Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор научной литературы .13
1.1. Теории возникновения и развития эндометриоза .13
1.2. Иммунологические аспекты развития эндометриоза
1.2.1. Интерферон- в развитии и патогенезе эндометриоза .16
1.2.2. Роль натуральных киллеров при эндометриозе 17
1.2.3. Участие IL-6 в патогенезе и развитии эндометриоза 19
1.2.4. Участие IL-8 и TNF- в патогенезе эндометриоза 20
1.3. Ангиогенные факторы роста в развитии и патогенезе эндометриоза 23
1.4. Роль цитокинов обладающих аутокринными и паракринными эффектами в патогенезе НГЭ 26
1.5. Роль перитонеальной жидкости в патогенезе и развитии эндометриоза 29
1.6. Другие иммунологические механизмы патогенеза эндометриоза 30
1.7. Современные подходы и перспективы терапии эндометриоза 35
Глава 2. Материалы и методы исследования .38
2.1. Характеристика обследованных групп и анализируемых показателей .38
2.2. Клиническая характеристика обследованных пациенток с эндометриозом .39
2.3. Методы исследования. Объем проведенных исследований 45
Глава 3. Результаты собственных исследований .51
3.1. Результаты хирургического лечения 51
3.2. Количественное содержание IL-6, IL-8, IL-10 в перитонеальной жидкости в зависимости от стадий эндометриоза .54
3.3. Количественное содержание TNF, IL-1, IFN- в перитонеальной жидкости у пациенток с различными стадиями эндометриоза 56
3.4. Уровень продукция фактора роста тромбоцитов (PDGF) в перитонеальной жидкости у женщин с различными стадиями эндометриоза 57
3.5. Клинико-лабораторная характеристика осложненных случаев течения позднего послеоперационного периода 59
3.5.1. Сравнительное содержание провоспалительных цитокинов TNF , IL-1, IFN- в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии 60
3.5.2. Сравнительное содержание IL-6 в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии 61
3.5.3. Сравнительное содержание IL-8 в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии
3.5.4. Сравнительное содержание противовоспалительного цитокина IL-10 в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии 65
3.5.5. Сравнительное содержание PDGF в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии 66
3.6. Коэффициенты соотношения противо- и провоспалительных цитокинов в группе женщин с рецидивом заболевания при первой и повторной лапароскопии 68
3.7. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов и фактора роста тромбоцитов (PDGF) при распространенных формах эндометриоза IV стадии на примере клинических случаев 70
Заключение 77
Выводы 83
Практические рекомендации 84
Перспективы дальнейшей разработки темы исследования 85
Список сокращений 86
Список литературы
- Участие IL-6 в патогенезе и развитии эндометриоза
- Клиническая характеристика обследованных пациенток с эндометриозом
- Уровень продукция фактора роста тромбоцитов (PDGF) в перитонеальной жидкости у женщин с различными стадиями эндометриоза
- Сравнительное содержание PDGF в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В настоящее время одним из важных направлений клинической лабораторной диагностики заболеваний женской репродуктивной системы является определение параметров местного иммунитета, в том числе у женщин с эндометриозом - заболеванием, которое занимает ведущие роли у женщин репродуктивного возраста [Берлев И.В.,2012; Калинина Н. М., 2010; Romer T., 2012].
Эндометриоз – заболевание, характеризующееся ростом ткани, сходной по структуре и функции с эндометрием за пределами его нормальной локализации, развивающееся в условиях нарушений гормонального и иммунного гомеостаза [Айламазян Э.К. и соавт., 2007]. В структуре гинекологической заболеваемости эндометриоз занимает третье место после воспалительных заболеваний и миомы матки. Эндометриоз имеет различные клинические проявления - тазовые боли, бесплодие, нарушение менструальной функции, диспареунию, дисхезию. Эндометриоз наиболее часто встречается в репродуктивном возрасте, больные с эндометриозом составляют 10-15% от общего числа гинекологических заболеваний [Vigant P. Et al., 2004]. Несмотря на появление новых диагностических и лечебных возможностей, в настоящее время имеется тенденция к увеличению встречаемости данного заболевания [Баскаков В.П., 2002; Адамян Л.В., 2006; Bulun S., 2009; Giudice L. et al., 2012]. У больных с бесплодием при лапароскопии наружный генитальный эндометриоз может выявляться в 50-60% случаев [Missmer S.A. et al., 2004]. Существует несколько концепций возникновения и прогрессирования заболевания. Но ни одна из них не может объяснить всего многообразия клинических проявлений заболевания. Основные работы по изучению этиологии и звеньев патогенеза сосредоточены на эпигенетических аспектах, метаболизме половых гормонов и молекулярных особенностях эндометриоидных гетеротопий [Ярмолинская М.И., 2010; Ge C., 2012]. В последние годы одним из приоритетных направлений является изучение иммунных механизмов развития эндометриоза [Михнина Е.А., 2006; Айламазян Э.К., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., 1997; Dmowski W.P., 1994] Уточнению роли провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, оценке ростовых факторов (PDGF, VEGF, EGF, FGF, IGF, TGF-) в перитонеальной жидкости у женщин репродуктивного возраста посвящены ряд исследований последнего десятилетия [Ярмолинская М.И., 2012; Vercillini P., et al. 2013].
