Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Состояние иммунологической реактивности организма при туберкулезе легких (обзор литературы) 14
1.1 Изучение иммунологической реактивности организма как фактора диагностики и прогнозирования течения туберкулезной инфекции 14
1.2 Современные возможности лабораторной диагностики иммунных нарушений при туберкулезе 16
1.3 Реакция иммунной системы на M.tuberculosis 18
1.4 Изменение иммунологических показателей при различных формах туберкулезного воспалительного процесса 28
1.5 Показатели иммунитета при инфекции с разным объемом поражения ткани легкого, вызванной M.tuberculosis 38
1.6 Иммунологические показатели крови, характеризующие туберкулез, вызванный лекарственно-чувствительными и лекарственно-устойчивыми изолятами M.tuberculosis 39
1.7 Изменение лабораторных иммунологических показателей при разной активности туберкулезного процесса 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 45
2.1 Клиническая характеристика больных 45
2.2 Методы исследования
2.2.1 Используемый материал 60
2.2.2 Общеклинические методы исследования 60
2.2.3 Иммунологические методы исследования
2.2.3.1 Оценка функционально-метаболической активности фагоцитов 61
2.2.3.2 Оценка экспрессии молекул адгезии на фагоцитах 63
2.2.3.3 Оценка экспрессии HLA-DR на фагоцитах 63
2.2.3.4 Изучение клеточного иммунитета 64
2.2.3.5 Оценка гуморального иммунитета 64
2.2.4 Статистическая обработка результатов исследования 65
ГЛАВА 3. Оценка функционально-метаболической активности фагоцитов и популяционного состава иммунокомпетентных клеток крови больных в зависимости от формы туберкулезного воспали тельного процесса 67
3.1 Изменение функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток пациентов в зависимости от особенностей туберкулезного воспалительного процесса 67
3.2 Изучение показателей клеточного звена иммунитета в зависимости от формы туберкулезного воспалительного процесса 77
3.3 Оценка некоторых показателей гуморального иммунитета у пациентов с разными формами воспалительного ответа при поражении легких M.tuberculosis 84
ГЛАВА 4. Изучение иммунологических показателей больных инфильтративным туберкулезом легких в зависимости от объема поражения и лекарственной чувствительности изолята m.tuberculosis 96
4.1 Исследование функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток пациентов в зависимости от распространенности туберкулезного процесса и лекарственной чувствительности возбудителя 97
4.2 Изучение показателей клеточного звена иммунитета при инфильтративном туберкулезе различной распространенности с учетом различной лекарственной чувствительности возбудителя 109
4.3 Оценка некоторых показателей гуморального иммунитета у пациентов с инфильтративным туберкулезом легких различной распространенности процесса и разной лекарственной чувствительности M.tuberculosis 120
ГЛАВА 5. Функционально-метаболическая оценка фагоцитов и популяционного состава иммуноком 4 петентных клеток крови больных в зависимости от фазы активности туберкулемы 132
5.1 Сравнительная функционально-метаболическая оценка фагоцитирующих клеток больных в зависимости от фазы активности туберкулемы 132
5.2 Изучение показателей клеточного звена иммунитета у больных с разными фазами активности туберкулемы 139
5.3 Оценка некоторых показателей гуморального иммунитета у пациентов с разными фазами активности туберкулемы 146
Заключение 153
Выводы 164
Практические рекомендации 166
Список сокращений 167
Список литературы
- Реакция иммунной системы на M.tuberculosis
- Общеклинические методы исследования
- Изучение показателей клеточного звена иммунитета в зависимости от формы туберкулезного воспалительного процесса
- Изучение показателей клеточного звена иммунитета при инфильтративном туберкулезе различной распространенности с учетом различной лекарственной чувствительности возбудителя
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Заболеваемость туберкулезом в Российской Федерации остается на стабильно высоком уровне (Нечаева О.Б. и соавт. Ресурсы и деятельность противотуберкулёзных организаций Российской Федерации в 2014 – 2015 гг. (статистические материалы). М.: РИО ЦНИИОИЗ, 2016. 104 с.).
В развитии инфекционного процесса, обусловленного наличием M.tuberculosis,
важную роль играют как биологические свойства возбудителя, так и иммунологическая
реактивность организма (Мишин В.Ю. и соавт. Рецидивы туберкулеза органов дыхания.
Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. №4. С.11-13; Белова Е.В. и соавт. Оценка
влияния иммунологической реактивности на чувствительность к туберкулину у длительно и
часто болеющих детей в первичном звене здравоохранения в условиях
фтизиопедиатрического участка. Вестник новых медицинских технологий. 2015. №2. с.9.) [2].
Ключевыми звеньями в защите организма от M.tuberculosis являются фагоциты (Сахно Л.В. и соавт. Дисфункции макрофагов, генерированных из моноцитов крови больных туберкулезом легких. Бюллетень СО РАМН. 2010. №30(2). С.101-108) и другие клетки иммунной системы, что оправдывает необходимость комплексного подхода к изучению популяционного состава клеток крови (Randall P.J. et al. M.tuberculosis infection of the ‘non-classical immune cell’. Immunol. and cell biology. 2015. №3. doi:10.1038/icb.2015.43).
