в защищенном от света месте не менее 15 мин, затем проводилась процедура лизиса. Использованы следующие коньюгаты моноклональных антител и флюорохромов: CD3-FITC (IgG1), CD3-ECD (IgG1), CD3-PC7 (IgG1), CD4-PE (IgG1), CD4-PC5 (IgG1), CD5-ECD (IgG2a), CD8-PC7 (IgG1), CD16-FITC (IgG1), CD16-PE (IgG1), CD25-PC5 (IgG2a), CD38-PC5 (IgG1), CD45-ECD (IgG1), CD45-PC5 (IgG1), CD56-PE (IgG1), CD69-PC5 (IgG2b), HLA-DR-PE (IgG1), TCR-PE (IgG2b), TCR-FITC (IgG1) (Beckman Coulter, США); CD95-FITC (IgG1), CD127-FITC (IgG1) (eBiosciense, США). Для корректной настройки проточного цитофлюориметра при выполнении исследований использовались изотипические контроли: IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-ECD, IgG1-PC5, IgG1-PC7, IgG2a-ECD, IgG2a-PC5, IgG2b-PE, IgG2b-PC5 (Beckman Coulter, США); IgG1-FITC (eBiosciense, США).
Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего/фиксирующего реагента Optilyze C (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя: в образец крови добавляли пятикратное количество Optilyze C, инкубировали в защищенном от света месте 15 мин, затем добавляли фосфатно-солевой буфер для остановки реакции в объеме, равном объему использованного Optilyze C, после этого инкубировали в защищенном от света месте не менее 15 мин. Процедуры окраски, лизиса и цитометрического анализа проводили в полипропиленовых пробирках размером 12х75 мм (Sarstedt, Германия).
Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводился с использованием частиц для абсолютного счета Flow Count (Beckman Coulter, США) и моноклональных антител к CD45 (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя. Относительное содержание лимфоцитов от общего количества лимфоцитов определяли с использованием моноклональных антител к CD45 (Beckman Coulter, США). Для выделения популяции лимфоцитов (гейтирования) вводили логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию и по экспрессии CD45, лимфоциты определялись как клетки наименьшего размера и гранулярности с наиболее высокой экспрессией CD45 (рисунок 1).
Абсолютное количество лимфоцитов и абсолютное количество клеток в их популяциях и субпопуляциях определяли путем математического пересчета, исходя из абсолютного количества лейкоцитов.
Для оценки численности популяций и субпопуляций лимфоцитов клетки окрашивали с помощью моноклональных антител в различных сочетаниях. При проведении цитофлюориметрического анализа регистрировали не менее 10000 лимфоцитов. При оценке экспрессии маркеров активации (CD25, CD38, CD69, CD95, HLA-DR) на Т-лимфоцитах и в их субпопуляциях регистрировали не менее 10000 лимфоцитов в оцениваемой субпопуляции (Т-лимфоциты, Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки). Оценивали как относительное, так и абсолютное количество клеток (путем пересчета, исходя из абсолютного количества лимфоцитов).
Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции
Зависимость экспрессии CD38 Т-лимфоцитами, Т-хелперами и цитотоксическими Т-клетками от половой принадлежности пациентов отсутствовала, абсолютное количество CD3+CD69+ было ниже у детей старшего возраста (таблица 10, приложение). У обследованных детей, как в норме, так и при патологии, молекула CD38 была экспрессирована на большем числе Т-хелперов, чем цитотоксических Т-клеток (таблица 12).
Максимальное относительное количество CD38-позитивных Т лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток зафиксировано в группе клинически здоровых детей (таблица 12). У больных с СКВ относительное количество CD3+CD69+ и CD3+CD4+CD38+ было наименьшим, в остальных группах с аутоиммунной патологией снижение численности указанных субпопуляций было не столь выражено. Однако, построение контрастов {УЗД} – {СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА} позволило установить, что в объединнной группе детей с ревматическими заболеваниями относительное количество CD3+CD69+ и CD3+CD4+CD38+ было ниже, чем в группе УЗД (F(121)=9,80; p 0,01; F(121)=8,51; p 0,01 и соответственно). Уменьшение доли цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших CD38, у больных с ревматическими заболеваниями было значительно более глубоким, все эти группы статистически значимо отличались от контрольной (таблица 12). Относительное количество CD38-позитивных Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток у больных с вирусным гепатитом не отличалось от контрольных значений (таблица 12), количество CD3+CD8+CD38+ было выше, чем в объединенной группе {СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА}, F(121)=35,69; p 0,001.