В настоящее время гормональный и хирургический методы лечения не являются альтернативами друг другу, а признаются как необходимые этапы комбинированного лечения заболевания большинством авторов. [Rmer T., 2012; Ge C., et al., 2012; Alkatout I., et
al., 2013]. «Золотым» стандартом в лечении эндометриоза являются
хирургические методы. [Yeung P.P.Jr. et al., 2009]. В качестве
консервативной терапии в настоящее время широко применяются
агонисты гонадотроп релизинг-гормонов (АГнРГ), гестагены,
комбинированные эстроген-гестагены, нестероидные
противовоспалительные препараты и ингибиторы ароматазы [American College of Obstetricians and Gynecologists, 2010]. На данный момент ни одна из схем лечения заболевания не может гарантировать отсутствие рецидива, а наличие противопоказаний к ряду препаратов ограничивает их применение.
Учитывая, что контроль тканевого гомеостаза обеспечивается иммунной системой человека, очевидно, что в основе нарушений своевременной элиминации аутологичных клеток из организма лежат иммунологические дисфункции [Пальцев М.А., Кветной И.М. 2006; Hill J.A., etc, 1993; Dmowski W.P., Braun D.P., 2004].
В связи с этим особую актуальность приобретает уточнение механизмов развития иммунопатологического процесса, исследование клинических проявлений и иммунологических нарушений при различных стадиях заболевания.
Степень разработанности темы
Иммунопатогенезу наружного генитального эндометриоза (НГЭ) в настоящее время уделяется внимание многими школами зарубежных и отечественных исследователей [Адамян Л.В. 2006; Михнина Е.А., 2006; Burney R., 2012]. Изучению роли цитокинов также посвящено ряд работ [Анциферова Ю.С.,2007, Dmowski W., 2004; Carmona F., 2012]. Тем не менее, до сих пор, нет четкого представления о том, насколько каждый из изученных иммунологических параметров соотносится с тяжестью заболевания, эффективностью проводимой терапии и прогнозом течения заболевания, в частности с восстановлением репродуктивной функции.
Цель исследования
Выявить диагностическую значимость определения про- и противовоспалительных цитокинов, ростовых факторов в перитонеальной жидкости пациентов с эндометриозом для прогноза течения заболевания.
Задачи исследования
-
Оценить содержание провоспалительных цитокинов TNF, IFN, IL-6, IL-8, IL-1 и противовоспалительного цитокина IL-10, а также фактора роста тромбоцитов (PDGF) в перитонеальной жидкости у пациенток с эндометриозом различных стадий заболевания в момент оперативного вмешательства.
-
Выявить взаимосвязь между стадиями эндометриоза и продукцией провоспалительных цитокинов и фактора роста тромбоцитов в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом.
-
На основании оценки продукции цитокинов в перитонеальной
жидкости выявить предикторы развития рецидивов эндометриоза.
4. Обосновать на основании оценки уровня продукции цитокинов схемы терапии эндометриоза в послеоперационном периоде.
Научная новизна
Впервые проведена сравнительная оценка между уровнями продукции цитокинов и ростовых факторов в перитонеальной жидкости с тяжестью клинических проявлений наружного генитального эндометриоза.
Выявлена четкая взаимосвязь между уровнем продукции провоспалительных цитокинов и стадией заболевания.
Впервые проведено сравнительное исследование факторов ангиогенеза (PDGF) в перитонеальной жидкости при различных стадиях наружнего генитального эндометриоза.
Выявлено, что прогностически неблагоприятными маркерами рецидива заболевания являются: уровни IL-1 >100 пг/мл, IL-8 > 120 пг/мл, IFN- > 120 пг/мл, TNF- > 90 пг/мл.
Теоретическая и практическая значимость работы
Уточнен иммунопатогенез наружного генитального эндометриоза, подтверждена аутовоспалительная природа заболевания. Выявлено значительное повышение фактора роста тромбоцитов, чем подтверждено его участие в иммунопатогенезе заболевания.
Доказано, что повышение продукции провоспалительных цитокинов способствует ангиогенезу и развитию очагов наружного генитального эндометриоза.
Неадекватная продукция противовоспалительного цитокина IL-10, объясняет длительное течение локального иммунного воспаления при наружном генитальном эндометриозе.