В большинстве ранее опубликованных работ туберкулез, с точки зрения оценки иммунологических показателей, исследован без учета его форм, которые отличаются как по морфологии, так и по клиническим проявлениям (Комиссарова О.Г. и соавт. Особенности синдрома системного воспалительного ответа и морфологических реакций в лёгочной ткани у больных туберкулёзом лёгких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя. Туберкулез и болезни легких. 2011. №10. С.44-49; Тарасова Л.Г. и соавт. Иммунологический статус больного туберкулезом. Инфекция и иммунитет. 2015. Т.5. №1. С.85-88). Преимущественно туберкулез легких представлен одной из трех клинических форм, отражающих типовые тканевые реакции при туберкулезе: туберкулема, инфильтративный (ИТЛ) и фиброзно-кавернозный туберкулез (ФКТ). Индивидуальные особенности иммунного ответа между ними изучены недостаточно. Это определяет актуальность исследования иммунокомпетентных клеток и некоторых показателей гуморального иммунитета в дифференциальной диагностике основных типов течения туберкулеза легких. Важной становится разработка алгоритма обследования больного для определения фазы активности туберкулемы, оценки реакции иммунной системы на присутствие возбудителя с разной лекарственной чувствительностью (ЛЧ). Изложенное определило цель исследования.
Цель исследования: Выявить взаимосвязи функциональной активности фагоцитов и популяционного состава иммунокомпетентных клеток крови с основными вариантами клинического течения воспалительного процесса при туберкулезе легких (туберкулема, ин-фильтративный, фиброзно-кавернозный туберкулез).
Задачи исследования:
-
Провести анализ функционально-метаболической активности фагоцитов, показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных с туберкулемами легкого, в том числе исследовать реакцию крови в зависимости от фазы активности процесса, разработать иммунологические критерии активности туберкулемы. Предложить способ лабораторной диагностики активности фазы туберкулемы с использованием метода проточной цитофлюориметрии.
-
Изучить основные иммунологические показатели у больных с инфильтративным туберкулезом легких, в том числе с различной распространенностью патологического процесса
и в зависимости от реакции организма на присутствие возбудителя с разной лекарственной чувствительностью. Разработать иммунологические критерии оценки распространенности инфильтративного процесса, реакции организма на присутствие возбудителя туберкулеза с различной лекарственной чувствительностью.
-
Установить изменения иммунологических показателей, характеризующих фиброзно-кавернозный туберкулез легких и выделить лабораторные критерии, отражающие его наличие у больного.
-
Выявить информативные лабораторные критерии наличия любой формы туберкулеза легких – туберкулемы, инфильтративного туберкулеза или фиброзно-кавернозного туберкулеза. Разработать алгоритм интерпретации результатов иммунологического обследования больного для оценки течения инфекционного процесса, а именно: дифференциации формы туберкулезного процесса, установления фазы активности туберкулемы, распространения ин-фильтративного туберкулеза легких, определения реакции организма на присутствие возбудителя туберкулеза с разной лекарственной чувствительностью, определить аналитические характеристики лабораторных тестов.
Методология и методы исследования. Исследования проведены в лаборатории диагностических и экспериментальных методов исследования ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России с 2011 по 2014 годы. Обследованы 160 человек, проходивших лечение в отделениях клиники института: обучающая выборка - 99 больных разными формами туберкулеза легких и 25 практически здоровых людей (контрольная группа), тестовая выборка - 36 человек. Больные имели один из трех морфологических вариантов воспалительной тканевой реакции: преимущественно продуктивный, клиническим аналогом которого является туберкулема; преимущественно экссудативный (аналог – ИТЛ) и промежуточный тип тканевой реакции (ФКТ). В работе использованы результаты бактериологических, молекулярно-генетических, гистологических и иммунологичеких методов у больных с различными формами туберкулезного процесса. Анализ данных проведен в сравнении с результатами контрольной группы, также выполнено внутри- и межгрупповое сравнение. Изучение проведено в соответствии с этическими принципами научной деятельности и одобрено Комитетом по этике ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России, протокол №12 от 26.06.13 года.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Высокая степень достоверности результатов, обоснованность выводов получена при обследовании групп, достаточных по количеству пациентов, применении современных стандартизированных методик, использовании актуальных статистических методов обработки данных. Отбор пациентов осуществлялся в соответствии с критериями включения и исключения. Принадлежность пациентов к изученным выборкам устанавливалась врачами-специалистами по данным клинического, рентгенологического, бактериологического, патоморфологического обследований. Использованы адекватные статистические методы обработки данных, для проверки математических моделей – независимая тестовая выборка.