Примечание: n – количество пациент 95%ДИ – 95% доверительный интер ов; вал; ЕИ – единицы измерен различия с контролем: p 0,001 ия; М – среднее значение; - p 0,05; - p 0,01; Изменения абсолютного количества CD38-позитивных клеток в различных группах, в основном, повторяли вышеописанные закономерности (таблица 12). Наименьшее абсолютное количество CD3+CD69+ и CD3+CD4+CD38+ наблюдалось у больных с СКВ (таблица 12), контрасты {УЗД} – {СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА} были незначимы. Количество CD3+CD8+CD38+ в объединенной группе больных с ревматическими заболеваниями {СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА} было существенно ниже, чем у клинически здоровых детей и больных с вирусным гепатитом (F(121)=29,78; p 0,001 и F(121)=28,08; p 0,001, соответственно).
Таким образом, доля Т-лимфоцитов и Т-хелперов, экспрессировавших CD38, была минимальной у больных с СКВ и максимальной у клинически здоровых детей, остальные группы обследованных занимали промежуточное положение по этому параметру. Согласно единичным публикациям, посвященным исследованию экспрессии CD38 при аутоиммунных заболеваниях, у взрослых больных с СКВ число Т-хелперов, экспрессировавших CD38, напротив, было увеличено [314], при ревматоидном артрите у взрослых пациентов количество этих клеток было ниже контрольного уровня [337].
Количество CD38-позитивных цитотоксических Т-клеток у всех обследованных детей с ревматическими заболеваниями было ниже, чем у клинически здоровых детей. По данным литературных источников, у взрослых пациентов с СКВ наблюдалось повышение численности этой субпопуляции [273, 305]. У обследованных нами детей с вирусным гепатитом С количество CD3+CD8+CD38+ не отличалось от контрольного уровня. Согласно результатам D.C.M. Dos Santos с соавт. (2012), при этиологически схожем заболевании, гепатите В, у взрослых больных также не было выявлено в периферической крови увеличения CD3+CD4+CD38+ и CD3+CD8+CD38+ по сравнению со здоровыми донорами [141].
Таким образом, при ревматических заболеваниях у детей наблюдалось снижение количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов и, особенно, цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих CD38, по сравнению с клинически здоровыми детьми. Для хронического вирусного заболевания такое снижение не было характерно. Учитывая гипотезу о возможной роли CD38-позитивных Т-лимфоцитов в супрессии иммунного ответа [82, 393], можно предположить, что снижение числа этих клеток при аутоиммунной патологии у детей является одним из механизмов реализации гиперреактивности иммунной системы.
Относительное количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших FasR, в исследованных группах в среднем было невелико и колебалось в пределах от 5% до 8% (рисунок 43). Возраст детей и половая принадлежность не оказывали влияния на относительное содержание исследованных клеток, абсолютное количество CD3+CD95+ было ниже у детей старшего возраста, абсолютное количество CD3+CD4+CD95+ было выше у мальчиков (таблица 11, приложение). Относительное и абсолютное количество CD95-позитивных клеток в исследованных группах не различалось (таблица 13).
Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции
Для сравнительной оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, с хроническим инфекционным процессом (вирусный гепатит С) и условно здоровых детей одновременно по комплексу параметров был проведен многомерный дискриминатный анализ. Данный метод статистического анализа данных также был использован для оценки функционального состояния лимфоцитов периферической крови при различных стадиях активности аутоиммунного процесса на примере ювенильного идиопатического артрита. Использование дискриминантного анализа позволило оценить взаимную удаленность исследованных групп в многомерном математическом пространстве и отобрать иммунологические параметры, наиболее значимые для дискриминации групп.
С целью выбора иммунологических параметров для проведения дискриминантного анализа выполнено определение структуры взаимосвязей и классификация полученных данных методом анализа главных компонент.