Определение цитокинов и фактора роста тромбоцитов в перитонеальной жидкости у больных с наружным генитальным эндометриозом, позволяет прогнозировать тяжесть заболевания и возможность рецидива, а также индивидуализировать комбинированное патогенетическое лечение.
Методология и методы исследования
Методологической основой исследования явилось
последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена с использованием лабораторных (иммунологических, гистологических), хирургических, аналитических и статистических методов. Объектом исследования явились женщины, репродуктивного возраста с НГЭ и пациентки контрольной группы. Предметом анализа была перитонеальная жидкость у пациенток проходившим хирургическое лечение. Статистическую обработку и анализ данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2010 для Windows 7.0. Использованы методы описательной статистики.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Выраженность дисрегуляторных нарушений продукции про- и противовоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости коррелирует со стадиями эндометриоза.
-
Предикторами рецидивирующего характера течения эндометриоза являются высокие уровни провоспалительных цитокинов, повышение продукции тромбоцитарного фактора роста в перитонеальной жидкости, и неадекватное повышение IL-10.
-
Сочетанное использование данных клинического наблюдения и оценки уровня цитокинов, фактора роста тромбоцитов в перитонеальной жидкости в момент оперативного вмешательства, позволяет при малой распространенности процесса и низком уровне продукции цитокинов назначать низко дозированные комбинированные оральные контрацептивы в пролонгированном режиме, а при III-IV стадиях эндометриоза, высокой продукции провоспалительных цитокинов и тромбоцитарного фактора роста использовать препараты агонистов гонадотропин-рилизинг гормона и нестероидные противовоспалительные препараты.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Достоверность полученных результатов обеспечена репрезентативным объемом выборок обследованных пациенток, достаточным количеством выполненных наблюдений с использованием современных методов исследования и адекватным статистическим анализом данных. Научные положения документированы таблицами, рисунками, диаграммами. Результаты работы представлены, доложены и обсуждены на международных и российских конференциях: Всемирный конгресс по эндометриозу (Монтпелье, Франция 2011), научно-практическая конференция «Никифоровские чтения–2012: передовые отечественные и зарубежные медицинские технологии» (Санкт-Петербург, 2012), научно-практическая конференция, посвященной 50-летию основания Санкт-Петербургской клинической больницы Российской академии наук (Санкт-Петербург, 2012), международная научно-практическая конференция «Многопрофильная клиника ХХI века. Современные технологии в эндовидеохирургии» (Санкт-Петербург, 2013), I международная Итальяно-Российская конференция «Лечение эндометриоза с курсом лапароскопии. Онкология и эндометриоз» (Авеллино, Италия 2013), международная научно-практическая конференция «Многопрофильная клиника ХХI века. Высокотехнологичная медицинская помощь» (Санкт-Петербург, 2014).
Результаты диссертационной работы внедрены и реализованы в практической работе отделения гинекологии и отдела клинической лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» МЧС России, а также хирургического отделения ФГБУЗ Клинической больницы Российской академии наук г. Санкт-Петербурга.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-технической
деятельности МЧС России, утвержденным приказом МЧС России №140 от 27.03.2014, в рамках научно-исследовательской работы 5.2.-3/Б «Клиническая лабораторная диагностика соматической патологии», выполненной на базе отдела клинической лабораторной диагностики и отделения гинекологии ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России.
По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, среди них 2 – в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.
Личный вклад автора в получение результатов
Диссертант самостоятельно провел анализ современной литературы, посвященной проблеме диагностики и лечения наружного генитального эндометриоза. Принимал непосредственное участие в оперативном лечении пациенток, проводил забор перитонеальной жидкости с целью дальнейшего исследования в ней уровня цитокинов. Участвовал в лабораторных исследованиях, самостоятельно провел оценку и анализ полученных материалов. Автором обоснованы цели, задачи, научная новизна и практическая значимость исследования, сформулированы основные положения, выносимые на защиту и выводы. Статистическая обработка данных анализ, полученных данных и обобщение результатов исследований были также произведены лично автором. Результаты работы представлены автором лично в публикациях и научных докладах.
Объем и структура работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав описания материала и методов исследования, собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 22 отечественных и 111 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 101 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 рисунками и 12 таблицами.
Участие IL-6 в патогенезе и развитии эндометриоза
Иммунопатогенезу эндометриоза также посвящено достаточное количество работ [78, 94, 110, 125]. Ранние исследования, в которых проводилось изучение иммунных аспектов патогенеза эндометриоза связывали развитие заболевания с повышением в крови абсолютного количества активированных Т-лимфоцитов, активированных Т-хелперов, NK-клеток, В-лимфоцитов, и изменениями содержания иммуноглобулинов классов G и M, при этом количество зрелых Т-лимфоцитов, неактивированных Т-хелперов было снижено. [3].
Некоторые исследователи отмечали только увеличение количества и реактивности В-лимфоцитов в периферической крови у женщин с эндометриозом. [18].