Основные результаты работы доложены на Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2013), Региональной научно-практической конференции с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений» (Екатеринбург, 2013), II конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров (Санкт-Петербург, 2013), 15-м Международном конгрессе по иммунологии (Милан, 2013), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «От эпидемиологии к диагностике инфекционных заболеваний: подходы, традиции, инновации» (Санкт-Петербург, 2014), Российском научном форуме на Урале с международным участием «Актуальные вопросы фундаментальной медицины», XI Уральском съезде иммунологов (Екатеринбург, 2014), III Конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров: «Современные направления развития фтизиатрии: научные разработки и практический опыт борьбы с туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2014), XV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе
«Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015), VII Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 2015), 4-м европейском конгрессе по иммунологии (Вена, 2015).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Выполнение иммунологических тестов проведено автором самостоятельно. Определение основной идеи, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, цели, задач работы, разработка методологии диссертационного исследования, интерпретация и анализ полученных результатов проводились диссертантом совместно с научным руководителем д.б.н. Бердюгиной О.В., научным консультантом д.м.н. Скорняковым С.Н. Подбор групп пациентов осуществлялся совместно с врачами клиники, заведующими отделений. Патоморфологическое, бактериологическое, молекулярно-генетические, рентгенологическое исследования осуществлялись при участии специалистов соответствующих лабораторий и отделений. Анализ, систематизация, обобщение литературы по изучаемому вопросу проводились автором самостоятельно. Статистическая обработка данных, оформление рукописи диссертации, формулировка положений, выносимых на защиту, выводов и практических рекомендаций, представление результатов исследования в виде докладов на конференциях осуществлялись диссертантом лично. Подготовка публикаций по теме диссертации осуществлялась автором совместно с научным руководителем.
Положения, выносимые на защиту:
-
У больных туберкулезом легких вне зависимости от клинической формы заболевания, фазы активности, распространенности процесса, вида лекарственной чувствительности возбудителя наблюдается увеличение числа Т-хелперов, экспрессирующих CD95, количества T-reg-клеток, увеличение концентрации MIF (фактор ингибирования миграции макрофагов).
-
Изменения результатов индивидуальных иммунологических показателей позволяют оценить активность туберкулезного процесса, его распространенность, реакцию организма на присутствие возбудителя, имеющего разную лекарственную чувствительность.
-
Распространенность туберкулезного процесса ассоциирована со снижением метаболической активности моноцитов и увеличением концентрации IL-10, фазу активности туберкулемы отражает увеличение экспрессии CD11b, HLA-DR на моноцитах и CD11b на нейтрофилах.
Научная новизна
-
Впервые установлено, что все изученные формы туберкулезного воспалительного процесса легких (инфильтративный, фиброзно-кавернозный туберкулез и туберкулема) независимо от фазы активности, распространенности заболевания и вида лекарственной чувствительности возбудителя, сопровождаются увеличением количества T-reg-клеток и Т-хелперов, экспрессирующих CD95.
-
Впервые выделены особенности функционально-метаболической активности фагоцитов, клеточного и гуморального звена иммунитета больных в зависимости от формы туберкулеза легких, распространенности патологического процесса и фазы активности туберкулезного процесса. Впервые доказано, что туберкулема легкого сопровождается снижением экспрессии HLA-DR и продукции супероксид-аниона моноцитами, увеличением числа Т-лимфоцитов, повышением на них экспрессии CD95, повышением числа Т-хелперов, -Т-клеток, снижением количества NK-лимфоцитов; инфильтративный туберкулез характеризуется увеличением числа моноцитов, экспрессирующих HLA-DR, снижением количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD95, уменьшением количества Т-цитотоксических лимфоцитов; фиброзно-кавернозный туберкулез ассоциирован с повышением экспрессии молекул адгезии CD11b и CD11c на моноцитах, увеличением функционально-метаболической активности гранулоцитов, увеличением количества В-лимфоцитов.
-
Впервые определено, что иммунологическими характеристиками инфильтративного туберкулеза 4 и более сегментов легкого являются снижение общего количества
лимфоцитов, и их популяций: Т-лимфоцитов, Т-цитотоксических клеток, а также повышение уровня INF-.
-
Впервые охарактеризована реакция организма на присутствие лекарственно-чувствительного возбудителя туберкулеза при инфильтративном процессе, выражающаяся в повышении экспрессии HLA-DR и снижении экспрессии CD11с на моноцитах крови, повышении экспрессии CD11b на гранулоцитах, повышении экспрессии HLA-DR и снижении СD95 на Т-лимфоцитах, увеличении числа NK-лимфоцитов, снижении количества В-клеток и понижении уровня IL-4 в сравнении с показателями у здоровых лиц. Реакция иммунной системы на присутствие M.tuberculosis с МЛУ при инфильтративном туберкулезе легких характеризуется понижением числа NKТ-клеток, увеличением соотношения CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов.
-
Впервые описаны индивидуальные особенности иммунологических показателей крови, характеризующие активные туберкулемы легких: увеличение количества гранулоцитов и лимфоцитов, снижение индекса CD4+/CD8+, а также туберкулемы в фазе умеренной и стихающей активности – понижение экспрессии HLA-DR на моноцитах, увеличение экспрессии СD95 на Т-лимфоцитах, повышение количества -Т-клеток, снижение концентрации INF- в сравнении с показателями здоровых людей.
-
Впервые выявлена ассоциация количества -Т-клеток с направлением течения туберкулезного процесса легких, в частности при туберкулемах абсолютное количество -Т-клеток увеличивается почти в полтора раза, а при инфильтративном и фиброзно-кавернозном туберкулезе количество этих клеток заметно снижается.
