Диагностическая значимость и интерпретация неоднозначных результатов исследования серологических маркеров вирусного гепатита С Потапова Алесандра Анатольевна

Введение к работе

Актуальность темы

Инфекция, вызываемая вирусом гепатита С (ВГС), в конце 20 века стремительно превратилась в одну из наиболее острых проблем в мировом здравоохранении. По данным ВОЗ, в мире более 170 миллионов человек (примерно 3%) больны хроническим гепатитом С (ГС), 3-4 миллиона человек заражаются ежегодно [Chen S.L. et al., 2006]. Между тем многие особенности развития заболевания препятствуют его своевременной диагностике. К ним, в первую очередь, относится бессимптомное течение острого гепатита С (ОГС), наблюдающееся у 70-80% заболевших [McCaughan G.W. et al., 1992]. Высокую распространенность вирусного гепатита С (ГС) регистрируют практически во всех регионах Российской Федерации, при этом в 2009 г. регистрация клинически скрытых бессимптомных форм ГС составила 87,5%ооо. [Онищенко Г.Г., Жебрун А.Б., 2010]. У 75-85% лиц, заразившихся ВГС, наблюдается переход заболевания в хроническую форму, а через 20 лет после инфицирования 10-15% мужчин и 1-5% женщин заболевают циррозом печени [Chen S.L. et al., 2006]. Прогрессирование цирроза печени часто не имеет клинических признаков, и заболевание может диагностироваться уже на стадии тяжелых осложнений в виде заболеваний печени терминальной стадии или гепатоцеллюлярной карциномы [Fattovich G. et al., 1997; Serfaty L. et al., 1998; Hu K.Q. et al. 1999]. Ежегодно приблизительно 280000 смертельных случаев связаны с ВГС-инфекцией [Yu M.L. et al., 2009]. Учитывая длительное развитие ГС без клинических проявлений, в Москве признана целесообразной проверка на наличие маркеров ГС сыворотки крови большинства лиц, обращающихся за медицинской помощью. В настоящее время выявление лиц, инфицированных ВГС, обеспечивается главным образом проведением скрининга сыворотки крови на наличие антител к вирусу (анти-ВГС) в тест-системах на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является высокочувствительным и специфичным, но проблема ложных результатов анализа стоит и в настоящее время очень остро. Уровень противоречивых и ложноположительных реакций при выявлении анти-ВГС с различными диагностическими препаратами может достигать 10-20% [Shroter M. et al., 1999; Маянский А.Н. и др., 2003; Кузина Л.Е. и др., 2004]. Для повышения достоверности исследований российскими и зарубежными исследователями разработаны критерии отбора проб, в которых с низкой позитивной оптической плотностью (ОП) определены суммарные анти-ВГС, в верифицирующие исследования в иммуноблотах (ИБ), которые содержат критерии не только позитивного и негативного, но и неопределенного

результата [Suslov A.P. et al., 2002; Alter M.J. et al., 2003]. В многочисленных
исследованиях отмечена более низкая чувствительность ИБ по сравнению с
твердофазным ИФА планшетного формата [Zer Y. et al., 2009], что
обуславливает необходимость поиска иных способов верификации. В России
разработаны и внедрены в качестве подтверждающих тестов

диагностические системы для ИФА планшетного формата с раздельным

определением структурного (Core) антигена и комплекса неструктурных (NS) антигенов ВГС. По приказу МЗ РФ в данных тест-системах должны быть исследованы все пробы, позитивные в первичном скрининге, однако результаты тестирования низкопозитивных проб в подобных диагностикумах разных производителей также могут быть противоречивыми [Кузина Л.Е. и др., 2004]. Характеристики биопроб, которые могут быть связаны с ложной позитивностью в ИФА, до настоящего времени не определены.