Более поздние наблюдения были посвящены исследованию макрофагов и моноцитов периферической крови, полученным у пациенток с эндометриозом. Синтезируемые ими цитокины, по мнению исследователей, стимулирровали пролиферацию эутопического и эктопического эндометрия in vitro и при этом уменьшали активность апоптоза клеток эндометрия эктопических очагов. [34]. Опираясь на наблюдения, что показатели системного иммунитета не всегда отражают состояние местного иммунитета, в ряде работ исследователей, посвященных иммунопатогенезу эндометриоза была изучена продукция медиаторов иммунитета в перитонеальной жидкости. [131].
Известно, что при повышении числа и активация перитонеальных макрофагов уменьшается количество удаленных клеток эктопического эндометрия в брюшной полости в эксперименте. Повышенные уровни провоспалительных цитокинов, продуцируемые иммунными и эндометриальными клетками стимулируют пролиферацию, воспаление и ангиогенез и тем самым вовлечены в процесс имплантации и роста клеток эктопического эндометрия [108].
Известно, что провоспалительный цитокин TNF- способствует миграции клеток стромы к мезотелию и стимулирует пролиферацию стромальных клеток эндометрия. Было показано, что концентрация TNF- в перитонеальной жидкости выше у женщин с эндометриозом, нежели у пациенток без эндометриоза, и концентрация TNF- коррелирует со стадией эндометриоза.
Было показано, что TNF- в сыворотке также был значительно повышен, в особенности на ранних стадиях заболевания. Известно, что TNF- стимулирует экспрессию простагландин синтазы-2, которая в свою очередь повышает продукцию простагландинов E2 и F2, и является механизмом воспаления и боли при гиперпродукции TNF- [31].
Эндометриоидные гетеротопии содержат, как эстрогеновые рецепторы, так и прогестероновые и отвечают на изменения уровней гормонов продукцией и выходом медиаторов воспаления, в частности простагландинов E2 и F2 [119].
Известно, что простагландины запускают механизм дисменореи, диспареунии, и тазовых болей. Эндометриоидные гетеротопии могут продуцировать большее количество простагландинов, нежели эутопический эндометрий. Продукция простагландинов при эндометриозе зависит не только от экспрессии и продукции TNF-, но и от экспрессии и продукции Cox-2. Matsuzaki et al. в 2004 году выявили повышенный уровень Cox-2 в эпителии и строме в эндометриоидных гетеротопиях, по сравнению с нормальным эндометрием [88].
Liu Y et al. в 2011 году опубликовали похожие результаты, подтверждающие высокий уровень Cox-2 при эндометриозе, в отличие от контрольной группы. Эти данные подтверждают, что воспалительные изменения при эндометриозе опосредуются рядом факторов, одним из которых является Cox-2 [82].
Перечисленные механизмы определяют иммунопатогенез наружного генитального эндометриоза [83].
IFN- – провоспалительный цитокин, который может регулировать действия лейкоцитов в перитонеальной жидкости и воздействовать непосредственно на эктопический эндометрий. При изучении макрофагов в перитонеальной жидкости морской свинки было показано, что количество и активация макрофагов увеличивается при экспериментальном эндометриозе, в присутствии повышенного уровня фактора роста эндотелия сосудов [45]. Другая группа авторов показала, что повышение уровня ангиогенных факторов и факторов роста в перитонеальной жидкости, способствует развитию сосудистой сети и последующему поддержанию эндометриоидных эксплантов [101].
Bulun S. в своем исследовании обращает внимание на участие простагландинов в патогенезе эндометриоза [38]. Им было показано показано, что наибольшее количество простагландинов продуцируется в эндометрии. Простагландин F2- повышает тонус и амплитуду цервикальной и маточной мускулатуры и сужает шейку матки. Эти действия увеличивает венозную констрикцию шейки матки и интенсивность сокращений матки, что увеличивает степень дисменореи.
Другая группа исследователей показала, что уровень двух простагландин-эндопероксидаз (тромбоксан В2 и 6-кето-простагландин F1-) в перитонеальной жидкости достоверно выше при эндометриозе, чем у женщин без данного заболевания. Авторы также отметили увеличение уровня тромбоксана А2 и простациклина в перитонеальной жидкости, которые воздействуя на гладкие мышцы маточных труб, нарушали их функцию. Эти нарушения, про представлению авторов, являются механизмом эндометриоз-индуцированного бесплодия [53].
Кроме этого в перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом выявляется повышенный уровень MCP-1 (моноцитарный белок хемотаксиса), который продуцируется перитонеальными мезотелиальными и эндометриоидными клетками. Повышение MCP-1 доказывает воспалительное действия перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом [106].