Оценка взаимосвязей между параметрами функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, хроническим гепатитом С и условно здоровых детей методом анализа главных компонент Для определения структуры взаимосвязей между переменными, а также для редукции и классификации данных проведен анализ главных компонент по комплексу параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Анализ проведен во всех исследованных группах (условно здоровые дети, больные с системной красной волчанкой, ювенильной склеродермией, ювенильным идиопатическим артритом, реактивным артритом, хроническим гепатитом С) одновременно (использованы данные, полученные при обследовании 208 детей). Всего оценено 73 переменных, характеризующих функциональное состояние лимфоцитов периферической крови: абсолютное количество лимфоцитов, относительное количество лимфоцитов в различных субпопуляциях и доля Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших маркеры активации. Абсолютное количество клеток не было включено в анализ, поскольку оно статистически значимо коррелировало с относительным количеством (данные предварительного регрессионного анализа). Наличие большого количества коррелирующих друг с другом переменных при выполнении анализа главных компонент нежелательно, т.к. может привести к вырожденности матрицы [20]. В качестве группирующей переменной использована принадлежность к определенной исследуемой группе (СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА, ХГС, УЗД). В качестве сопутствующих переменных использованы половая принадлежность и возраст детей, логарифмы концентрации СРБ и титра АНФ. Введение сопутствующих переменных позволило оценить их взаимосвязь с параметрами функционального состояния лимфоцитов.
Согласно правилу каменистой осыпи [109], из 73 рассчитанных факторов было выделено 6 наиболее значимых (рисунок 133). Каждый из этих факторов имел собственное значение более 3, вместе они определяли более 50% общей изменчивости (таблица 3).
Поскольку данный фактор включал лишь около 5% от общей дисперсии, то это свидетельствует о слабом влиянии возраста и половой принадлежности на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови и экспрессию маркеров активации Т-лимфоцитами.
Наиболее сильная отрицательная взаимосвязь с первым, самым значимым фактором выявлена для группы переменных, характеризующих экспрессию CD38 на различных субпопуляциях Т-клеток (таблица 4). Как уже обсуждалось выше (глава 3, параграф 3.4.3; глава 4, параграф 4.4.3), количество CD38-позитивных клеток в субпопуляциях Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток в группах обследованных детей изменялось синхронно, вне зависимости от условий инкубации. Результаты анализа главных компонент также подтверждают, что для получения полноценной информации об экспрессии CD38 при стимуляции различными агентами при аутоиммунной патологии у детей, достаточно оценить ее лишь на общей популяции Т-лимфоцитов.
Отрицательную взаимосвязь с первым фактором также имела группа переменных, характеризующих спонтанную и стимулированную экспрессию CD25 на Т-лимфоцитах и Т-хелперах, а также спонтанное и стимулированное количество Treg (таблица 4). При этом, переменные, отражающие экспрессию CD25 на цитотоксических Т-клетках и количество активированных Т-хелперов, имели меньшую взаимосвязь с первым фактором. Это подтверждает сделанные ранее (глава 3, параграф 3.4.2; глава 4, параграф 4.4.2) выводы о том, что изменения экспрессии CD25 при патологии в разных субпопуляциях Т-лимфоцитов происходят независимо.
Наблюдалась позитивная взаимосвязь между первым фактором и уровнем гуморальных иммунологических параметров (АНФ и СРБ). Причем для титра АНФ это была наиболее сильная взаимосвязь из рассмотренных шести факторов. Как уже было сказано выше, с ростом собственного значения первого фактора уменьшалось спонтанное и стимулированное количество CD38-позитивных клеток во всех субпопуляциях Т-лимфоцитов, а также спонтанное и стимулированное количество CD3+CD25+, CD3+CD4+CD25+ и Treg. Соответственно, чем меньше было этих клеток, тем интенсивнее была выработка аутоантител. Возможно, перечисленные клетки принимают непосредственное участие в регуляции аутоантителопродукции. Супрессорные свойства регуляторных Т-клеток не вызывают сомнения [233, 308, 325, 409]. Относительно Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD38, также есть данные, указывающие на способность этих клеток к супрессии [82, 280, 393]. Однако, не исключена и опосредованная какими-либо другими факторами взаимосвязь между вышеперечисленными клеточными параметрами и титром АНФ. Второй фактор в значительной мере дублировал первый, поскольку наибольшую взаимосвязь с ним демонстрировали показатели спонтанной и стимулированной экспрессии CD38 (таблица 4).