Причины неопределенного результата исследования наиболее
активно и сравнительно успешно изучаются в гемотрансфузиологии, чему
способствует подробное и длительное обследование состояния здоровья
доноров [Piro L. et al., 2008]. В отличие от донорства, на этапе первичного
скрининга анти-ВГС в группах населения с различным риском

инфицирования необходимость правильной интерпретации результатов
исследования осложняется практически полным отсутствием знаний о
пациентах. Определенную помощь в решении проблемы диагностической
значимости неопределенного результата тестирования анти-ВГС может
оказать исследование специфических (РНК ВГС) и неспецифических
биохимических (ферментов и проч.) маркеров инфицированности. По
данным J.M. Pawlotsky с соавт., полученных в первое десятилетие
исследования вирусного гепатита С, в половине случаев "неопределенных"
результатов исследования анти-ВГС удавалось обнаружить РНК ВГС
[Pawlotsky J.M. et al., 1994]. По-видимому, на современном этапе развития
лабораторных технологий изучение значимости отдельных серологических
маркеров как возможных показателей репликации вируса также является
актуальной задачей. Вышеизложенное подтверждает необходимость

дальнейшего совершенствования лабораторной диагностики гепатита С на этапе первичного скрининга с разработкой новых методов и алгоритмов исследования.

Цель исследования

Установление диагностической значимости неопределенных

результатов исследования маркеров вирусного гепатита С для повышения качества клинико-лабораторной диагностики инфекции на этапе первичного скрининга антител к вирусу гепатита С.

Задачи исследования

1. Определить частоту и динамику распространения антител к вирусу гепатита С (2000-2011 годы) среди пациентов лечебно-профилактических учреждений г.Москвы с разным риском гемоконтактного инфицирования.

2. Оптимизировать внутрилабораторный контроль качества исследований на наличие анти-ВГС, для чего провести сравнительный анализ показателей воспроизводимости и сходимости результатов при использовании контрольных материалов промышленного производства и материалов, изготовленных в лаборатории, при выполнении ИФА-исследований в ручном, полуавтоматическом и автоматическом режимах.

3. Установить критерии отбора проб сыворотки крови c разноречивыми и низкими положительными результатами при скрининге анти-ВГС для проведения дополнительного верифицирующего исследования.

4. Разработать алгоритм исследования анти-ВГС, который обеспечит достижение максимально достоверного результата и исключит получение ложных результатов.

5. Установить группы пациентов с высокой частотой неспецифических ложноположительных результатов при тестировании антител к ВГС в ИФА.

6. Определить значимость сывороточных компонентов: ревматоидного фактора (РФ), циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), фракций белков крови, иммуноглобулинов классов A, M, G, парапротеинов, С-реактивного белка (СРБ), - для проявления неспецифических реакций при тестировании антител к ВГС в ИФА.

7. Изучить взаимосвязь между уровнем продукции антител к ВГС и концентрацией -фетопротеина как биохимического маркера, ассоциированного с поражением печени.

8. Определить диагностическую значимость ПЦР для подтверждения инфицированности ВГС лиц с неопределенными результатами исследования анти-ВГС.

9. Выяснить референсные возможности иммуночипов при исследовании проб с противоречивыми и неопределенными результатами определения анти-ВГС в ИФА планшетного формата и иммуноблотах.

Научная новизна

Впервые разработан экономически доступный алгоритм

исследования антител к ВГС, эффективный при массовых объемах исследований, с хорошо воспроизводимыми и информативными для врачей и пациентов результатами, основанный на использовании тест-систем российского производства.

Показано, что пробы с разноречивыми результатами тестирования анти-ВГС, не подтвердившимися как позитивные в расширенных исследованиях, принадлежат лицам с возрастной физиологической и транзиторной иммунной недостаточностью (соответственно пожилым людям и детям первого года жизни).

Впервые установлено, что РНК ВГС выявляется в пробах с неопределенными результатами исследования, обусловленными наличием только анти-NS3, что сочетается с позитивностью по анти-ВГС в хемилюминесцентном иммунном анализе на микрочастицах (ХИАМ). При неопределенном результате исследования вследствие обнаружения в ИФА только анти-NS4 РНК ВГС не обнаруживается.

Впервые показано, что пробы сыворотки крови пожилых лиц с отрицательными и ложнопозитивными результатами тестирования анти-ВГС не отличаются по количеству Ig-содержащих патологических белков (по ревматоидному фактору - РФ и циркулирующим иммунным комплексам - ЦИК), а также по частоте выявления повышенного уровня С-реактивного белка (СРБ). В сыворотке крови пожилых людей с анти-ВГС повышено содержание ЦИК по сравнению с пробами с ложнопозитивными результатами тестирования и с пробами без анти-ВГС. Образцы сыворотки крови пожилых лиц с ложнопозитивными результатами исследования отличаются от проб, содержащих анти-ВГС, повышенным уровнем 1-глобулинов. Высокая концентрация РФ, ЦИК, -глобулинов, наличие парапротеинов не влияет на качество тестирования анти-ВГС в современных диагностических системах на основе твердофазного ИФА.