Клиническая характеристика обследованных пациенток с эндометриозом
1) Всем обследуемым пациенткам проводили стандартное клинико-лабораторное обследование, включавшее гематологические исследования с использованием автоматического анализатора XT-2000i (Hoffmann La Roche, France) и биохимические с использованием анализатора Синхрон-СХ9 PRO (Beckman Coulter, USA). Определение СА-125 в сыворотке крови больных эндометриозом, метод основан на принципе «сэндвича». Принцип метода: Набор HUMAN CA-125 Ag основан на прямом определении антигена классическим ИФА. Гистологическое исследования эндометрия выполненное до оперативного лечения и исследование операционного материала проводилось в отделе патоморфологии ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова (руководитель отдела – к.м.н. В. Н. Эллиниди). Гистологическое исследование фрагментов удаленных препаратов, в том числе капсулы цистаденом яичников с содержимым, эндометриоидных гетеротопий с брюшины, и фрагменты эндометрия пациенток, выполнялось по стандартной методике с окраской препаратов гематоксилином и эозином. Патоморфологическое исследование тканей выполняли с использованием комплекта оборудования компании Leica (ТР1020, SM2000R, EG1150, EG 1120, Autostainer XL, DM 1000).
2) Для оценки продукции про- и провоспалительных цитокинов, а также фактора ангиогенеза в ходе оперативного вмешательства проводился забор перитонеальной жидкости с помощью одноразовой трубки ПХВ. Перитонеальная жидкость центрифугировалась при 1800 об/мин, надосадок оликовотировался в оппендорфу с помощью пипетки. Пробы замораживались и хранились при температуре –20 С. Пробы по мере использования размораживались и использовались по мере определения каждого из цитокинов.
3) Определение уровня провоспалительного цитокина IL-6. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к IL-6, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител к IL-6 c биотином и калибровочные образцы, содержащие IL-6. На первой стадии анализа исследуемые и котрольные образцы инкубируют в лунках с иммуобилизированными антителами. Имеющийся в образцах IL-6 связывается с иммобилизированными антителами. Связавшийся IL-6 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к IL-6 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяется цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце IL-6. Уровень продукции IL-6 клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 2 пг/мл, в диапазоне от 0-10 пг/мл.
4) Определение уровня провоспалительного цитокина IL-1. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» варианте иммуноферментного анализа c применением моно- и поликлональных антител к IL-1. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизированными антителами. Имеющийся в образцах IL-1 связывается с иммобилизированными антителами. Связавшийся Il-1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к IL-1 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце IL-1. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация IL-1 в анализируемых образцах. Уровень продукции IL-1 клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 1,6 пг/мл, в диапазоне от 0-11 пг/мл. 5) Определение уровня провоспалительного цитокина IL-8. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» - варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к IL-8, сорбированные на поверхности лунок разборного полистерольного планшета, конъюгат поликлональных антител к IL-8 с биотином и калибровочные образцы, содержащие IL-8. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировались в лунках с иммобилизиованными антителами. Имеющийся в образцах IL-8 связывается с иммобилизованными антителами. Связавшийся IL-8 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к IL-8 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксизадозой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце IL-8. Уровень продукции IL-8 клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 2 пг/мл, в диапазоне от 0-10 пг/мл.
6) Определение уровня IFN-. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» - варианте иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к IFN-. В лунках планшета при добавленииисследуемого образца во время первой инкубации происходит связывание IFN- с моноклональными антителами, иммобилизированными на внутренней поверхности лунок. Связавшийся IFN- взаимодействует во время второй инкубации с биотинилированными поликлональными антителами к IFN- (конъюгат №1). На третьей стадии биотин в составе конъюгата №1 взаимодействует со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (конъюгат №2). Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации IFN- в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация IFN- в анализируемых образцах. Уровень продукции IFN- клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 2 пг/мл, в диапазоне от 0-10 пг/мл.
7) Определение уровня противовоспалительного цитокина IL-10. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» - варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к IL-10, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат поликлональных антител к IL-10 с биотином и калибровочные образцы, содержащие IL-10. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют с иммобилизированными антителами. Связавшийся IL-10 взаимодействует при инкубации с конъюгатом (антитела к IL-10 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода с хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце IL-10. Уровень продукции IL-10 клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 5 пг/мл, в диапазоне от 0-31 пг/мл. 8) Определение уровня TNF-. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» - варианте иммуноферментного анализа с применением моно- и поликлональных антител к TNF. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизированными антителами. Имеющийся в образцах TNF связывается с иммобилизированными антителами. Связавшийся TNF взаимодействует при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к TNF человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействует при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце TNF. Уровень продукции TNF клетками цельной крови в сыворотке условно здоровых доноров в среднем составил 0 пг/мл, в диапазоне от 0-5 пг/мл.