-
Впервые предложен способ лабораторной диагностики активности туберкулемы с использованием метода проточной цитофлюориметрии.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Проведенное исследование позволило выявить взаимосвязь функциональной активности фагоцитов и популяци-онного состава иммунокомпетентных клеток крови с вариантом клинического течения туберкулеза легких. На основании данных лабораторных исследований разработаны критерии оценки активности туберкулемы, увеличения объема поражения тканей при инфильтратив-ном туберкулезе легких, дифференцирования реакции организма на присутствие возбудителя, имеющего разную лекарственную чувствительность. Полученный патент на изобретение «Способ оценки активности туберкулемы» (Пат. 2585385 Российская Федерация, МПК G01N 33/53) позволяет повысить эффективность диагностики до оперативного вмешательства. Алгоритм обследования больного, разработанный в дополнение к стандартному клинико-рентгенологическому обследованию пациента, позволяет повысить эффективность оценки активности и распространенности процесса, выявить реакцию организма на присутствие возбудителя с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования
внедрены в практику работы кафедры фтизиатрии и пульмонологии педиатрического
факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего образования «Уральский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, использованы в программе
дополнительного профессионального образования по специальности «Фтизиатрия» на базе
Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-
исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства Здравоохранения
Российской Федерации. Они включены в программу обследования пациентов
Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Противотуберкулезный
диспансер города Екатеринбурга» Свердловской области. Разработанный комплекс
лабораторных тестов позволяет оценивать активность туберкулемы легких,
распространенность инфекционного процесса при инфильтративном туберкулезе, определять
реакцию организма на присутствие возбудителя с различной лекарственной
чувствительностью. Способ лабораторной диагностики активности туберкулемы дает
возможность повысить эффективность комплексной оценки активности процесса на дооперационном этапе.
Публикации. Соискатель имеет 40 печатных работ, из них по теме диссертации опубликовано 16 научных работ общим объемом 2,21 печатных листа, в том числе 8 публикаций и 1 патент в журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 2 статьи опубликованы в сборниках, входящих в базу РИНЦ. Соискателем опубликовано 5 работ в материалах всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Объем диссертации – 193 страницы печатного текста. Диссертация содержит 26 таблиц, 6 рисунков. Список литературы включает 93 отечественных и 63 иностранных источника.
Реакция иммунной системы на M.tuberculosis
В последние годы в иммунологических лабораториях при противотуберкулезных учреждениях все чаще стало появляться современное диагностическое оборудование, позволяющее получать значительно более достоверные сведения о состоянии противоинфекционной защиты организма, чем при использовании ранее применявшихся устаревших малопродуктивных и низкоинформативных методик.
Примером может являться внедрение метода проточной цитофлюориметрии для определения функционально-метаболической активности фагоцитов. Оценка поглотительной способности клеток на проточном цитофлюориметре, которая используется пока лишь в некоторых лабораториях, дает возможность выявлять несколько тысяч фагоцитов за короткий период времени, тогда как использование стандартной методики – оценки фагоцитоза методом микроскопии – позволяет сфокусироваться не более чем на 100 – 200 клетках. Это же можно сказать и об оценке бактерицидной способности фагоцитов – анализе оксидативного потенциала клетки. НСТ-тест (тест восстановления нитросинего тетразолия), ранее широко применяемый для этой цели, отличается субъективностью определения и сложностью подсчета более 100 – 200 клеток в одном образце. Кроме того, используя данную малопродуктивную методику, можно было установить только функциональную активность нейтрофилов, так как популяция этих клеток в крови составляет до 65% от числа всех лейкоцитов, моноциты из-за их небольшого количества, оставались неисследованными.
Изучение окислительного взрыва, поглотительной способности фагоцитов, их способности к миграции в очаг воспаления методом проточной цитофлюориметрии за рубежом находит все более широкое клиническое применение, так как не имеет перечисленных выше недостатков. В последние годы эти исследования начали входить в практику и некоторых отечественных лабораторий. Для постановки одного из самых современных методов диагностики туберкулеза – квантиферонового теста – на данный момент используется преимущественно ИФА, однако уже существуют попытки адаптации этого теста к проточной цитофлюориметрии [118]. Прочие цитокины также все более широко анализируются методом проточной цитометрии [82].
До недавнего времени оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови осуществлялась при помощи моноклональных антител (МКАТ) и люминесцентного микроскопа. В последние годы в практику лабораторий в качестве средства измерения количества меченых клеток прочно входит проточная цитофлюориметрия. Для определения субпопуляционного состава лимфоцитов фирмами-производителями выпускается огромное количество МКАТ и их сочетаний с разными типами флюорохромов. Оценка иммунного статуса методом проточной цитофлюориметрии уже вошла в число рутинных исследований во многих лабораториях. Несомненным преимуществом этого метода над микроскопией является скорость анализа образца и значительно большее количество клеток, которые могут быть подсчитаны прибором, по сравнению с тем количеством, которое способен подсчитать оператор, используя микроскоп. Следствием этого является более качественная идентификация субпопуляций клеток, более корректный результат анализа. Кроме того, при микроскопии невозможно окрашивание клеток несколькими флюоресцентными красителями одновременно, в то время как при анализе иммунокомпетентных клеток методом проточной цитофлюориметрии допускается проведение окрашивания до девяти – двенадцати и даже шестнадцати флуорохромами одной клетки [80, 81].