Установлено, что диагностическая значимость определения
сывороточного -фетопротеина (АФП) при неопределенном результате
тестирования анти-ВГС зависит от возрастной категории пациентов. В
группах молодых мужчин и женщин в первом триместре беременности с
неопределенными результатами исследования анти-ВГС сывороточная
концентрация АФП повышена в 2 раза по сравнению с пациентами, в крови
которых не обнаруживались анти-ВГС. Повышение концентрации АФП
было статистически значимым в пробах с антителами, направленными к
Core- либо к NS3-, но не к NS4-антигену. У пожилых лиц с

отрицательными результатами тестирования анти-ВГС установлен

широкий диапазон сывороточной концентрации АФП, при этом не выявлено отличий этой группы по содержанию АФП от групп с положительными и неопределенными результатами определения анти-ВГС. Впервые доказано, что метод иммуночипов позволяет верифицировать наличие антител - маркеров ВГС-инфекции (в том числе характерных для активной стадии патологического процесса) более чем в 80% проб с неопределенными результатами исследования в ИФА планшетного формата, поскольку в них выявляются антитела не к одному, а к нескольким белкам ВГС.

Практическая значимость работы

Разработанный алгоритм повышает диагностическую ценность результатов массового скрининга населения на наличие антител к вирусу гепатита С. В предложенном алгоритме разработаны критерии отбора проб, ограничивающие количество дополнительных исследований.

Включение иммуноферментных тест-систем с расширенным спектром определения антител к вирусу гепатита С российского производства в дополнительные исследования способствует повышению точности результата, что особенно важно при исследовании так называемых проблемных проб. Результаты, полученные при использовании разработанного алгоритма, соответствуют значениям: позитивным, негативным и неопределенным.

Созданный алгоритм обеспечивает оптимальные точность и объем информации для пациентов и лечащих врачей, поскольку содержит информацию о направленности обнаруженных антител к определенному антигену и величине коэффициента позитивности, что позволит оценить динамику изменения этих показателей.

Использование для дополнительных исследований при массовом скрининге иммуноферментных тест-систем планшетного формата с расширенным спектром определения антител российского производства значительно удешевляет верифицирующее тестирование по сравнению с иммуноблотом.

Выделение групп с противоречивыми результатами в ИФА: лиц с возрастным иммунным дисбалансом (пожилых людей и новорожденных) и беременных женщин, - способствует дополнительному проведению верифицирующих исследований в этих группах для предотвращения сообщения ложноположительного результата.

Показана эффективность использования ПЦР (с чувствительностью 50 МЕ/мл) для выявления РНК ВГС при обнаружении в ИФА только анти-NS3, но не анти-NS4.

Отсутствие неспецифических реакций в тест-системах для ИФА планшетного формата у больных моноклональными гамма-глобулинопатиями, пациентов с высокими концентрациями ревматоидного фактора, циркулирующих иммунных комплексов, С-реактивного белка свидетельствует о специфичности реакции в ИФА и подтверждает необходимость расширенного обследования на наличие инфекции данных пациентов с неопределенными результатами исследования анти-ВГС.

Определение сывороточной концентрации АФП может быть дополнительным биохимическим верифицирующим маркером повреждения/репарации печени при неопределенном результате исследования анти-ВГС у лиц моложе 60 лет.

Применение иммуночипов способно существенно улучшить лабораторную диагностику гепатита С. Высокая эффективность иммуночипов для верификации наличия антител к ВГС в образцах с неопределенным результатом исследования обусловлена высокой чувствительностью иммуночипов; расширением спектра выявляемых антител к ВГС по сравнению с иммуноблотом и ИФА; возможностью раздельного выявления в одной постановке IgG и IgM (показателей активности инфекционного процесса). Для полного комплексного обследования требуется небольшое количество материала (не более 30 мкл на весь анализ).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования используются в практике работы клинико-
иммунологической лаборатории по диагностике ВИЧ-инфекции МНПЦДК
ДЗ г.Москвы, лаборатории вирусных гепатитов ФГБУ «Институт
полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» и лаборатории
инфекционной иммунологии лабораторного отделения ФКУ
«Медицинского учебно-научного клинического центра имени П.В.
Мандрыка» МО РФ для повышения качества лабораторной диагностики
вирусного гепатита С. Полученные новые сведения используются в
процессе обучения на кафедре клинической лабораторной диагностики
Факультета дополнительного профессионального образования

Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан алгоритм расширенного исследования проб
сыворотки крови с противоречивыми результатами исследований на
наличие антител к ВГС. Алгоритм основан на использовании
диагностикумов российского производства и обеспечивает необходимую
достоверность и информативность результатов.