9) Определение уровня фактора роста тромоцитов (PDGF). Этот анализ использует твердофазный количественный метод иммуноферментного анализа «сэндвич». Моноклональные мышиные антитела были предварительно иммобилизованы в лунках планшета. Стандарты и образцы вносились в лунки и связывались с иммобилизованными мышиными антителами. После неоднократного отмывания планшета и удаления несвязавшихся белков, вторые, связанные с ферментом моноклональные антитела к PDGF добавляли в лунки. После инкубации осуществляли промывку планшета для удаления не связавшихся ферментом-меченных антител. Далее раствор субстрата добавляли в лунки и цвет изменялся пропорционально количеству PDGF. Определяли оптическую плотность каждой лунки в течение 30 минут, с использованием планшета 450 нм.
Уровень продукция фактора роста тромбоцитов (PDGF) в перитонеальной жидкости у женщин с различными стадиями эндометриоза
Общепринятым для характеристики иммунного воспаления является определение коэффициента соотношения противо- и провоспалительных цитокинов, что крайне важно при оценке эффективности терапии и мониторинге течения иммунновоспалительных заболеваний (результаты представлены в табл. 11.) Таблица 11. Коэффициенты соотношения противо- и провоспалительных цитокинов в группе женщин с рецидивом заболевания при первой и повторной лапароскопии. Коэффициент IL-10/ILl IL-10/IFN K1 (I лапароскопия) 0,33 0,25 K2 (II лапароскопия) 0,75 0,73
Полученные результаты указывают, что даже при частичной эффективности комбинированной терапии отмечается не только снижение продукции провоспалительных цитокинов, но и имеется тенденция к нормализации соотношения противо- и провоспалительных цитокинов.
Таким образом, ретроспективная оценка содержания цитокинов в перитонеальной жидкости, при первом оперативном вмешательстве, у семи пациенток выявила значительное повышение продукции провоспалительных цитокинов при сравнении со средними показателями в группе пациентов с III-IV степенью тяжести эндометриоза. Эти изменения были выраженными при оценке содержания в перитонеальной жидкости TNF- , IFN-, IL-8, IL-1, PDGF. Полученные ретроспективно результаты позволили заключить, что повышенные показатели продукции провоспалительных цитокинов и фактора роста тромбоцитов (PDGF) требует выделения пациенток с аналогичными лабораторными показателями в отдельную группу с углубленным клиническим мониторированием в послеоперационном периоде.
Повторная лапароскопия позволила оценить эффективность первого курса лечения. Показатели продукции провоспалительных цитокинов были существенно ниже, чем при первом обследовании. Резко снижался фактор роста тромбоцитов PDGF.
Полученные результаты подтверждают, что наружный генитальный эндометриоз является иммунновоспалительным заболеванием. 3.7. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов и фактора роста тромбоцитов (PDGF) при распространенных формах эндометриоза IV стадии на примере клинических случаев
Приводим истории болезней двух пациенток, у которых был выявлен глубокий инфильтративный эндометриоз IV стадии. История болезни пациентки Д. Пациентка Д., 31 года обратилась с жалобами на болезненные менструации, боли при мочеиспускании, усиливающиеся во время менструации, единичные эпизоды гематурии. Из анамнеза: В течении 5 лет принимала комбинированные оральные контрацептивы, год назад самостоятельно отменила прием препарата. Акушерско-гинекологический анамнез: менструации с 13 лет, регулярные, по 6 дней через 28 дней, болезненные, умеренные. В анамнезе первичное бесплодие.
Из дополнительных методов обследования - выполнено МРТ органов малого таза, по результатам которой матка размерами 4,0 см х 3,5 см х 4,7 см. Полость матки не деформирована, эндометрий толщиной не более 2 мм. В пузырно-маточной клетчатке определяется узловой инфильтрат, представленный фиброзной тканью с мелкими кровоизлияниями, площадью 3,0 х 2,6 см, вертикальным размером 2,2 см. Инфильтрат распространяется на переднюю стенку матки на уровне нижнего сегмента, примерно на 1/3 толщины миометрия, а также на верхнюю стенку мочевого пузыря с буллезным отеком слизистой оболочки на уровне инвазии. Нельзя исключить наличие эндометриоидных очагов по брюшине Дугласова пространства.
В предоперационном периоде выполнена цистоскопия (рисунок 11) – по результатам которой, по задней стенке выявлен инфильтративный очаг
Очаг эндометриоза стенки мочевого пузыря стенки мочевого пузыря. 12.03.2013 года совместно с врачами–урологами, урологического отделения клиники №2 ВЦЭРМ им А.М. Никифорова, была выполнена операция – Лапароскопия. Двухстороннее стентирование мочеточников. Разъединение спаек и сращений органов малого таза. Резекция стенки мочевого пузыря. Иссечение эндометриоидных инфильтратов брюшины малого таза. На рисунках 12, 13 представлена картина основных этапов операции (время операции 165 минут). Рисунок 13. Лапароскопическая картина после иссечения эндометриоидного инфильтрата и ушивания стенки мочевого пузыря
Пациентке интраоперационно выполнялся забор перитонеальной жидкости с целью исследования в ней про- и противовоспалительных цитокинов, а также PDGF, по результатам которой уровень IL-1 = 110,9 пг/мл, IL-8 = 89,7 пг/мл, IFN- = 125,1 пг/мл, TNF- = 89,7 пг/мл, IL-6 = 51,6 пг/мл, IL-10 = 37,6 пг/мл, PDGF = 36,7 пг/мл.