Другим иммунологическим методом, широко используемым во фтизиатрии, является ИФА. Он известен свыше 40 лет, однако только в последние годы его широко стали использовать для изучения гуморальных факторов иммунитета, в частности определения уровня цитокинов [10, 43]. За короткий период были разработаны десятки апробированных тест-систем.
В целом, диагностические возможности изучения иммунных нарушений при туберкулезе в настоящее время существенно превышают потенциал иммунологов начала и середины XX века, что, несомненно, сыграло важную роль в последних достижениях ученых этой области науки.
Исследования последних лет подводят нас к тому, что среди основных факторов, определяющих риск заболеть туберкулезом, не последнюю роль играет наследственный [7, 65]. Это связывают с особенностями функционирования системы внутриклеточного клиренса фагоцитов [24], с дефектами системы гуморальных факторов резистентности слизистых оболочек [151], с изменением структуры лектина, отвечающего за распознавание углеводов у патогенов [129]. Очевидно, что определенную роль в инфицировании играет также такой наследственный фактор, как уровень половых гормонов, так как среди мужчин туберкулез встречается чаще, чем среди женщин [11]. Имеет значение продолжительность контакта с очагом инфекции [73].
Установлено, что не у всех контактирующих с патогеном развивается заболевание, риск развития туберкулеза у впервые инфицированного человека составляет около 2% впервые 2 года после заражения [51]. Существует естественная резистентность многих тканей организма человека к туберкулезной инфекции [74, 86]. Предполагается, что исход взаимодействия между микро- и макроорганизмом зависит, в значительной степени, от иммунологической толерантности организма пациента, поэтому для понимания процессов формирования резистентности к туберкулезной инфекции необходимо учитывать количественное и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток.
Взаимодействие патогена и иммунной системы вызывает реакцию и клеточного, и гуморального звеньев иммунитета, также изменяется фагоцитарная активность клеток [24]. Начиная с 60 – 70 годов прошлого столетия и по настоящее время множество исследований посвящено роли фагоцитирующих клеток, лимфоцитарного и гуморального звена иммунитета в развитии инфекции, вызываемой M.tuberculosis [1, 4, 9, 28, 34, 36]. Исследуются уровень продукции интерлейкинов (IL, interleukin), в том числе фактора некроза опухоли (TNF, tumor necrosis factor), нейтрофильной эластазы, катионных белков, миелопероксидазы [41], оксида азота (NO), активных форм кислорода, уровень апоптоза лейкоцитов [89].
На данный момент общепризнанной считается точка зрения, что первой и основной линией защиты против инфекции, после того как M.tuberculosis достигли нижнего отдела респираторного пути, служат альвеолярные макрофаги [1, 24, 85]. Эти клетки способны непосредственно подавлять рост бактерий, фагоцитируя их, а также участвовать в широком спектре реакций клеточного противотуберкулезного иммунитета – через презентацию антигена, стимуляцию накопления Т-лимфоцитов в очаге воспаления и других реакциях.
Взаимодействие макрофагов и микобактерий может закончиться двумя путями. Если макрофагу удается выполнить свои функции, контакт завершается перевариванием и элиминацией возбудителя. Однако так происходит не всегда. В противном случае возникает латентное бациллоносительство, при котором формируется равновесие между возбудителем и хозяином [1, 51].
Общеклинические методы исследования
Во второй подгруппе – у пациентов с туберкулемами в фазе стихающей и умеренной активности – средний возраст пациента на момент выявления заболевания был 30,1±2,2 года, к моменту формирования туберкулемы – 32,1±1,9 года. Жалобы перед госпитализацией предъявил только 1 пациент этой подгруппы (боли в подлопаточной области). У 2 из 15 пациентов отмечались осложнения на прием противотуберкулезных препаратов в виде тошноты, рвоты, жжения кожи. Курящими по данным опроса больных и результатам гистологического исследования резектата легких оказались 8 (53,3%) пациентов.
При исследовании операционного материала, обнаружено, что из 8 обследованных в 2 (25,0%) случаях возбудитель заболевания оказался ЛЧ, в 6 (75,0%) – была выявлена МЛУ. Средняя продолжительность пребывания в стационаре составила 60,7±15,9 дней.