2. Алгоритм исследования анти-ВГС содержит критерии отбора проб для дополнительного исследования с целью подтверждения наличия маркеров гепатита С, что ограничивает количество необходимых тестов и позволяет исключить ложнопозитивные результаты.

3. При массовом скрининге на антитела к ВГС сомнительные результаты исследования в ИФА часто регистрируются у пациентов с физиологическим иммунным дисбалансом: пожилых пациентов и детей первого года жизни.

4. Повышенное содержание фракции белков крови - 1- глобулинов
– ассоциировано с ложнопозитивными реакциями у пожилых пациентов.
Ревматоидный фактор, высокие концентрации -глобулинов у больных
моноклональными -глобулинопатиями, циркулирующие иммунные
комплексы, С-реактивный белок не влияют на результаты исследования
анти-ВГС в современных диагностических наборах для твердофазного ИФА
в планшетном формате.

5. В группе пациентов моложе 60 лет с неопределенными
результатами исследования антител к ВГС биохимическим маркером
заболевания печени является повышенная по сравнению с нормой
сывороточная концентрация альфа-фетопротеина. У пожилых пациентов без
анти-ВГС наблюдаются значительные отклонения концентрации АФП от
нормы, что не позволяет использовать данный маркер в комплексной
диагностике гепатита С в этой возрастной группе.

6. Использование ПЦР в качестве метода подтверждения наличия ВГС-инфекции путем выявления РНК ВГС у лиц с неопределенными результатами исследования антител к ВГС эффективно при обнаружении в ИФА только анти-NS3; при обнаружении только анти-NS4 использование ПЦР при чувствительности метода 50 МЕ\мл нецелесообразно.

7. Эффективным способом проведения референсного исследования при разноречивых и неопределенных результатах тестирования антител к ВГС в ИФА и иммуноблотах являются иммуночипы.

Апробация работы

Апробация работы состоялась на научно-практической

конференции ГБУЗ г.Москвы МНПЦДК ДЗ г.Москвы 10. 02. 2015.

Материалы диссертации доложены на заседании Ученого совета
ГБУЗ г.Москвы МНПЦДК ДЗ г.Москвы, на научных конференциях и

съездах в России и за рубежом, в числе которых: 5^th Annual Meeting FOCIS
(Federation of clinical immunology societies), май 2005, Бостон, США; 1^st Joint
Meeting of European National Societies of Immunology and 16^th European
Congress of Immunology, сентябрь 2006, Париж, Франция; VIII Конгресс
«Современные проблемы аллергологии, иммунологии и

иммунофармакологии», июнь 2007, Москва, Россия; Международная
научная конференция Российской академии естествознания "Наука и
образование в современной России" в разделе "Инновационные

медицинские технологии", ноябрь 2010, Москва, Россия; IV

междисциплинарная научно-практическая конференция «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия», март 2011 г., Москва, Россия; Национальные дни лабораторной медицины России-2011, октябрь 2011, Москва, Россия; II Московский Форум «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». 17-19 октября 2012, Москва, Россия.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно осуществил выбор направления

исследования, определил цели и задачи, выбор необходимых методов
исследования. Автор непосредственно участвовал как в проведении

рутинных скрининговых и конфирматорных исследований на наличие
антител к ВГС, так и самостоятельно проводил отбор проб для

дополнительной специфической иммунодиагностики и исследования
факторов, влияющих на результаты иммуноферментного анализа и
ассоциированных с заболеваниями печени. В совместных исследованиях
(описанных в разделе «Материалы и методы») вклад автора также являлся
определяющим и заключался в непосредственном участии на всех этапах, от
пробоподготовки до получения и анализа результатов. Автор играл

ведущую роль на всех этапах исследования, от постановки задач и проведения исследований до обсуждения и обобщения результатов и формулировки выводов, а также в подготовке научных публикаций и докладов.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работы в российских и зарубежных журналах, из них 13 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и выпущено руководство для практических врачей.

Объем и структура диссертации