Как видно из представленных данных у этой пациентки, как и у всех других пациенток с III-IV ст. НГЭ высокий уровень продукции провоспалительных цитокинов, и крайне низкая продукция противовоспалительного цитокина IL-10
По результатам гистологического исследования (В 13-1504) 1 – эндометриоз мочевого пузыря с поражением стенки по всей толщине, 2 очага эндометриоза брюшины малого таза. Пациентка была выписана на седьмые сутки послеоперационного периода. В послеоперационном периоде пациентка получала терапию аГнРГ в течении 6 месяцев. В течении годового наблюдения жалоб пациентка не предъявляла, при контрольном УЗИ органов малого таза и мочевого пузыря – патологии не выявлено. История болезни пациентки Я. Пациентка Я., 25 лет, обратилась с жалобами на болезненные менструации, боли при дефекации в течении последних 6 месяцев, отсутствие беременности при регулярной половой жизни в браке. Акушерско-гинекологический статус: менструации с 14 лет, регулярные, болезненные, по 5 дней через 26 дней. В анамнезе беременностей нет. Рисунок 14. МРТ-картина инфильтрата ректо-маточного пространства По результатам дополнительных методов исследования, по данным МРТ органов малого таза - киста правого яичника, наличие инфильтрата 3,0 х 4,2 см в ректо-маточном пространстве (рисунок 14), далее выполнена колоноскопия – по результатам которой на участке прямой кишки визуализируются эндометриоидные разрастания, около 2 мм в диаметре. (рисунок 15)
Сравнительное содержание PDGF в перитонеальной жидкости у пациенток при повторной лапароскопии
Следует отметить, что у всех пациенток, при гистологическом исследовании операционного материала, были выявлены изменения, характерные для эндометриоза: типичная строма и железы эндометрия, в строме нередко обнаруживались макрофаги с большим количеством гемосидерина. Для пациенток с инфильтративным эндометриозом было характерно врастание желез в подлежащую гладкомышечную или соединительную ткань. В очагах эндометриоза отмечалась секреция желез и пролиферация их клеток.
В ходе оперативного вмешательства с целью уточнения характера иммунного воспаления в местах гетеротопий выполнялся забор перитонеальной жидкости. При помощи иммуноферментного анализа в перитонеальной жидкости определялось содержание провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, IFN-, TNF-, противовоспалительного цитокина IL-10, а также тромбоцитарного фактора роста PDGF.
Было выявлено высокое содержание в образцах перитонеальной жидкости провоспалительного цитокина IL-8, причем отмечалось достоверное прогрессивное повышение продукции этого провоспалительного медиатора при сравнении пациенток I-II и III-IV стадиями заболевания. IL-8, который является хемокином, привлекающим нейтрофилы и макрофаги в очаги эктопического эндометрия, способствует поддержанию локального воспаления. Его высокая продукция обусловлена в том числе продукцией эстрогенов в эндометриоидных очагах
В связи с тем, что хемокин IL-8 выступает одним из факторов пролиферации для эндометриоидных клеток его повышенная продукция способствует увеличению размеров эктопических очагов [68]. Второй, изученный в ходе диссертационного исследования, цитокин IL-6, как известно, также относится к провоспалительным цитокинам [73]. Одновременно он является фактором, способствующим переходу В-лимфоцитов в следующую стадию развития - плазматические клетки. При исследовании перитонеальной жидкости пациенток с НГЭ установлено высокое содержание IL-6, причем максимальные значения - 52,2 пг/мл данного цитокина отмечены при III-IV стадиях заболевания.
Продукция IL-1 – провоспалительного цитокина, индуктора запуска каскада провоспалительных цитокинов, также прогрессивно повышалась с возрастанием стадии эндометриоза. Так у пациенток с I-II стадией заболевания, уровень данного цитокина составил 70,2 пг/мл, у пациенток с III-IV стадией он был равен 95,6 пг/мл, что достоверно выше, чем в группе сравнения (14,3 пг/мл).
TNF- является мощным воспалительным медиатором, который в том числе участвует в локальном воспалении, и способствует формированию спаек. У пациенток с эндометриозом I-II стадии, уровень данного цитокина составил 32,2 пг/мл, а с III-IV стадией составил 69,9 пг/мл. Уровень TNF- в группе сравнения он был равен 7,8 пг/мл, что еще раз подтверждает участие этого цитокина в прогрессировании эндометриоза.