Вторую группу составили 44 человека с преимущественно экссудативным характером процесса – инфильтративным туберкулезом легких – средний возраст которых был 35,4±4,6 года. В этой группе 26 (59,1%) пациентов были мужчины, 18 (40,9%) – женщины. Сопутствующая патология встречалась у 35 больных (79,5%), чаще других отмечались язва желудка, хронический гастрит, однократно: хронический пиелонефрит, хронический холецистит, хронический простатит, хроническая обструктивная болезнь легких, двусторонняя нейросенсорная потеря слуха, гипертоническая болезнь, все – в стадии стойкой ремиссии. Диагноз впервые был установлен в среднем за 3 года и 3 месяца до госпитализации в стационар (от 5 месяцев до 29 лет). Средний возраст пациента на момент выявления заболевания составлял 34,6±1,7 года. Туберкулезный контакт отрицали 35 больных (79,5%), у остальных он был выявлен по месту работы, в семье или в местах лишения свободы. Из всех обследованных инфильтративным туберкулезом у 29 больных распространенность патологического процесса была в пределах 1-3 сегментов одной доли легкого, они составили первую из двух подгруппу пациентов. Деление производили согласно общепринятой классификации [30]. Основные клинические характеристики представлены в таблице 2.2. Средний возраст пациента на момент выявления заболевания составлял 33,0±2,0 года. Жалобы перед госпитализацией предъявляли 19 пациентов (67,9%), у остальных больных туберкулез был выявлен при профилактическом осмотре. Преимущественно отмечались кашель с мокротой, слабость, одышка, субфебрильная температура. Наиболее частая локализация процесса – верхняя доля правого легкого: 1, 2, 4 сегменты, реже – левого легкого. Нижние сегменты – 9 и 10 – были затронуты процессом только у 3 пациентов. У 19 (65,5%) больных выявлены осложнения на прием противотуберкулезных препаратов в виде тошноты, рвоты, у 7 – потребовалась отмена препарата. Наряду с противотуберкулезной химиотерапией (ПТХ) у 16 (55,2%) пациентов применялись методы коллапсотерапии (искусственный пневмоторакс, пневмоперитонеум, клапанные бронхоблокаторы). Курящих было 13 (44,8%) человек. Бактериовыделение до начала лечения наблюдалось у 24 (82,8%) больных, в процессе лечения бактериовыделение прекращалось. Чувствительность возбудителя варьировала от полной чувствительности до устойчивости к 7 – 9 противотуберкулезным препаратам. Средняя продолжительность пребывания в стационаре составила 170,6±14,0 дней. Основная масса больных выписана была с улучшением состояния или выздоровлением, у двоих было отмечено формирование каверны. В связи с тем, что заболевание у пациентов первой подгруппы было вызвано изолятами M.tuberculosis, имевшими разную чувствительность к противотуберкулезным препаратам: в первом случае туберкулез вызывался ЛЧ изолятами, во втором изолятами с МЛУ (устойчивыми к сочетанию изониазида и рифампицина, независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам), нами была поставлена задача изучения взаимосвязи иммунологических показателей, характеризующих основные звенья иммунологической системы пациента (клеточное, гуморальное и фагоцитоз) при инфильтративном туберкулезе, вызванном с одной стороны ЛЧ изолятами M.tuberculosis, с другой – изолятами с МЛУ. На основании этого, первая подгруппа больных инфильтративным туберкулезом легких была дифференцирована на два кластера в зависимости от наличия или отсутствия лекарственной устойчивости изолятов M.tuberculosis, вызвавших туберкулез легких.
Первый кластер объединил 12 пациентов, у которых заболевание было вызвано ЛЧ изолятами M.tuberculosis. Основные клинические данные пациентов представлены в таблице 2.2. Средний возраст обследованных на момент выявления заболевания составлял 34,0±3,3 года. Восемь (75,0%) пациентов этой группы жаловались перед госпитализацией на одышку, кашель, слабость, потерю массы тела, потливость по ночам. Патологический процесс преимущественно был локализован в правом легком – в 8 (66,7%) случаях. Отмечались осложнения на прием противотуберкулезных препаратов у 7 (58,3%) пациентов, заключавшиеся преимущественно развитии токсического гепатита, кохлеопатии. Курящих было 5 (41,7%) больных. Бактериовыделение на момент поступление в клинику присутствовало у 70,0% пациентов. Больные находились в стационаре в среднем 139,0±23,2 дня. Большинство больных были выписаны с клиническими и рентгенологическими признаками улучшения или выздоровления, в одном случае было отмечено формирование фиброза на месте инфильтрата.
Изучение показателей клеточного звена иммунитета в зависимости от формы туберкулезного воспалительного процесса
Соотношение CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов незначительно увеличивалось при туберкулемах и инфильтративном туберкулезе (на 7,1 и 6,6% соответственно) относительно группы доноров, вместе с тем во всех четырех обследованных группах среднее значение этого показателя находилось в пределах нормы. Стоит отметить, что внутри групп разброс значений был достаточно большим. Если в контрольной группе данный индекс почти всех испытуемых (за исключением 2 человек) находился в пределах среднестатистической нормы, то у больных с туберкулемами и инфильтративным туберкулезом 22,6% и 31,0% значений находились в пределах 0,6 – 1,0 и 2,5 – 4,4 относительных единиц, что, с нашей точки зрения, свидетельствует о дисбалансе в системе клеточного иммунитета при инфекции, вызванной M.tuberculosis. Наименьшие отклонения в величине индекса CD4+/CD8+ отмечались при ФКТ – средние величины и разброс показателя внутри этой группы были наиболее близки к показателям доноров.