Полученные нами данные совпадают с результатами исследований Iwabe T., с соавторами, которые в 2000 году показали, что IL-8 и TNF- «сотрудничают» в пролиферации стромальных клеток из эктопических эндометриоидных очагов и эндометриом, что подтверждает, по мнению авторов, участие этих цитокинов в патогенезе эндометриоза [64].
Содержание IFN- при I-II стадиях заболевания составило 98,7 пг/мл, тогда как у пациенток с III-IV стадией эндометриоза 119,2 пг/мл, (в группе сравнения 22,1 пг/мл). Высокая продукция IFN- определяет девиацию иммунного ответа в сторону Тх1 при эндометриозе, что характерно для большинства аутоиммунных заболеваний [45]. Представлялось важным исследование продукции
противовоспалительного цитокина IL-10, так как соотношение про- и противовоспалительных цитокинов играет важную роль в ограничении чрезмерного иммунного воспаления в норме и при любой патологии (в том числе при НГЭ). Уровень IL-10 в образцах перитонеальной жидкости пациенток с I-II стадией эндометриоза составил 19,4 пг/мл, тогда как у пациенток с III-IV стадией эндометриоза 38,6 пг/мл. При этом в группе сравнения он был равен 14,5 пг/мл. Повышение уровня IL-10 было неадекватным, и неэффективным в отношении провоспалительного ответа при эндометриозе. Полученные результаты совпадают с данными Funamizu A. et. al., которые в 2014 году также исследовали локальную продукцию IL-10 [58].
Ретроспективная оценка содержания цитокинов в перитонеальной жидкости у пациенток с последующим рецидивом заболевания выявила достоверное повышение продукции провоспалительных цитокинов по сравнению со средними показателями пациенток с аналогичной стадией эндометриоза (табл. 12).
Сравнительная оценка провоспалительных цитокинов в группе пациенток с рецидивом заболевания, по сравнению с группой пациенток III-IV ст. НГЭ позволили заключить, что чрезмерно повышенные показатели продукции провоспалительных цитокинов требует выделения пациенток с аналогичными лабораторными показателями в отдельную группу для углубленного клинического мониторинга в послеоперационном периоде.
Учитывая, что развитию эндометриоидных гетеротопий способствуют ангиогенные факторы роста, синтезированные макрофагами перитонеальной жидкости, клетками эндотелия и ретроградно поступившими клетками эндометрия, нами определялось содержание в перитонеальной жидкости тромбоцитарного фактора роста PDGF. Фактор роста тромбоцитов (PDGF), секретируемый активированными клетками способствует развитию эндометриоза. Концентрация фактора роста тромбоцитов в перитонеальной жидкости у обследованных больных была выше (36,2 пг/мл), чем у пациенток контрольной группы (27,1 пг/мл). Следует отметить, что в группе повторно оперированных женщин уровень PDGF был выше, чем средний показатель по группе, и при повторном заборе перитонеальной жидкости, после проведенной комплексного лечения достоверно снизился. Полученные результаты подтверждают участие PDGF в развитии и инвазивном росте эндометриоидных очагов.
Для оценки эффективности комплексной терапии в группе женщин, у которых перитонеальная жидкость забиралась дважды (пациентки с рецидивом заболевания) были подсчитаны коэффициенты отражающие соотношения противо- и провоспалительных цитокинов. В биологических пробах, полученных при первом заборе перитонеальной жидкости коэффициенты соотношения IL-10/IL1 и IL-10/IFN- были равны 0,33 и 0,25 соответственно. После проведенного комплексного лечения, которое оказалось частично удачным, эти коэффициенты тем не менее выросли до 0,75 и 0,73 соответственно, что указывает на уменьшение иммунного воспаления в ходе первого этапа проведенной терапии. Проведенные исследование про- и противовоспалительных цитокинов а также тромбоцитарного фактора роста в перитонеальной жидкости, полученной во время оперативного вмешательства у обследованных женщин позволило оценить активность местного иммунного воспаления.
Полученные в ходе диссертационного исследования результаты показали, что изменение в соотношении про- и противовоспалительных цитокинов в перитонеальной полости создает благоприятные условия для имплантации и последующего развития эндометриоидных гетеротопий, что согласуется с данными других исследователей [7, 48].
В ходе исследования было доказано, что увеличение продукции провоспалительных цитокинов в перитонеальной жидкости при наружном генитальном эндометриозе пропорционально изменению размеров и количества эндометриоидных гетеротопий, выраженности клинической картины и стадии эндометриоза.
Изучение особенностей локальной продукции цитокинов при НГЭ позволило расширить представления о патогенетических механизмах развития заболевания и определило возможности коррекции проводимой терапии в послеоперационном периоде.