Большой интерес у исследователей в настоящее время вызывает такая популяция Т-лимфоцитов как -Т-клетки (СD45+CD3brightCD4-). Это связано с тем, что она несет Т-клеточный рецептор, распознающий микробный фосфолипидный антиген (3-формил-1-бутил пирофосфат), имеющийся на М.tuberculosis, в результате чего эти клетки могут напрямую связываться с патогеном. Результаты исследования уровня этих клеток при различных инфекционных патологиях суммированы в обзорах [54]. В процессе изучения этой популяции клеток были получены следующие данные. В группах пациентов изменения в количестве этих клеток были различны и весьма существенны. Разброс значений был очень большим даже в контрольной группе и составлял от 0,008 до 0,203 109 / клеток на литр (0,4 – 9,4%). При отграниченных формах туберкулеза (туберкулемы) абсолютное количество этих клеток увеличивалось почти в полтора раза (на 45,5%), относительное – на 36,4%. При двух других формах заболевания этот показатель заметно снижался: абсолютное число клеток в обеих группах снижалось более чем в 1,5 раза, относительное – на 27,3% при инфильтративном туберкулезе и на 39,4% при ФКТ в сравнении с группой здоровых лиц. Установлено также, что абсолютное количество этих клеток при туберкулемах в 2,3 раза превышало этот показатель при инфильтративном туберкулезе и в 2,5 раза – при ФКТ. Можно предположить, что -Т-клетки играют существенную роль в развитии туберкулезного процесса, их повышенное количество способствует усилению сопротивляемости организма пациента инфекции и отграничению туберкулезного процесса, а недостаточное количество – способствует активации патологического процесса.
Количество NKT-клеток (CD45+CD3+CD16+CD56+) незначительно нарастало при туберкулемах, а при инфильтративном и ФКТ увеличивалось почти в полтора раза в сравнении с показателями здоровых лиц (р 0,05). Число NKT-клеток в этих двух группах также превышало этот показатель при туберкулемах на 28,8%.
Количественное исследование не позволяет оценить функциональные и кооперативные способности клеток. Исследование экспрессии маркеров ранней (CD25) и поздней (HLA-DR) активации Т-лимфоцитов отражает изменение функциональной активности лимфоцитов. Проведенные исследования позволили получить дополнительные сведения о происходящих в организме процессах. Количество активированных Т-лимфоцитов (CD3+CD25+), экспрессирующих альфа-цепь рецептора IL-2, у больных с инфильтративным туберкулезом было снижено, а у пациентов с фиброзно-кавернозным, напротив – повышено (на 23,7%). У больных с туберкулемами количество активированных Т-лимфоцитов превосходило значение в контрольной группе на 30,3%.
Количество активированных Т-хелперов (CD3+СD4+CD25high), так же как и в целом активированных Т-лимфоцитов, у больных с туберкулемами и ФКТ было повышено соответственно на 21,1% и 31,6%.
При исследовании такого маркера поздней активации клеточного звена иммунитета как экспрессия HLA-DR на Т-лимфоцитах наблюдалась иная зависимость: число лимфоцитов, экспрессирующих этот маркер, было снижено во всех исследуемых группах и в абсолютном и в относительном выражении: при ФКТ незначительно – на 6,7%, при туберкулемах и инфильтративном туберкулезе – на 17,8% в сравнении с контрольными показателями. В этих двух группах количество HLA-DR+-Т-лимфоцитов было одинаковым и ниже, чем у пациентов с ФКТ на 11,9%. Одним из механизмов реализации процесса гибели лимфоцитов является повышенная чувствительность клеток к активационно-индуцированному апоптозу, опосредованному рецептором Fas/Apo-1(CD95), принадлежащему к суперсемейству TNF. Экспрессия маркера вероятности апоптоза – CD95 – на лимфоцитах (CD3+CD95+), выявленная при ФКТ, оставалась на уровне показателя контрольной группы, при туберкулемах была на 15,4% выше, а при инфильтративном туберкулезе – на 17,9% ниже показателей доноров крови и больных ФКТ. Различия в абсолютных значениях между больными с туберкулемами и болевшими инфильтративным туберкулезом составляли почти 1,5 раза (р 0,05).
Субпопуляция Т-хелперов, несущая маркеры вероятности апоптоза (CD3+СD4+CD95+), была увеличена у всех больных с разными формами туберкулезного воспалительного процесса. При туберкулезелегких с формированием ограничения специфического процесса – туберкулемы – на 38,1% , а при инфильтративном туберкулезе легких и ФКТ – на 23,8%.
Центральными регуляторами иммунного ответа, определяющими его силу и продолжительность, являются регуляторные клетки. Их деятельность опосредуется через изменение функций Т-эффекторных клеток (Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток). В нашем исследовании было установлено, что абсолютное количество регуляторных Т-клеток (T-reg – CD3+CD4+CD127-CD25+) было достоверно повышено по сравнению с контролем во всех трех группах в 1,5 раза. Этот показатель также имел статистически достоверные отличия и между группами больных: уровень клеток при инфильтративном туберкулезе на 16,7% превышал этот показатель при туберкулемах и ФКТ.
Изучение показателей клеточного звена иммунитета при инфильтративном туберкулезе различной распространенности с учетом различной лекарственной чувствительности возбудителя
Изменения в количестве Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) были более значимыми. Их популяция оказалась сниженной в подгруппе с ин-фильтративным туберкулезом 1-3 сегментов легкого, в обоих кластерах с ЛЧ и лекарственно-устойчивыми изолятами M.tuberculosis на 13,6%, а в подгруппе с распространенными процессами – на 32,2% в сравнении с контролем. В последнем случае различие с группой доноров было статистически достоверным. Доля этих клеток от общего числа всех лимфоцитов также была снижена в подгруппах и кластерах. Максимального снижения она достигала у пациентов с инфильтративным туберкулезом распространенностью более трех сегментов – на 16,7% в сравнении с контрольной группой. Поскольку известно, что основной функцией Т-цитоксических клеток является непосредственный контакт с поврежденными клетками и их разрушение, то снижение их количества у больных с туберкулезом 4 и более сегментов может свидетельствовать об их недостаточной защитной роли в осуществлении иммунного ответа организма.
Величина отношения основных Т-клеточных популяций CD4+ к CD8+ изменялась в соответствии с вышеописанной динамикой числа соответствующих лимфоцитов: в подгруппе с инфильтративным туберкулезом 1-3 сегментов легкого, в обоих кластерах с ЛЧ и лекарственно-устойчивыми изоля-тами M.tuberculosis она оставалась на уровне значений контрольной группы.
У больных подгруппы с распространенными процессами данный индекс за счет снижения числа Т-цитотоксических клеток увеличивался на 16,7% в сравнении с показателями, обнаруженными в группе доноров и на 22,7% в сравнении с подгруппой, патологический процесс в которой распространялся на 1-3 сегмента легкого.
Изучение -Т-клеток (СD45+CD3brightCD4-) началось сравнительно недавно, их роль в иммунных процессах остается до конца не выясненной, однако многие исследователи отводят этим клеткам весьма существенную роль в обеспечении резистентности организма к микроорганизмам, в частности, к
M.tuberculosis. Согласно полученным в предоставленном исследовании данным, количество -Т-клеток было снижено у всех пациентов с инфильтратив-ным туберкулезом. При изучаемом процессе с ЛЧ возбудителем снижение было наименьшим и составляло 18,2% в сравнении с контрольной группой. Наличие возбудителя с МЛУ сопровождалось снижением -Т-клеток в 1,9 раза. Туберкулез 1-3 сегментов легкого приводил к снижению числа клеток на 57,1%, а 4 и более сегментов – уже на 69,2%. Относительное количество этих клеток также было также понижено во всех изученных подгруппах и кластерах больных. Максимальное снижение наблюдалось в кластере пациентов с МЛУ возбудителем заболевания – в 1,7 раза в сравнении с группой здоровых добровольцев. В целом стоит отметить, что наибольшее число этих клеток обнаруживалось в крови кластера больных с ЛЧ изолятами M.tuberculosis в сравнении с другими больными. Последнее позволяет предположить, что при противостоянии ЛЧ изолятам M.tuberculosis небольшое снижение количества -Т-клеток не является критичным, с другой стороны можно заключить, что значимое понижение числа этих клеток у больного является одним из прогностических критериев заболевания его туберкулезом, вызываемым возбудителем с МЛУ. Именно этим подтверждаются сведения о соотношении числа -Т-клеток кластера пациентов с лекарственно-устойчивыми изолятами к их количеству в кластере с ЛЧ изолятами в соотношении 1,9:2,9. Также из вышесказанного можно заключить, что наличие -Т-клеток снижает вероятность развития распространенного инфильтративного туберкулезного процесса, так как их количество у больных с поражением 1-3 сегментов превосходит значения данных больных из подгруппы с распространенностью 4 и более сегмента. NKT-клетки являются одной из важных субпопуляций иммуно-компетентных клеток. В нашем случае было выявлено увеличение количества NKT-клеток (CD45+CD3+CD16+CD56+) у всех больных. Абсолютное число NKT-клеток у пациентов с ЛЧ изолятами M.tuberculosis в 1,9 раза превышало значения этого показателя в контрольной группе, вместе с тем у больных, заболевание которых было вызвано изолятами M.tuberculosis с МЛУ он был увеличен лишь на 32,3%. Таким образом, в первом кластере NKT-клеток было на 45,1% больше, чем во второй, что, как и в случае с -Т-клетками, говорит об их важной иммунорегуляторной роли в ответе на внедрение ЛЧ возбудителя заболевания. В подгруппах с туберкулезом, вовлекающим в процесс 1-3 сегмента легкого, количество NKT-клеток увеличивалось на 56,5%, а при патологическом процессе, протекающем в 4 и более сегментах – на 51,6%, что между собой не имело значимых отличий.
Изучая активацию Т-лимфоцитов, мы получили следующие данные. Экспрессия маркеров ранней активации лимфоцитов CD25 была незначительно повышена при инфильтративном туберкулезе, вызванном ЛЧ возбудителем заболевания (на 5,6%), а также в подгруппе с инфильтративным туберкулезом распространенностью более 3 сегментов (на 10,5%). У пациентов с возбудителем заболевания, имеющим МЛУ, количество лимфоцитов, экспрессирующих этот маркер, было значительно снижено в сравнении и с контрольной группой (на 22,4%), а также с двумя ранее описанными кластерами больных соответственно на 26,3% и 29,8%. Число активированных Т-клеток среди больных туберкулезом 1-3 сегментов легкого было снижено в сравнении с контрольной группой на 10,1%.
Количество активированных Т-хелперов (CD3+СD4+CD25high) было незначительно увеличено у всех обследованных больных инфильтративным туберкулезом, однако только в кластере больных с ЛЧ изолятами возбудителя он достоверно превосходил значения контрольной группы, повышаясь более чем в 1,5 раза.