Введение к работе
Актуальность исследования
Хроническая крапивница (ХК) в настоящее время занимает одну из лидирующих позиций в структуре аллергических заболеваний. Среди всех форм заболевания наиболее сложными для диагностики и лечения остаются хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК), распространенность которой составляет от 30 до 50% [Синельникова Н.А. и соавт., 2013] и хроническая идиопатическая крапивница (ХИК), выявляемая у 50% больных крапивницей [Kaplan A.P., 2009]. Лечение обеих форм ХК до настоящего времени остается важной медицинской, социальной и экономической проблемой [Некрасова Е.Е. и соавт., 2013]. В последние годы получены новые данные в изучении патогенетических механизмов хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницы [Ащина Л.А. и соавт., 2015]. Однако вопрос участия цитокинов регуляторных Т-клеток при каждой из этих форм крапивницы не изучен, что создает трудности для дифференциальной диагностики и патогенетически направленного лечения данной патологии.
Известно, что поддержание иммунологической толерантности в организме осуществляет популяция регуляторных Т-клеток (Treg). Популяция Тreg неоднородна. Выделяют естественные, формирующиеся в процессе развития в тимусе Тreg с фенотипом (CD4+CD25+) с уникальным молекулярным маркером – внутриклеточным фактором транскрипции – FOXP3, который признан ключевой молекулой, контролирующей развитие и функционирование Treg [Ярилин А.А. и соавт., 2006; Yagi H. et.al., 2004], и адаптивные, индуцируемые антигеном на периферии, к которым относятся Tr1, Th3 и Th17 популяции Т-клеток [Ярилин А.А., 2010]. Считается, что все Treg клетки обладают супрессорной активностью и ингибируют функцию клеток-эффекторов. Недостаточность или дисфункция Treg могут привести к развитию аутоиммунных заболеваний [Фрейдлин И.С., 2005, Донецкова А.Д. и соавт.,
2010]. Нарушение функциональной активности Treg может быть ассоциировано
с дефектом генов IL-4, IL-10, IL-17 [Донецкова А.Д., 2007]. В литературе имеются противоречивые данные о роли популяций регуляторных Т-клеток у больных с аллергическими и аутоиммунными заболеваниями [Wu Bin et al., 2009; Sun R.S. et al., 2011]. Маркером Tr1 является IL-10, Th3 – TGF-, Th17- IL-17А [Олейник Е.К., 2009; Хайдуков С.В. и соавт., 2011; Atwa M.A. et al., 2014].
Таким образом, вопросы участия Treg в патогенезе хронической крапивницы и выявление их связи с распространенностью полиморфизма генов ключевых цитокинов изучены недостаточно, что создает трудности для внедрения более эффективных методов диагностики данной патологии.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время наибольший интерес вызывает популяция
естественных регуляторных клеток, формирующихся в тимусе. Впервые эта
субпопуляция была открыта и описана в середине 90-х годов прошлого века
Sakaguchi S. с соавторами [Sakaguchi S. et al., 1995]. Было установлено, что
субпопуляция CD4+CD25+ Т-лимфоцитов предотвращает развитие
аутоиммунных заболеваний у мышей. Позже появились работы других исследователей [Suri-Payer E. et al., 1998; Wu-Chamg Chen et al., 2008; Wei W., 2010; Sun R.S. et al., 2011], которые подтвердили, что CD4+CD25+ Т-клетки могут играть роль в развитии хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницы. Огромный вклад в изучение популяции регуляторных клеток в нашей стране внес А.А. Ярилин [Ярилин А.А. и соавт. 2005; Ярилин А.А. и соавт. 2006; Ярилин А.А., 2010].
Работы отечественных авторов посвящены, в основном, проблеме исследования транскрипционного фактора FOXP3 в тимоцитах человека in vitro, изучению его изоформ, а также изучению Treg у детей с аллергопатологией (Бельтюкова А.С., и соавт., 2010; Донецкова А.Д. и соавт., 2010; Митин А.А. и соавт., 2012). В перечисленных работах по изучению регуляторных Т-клеток представлены результаты исследований, которые проводились на тимоцитах и кроветворных клетках-предшественниках у детей
до 1 года, и до сих пор не было проведено изучения данных показателей у больных хронической аутоиммунной и хронической идиопатической крапивницей. При этом неизученными остаются вопросы, связанные с анализом распространенности полиморфизма генов IL-4, IL-10, IL-17 у больных хронической крапивницей, хотя исследования в этом плане при других патологиях ведутся активно (Ризванова Ф.Ф. и соавт., 2010; Гречанина Е.Я. и соавт., 2011). До сих пор не проведена сравнительная комплексная оценка полиморфизма генов IL-4, IL-10, IL-17 и продукции цитокинов регуляторными Т-клетками у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей.
Цель исследования: исследовать содержание цитокинов регуляторных Т-клеток и распространенность полиморфизма генов IL-4, IL-10, IL-17 у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей.
Задачи исследования:
-
Изучить уровень экспрессии мРНК FOXP3 Тreg, уровни цитокинов -IL-10, TGF- и IL-17A, и оценить количество CD4+, CD8+, CD16+, CD19+-лимфоцитов у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей.
-
Исследовать полиморфизм генов IL-4(C-589T), IL-10(С-592A, G-1082A) и IL-17(G-197A) у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей.
-
Оценить распространенность полиморфизма генов IL-10(С-592A, G-1082A) и IL-17(G-197A) и их связь с показателями спонтанной и индуцированной продукции клетками крови IL-10 и IL-17A у больных хронической крапивницей.
4. Провести сравнительный анализ показателей TGF- в сыворотке крови в зависимости от полиморфизма генов IL-4, IL-10, IL-17 у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей.
5. Выявить среди цитокинов регуляторных Т-клеток и полиморфных вариантов генов цитокинов диагностические критерии для дифференциальной диагностики хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницы.
Научная новизна
Впервые изучен уровень экспрессии транскрипционного фактора FOXP3 на регуляторных Т-клетках у больных хронической аутоиммунной и идиопатической крапивницей. Не выявлено различий в показателях как в сравнении со здоровыми людьми, так и в изучаемых группах.
Показана роль цитокинов адаптивных регуляторных популяций в патогенезе двух форм крапивницы. Выявлено повышение спонтанной и индуцированной продукции IL-17А клетками крови у больных хронической аутоиммунной крапивницей. Для пациентов с хронической идиопатической крапивницей характерно повышение показателей IL-10 как в сыворотке, так и в супернатанте стимулированных клеток по сравнению с контролем и пациентами с аутоиммунной крапивницей.
Проведено исследование полиморфизма генов IL-4(C-589T), IL-10(С-
592A, G-1082A) и IL-17(G-197A) у больных хронической аутоиммунной и
идиопатической крапивницей по сравнению со здоровыми людьми. Показано
преобладание генотипа -1082A/A гена IL-10 у больных хронической
идиопатической крапивницей по сравнению с контролем. Выявлено
преобладание генотипа -197A/A у больных хронической аутоиммунной
крапивницей, а в группе больных с идиопатической крапивницей -
преобладание генотипа -197G/A гена IL-17.
Проанализирована ассоциация полиморфизма генов IL-10(С-592A, G-1082A) и IL-17(G-197A) с продукцией соответствующих интерлейкинов. Показано, что генотипы -592С/С и -592С/А гена IL-10 ассоциированы со спонтанной и индуцированной продукцией IL-10 у больных хронической идиопатической крапивницей в сравнении с больными аутоиммунной крапивницей. В тоже время генотипы -1082G/A и -1082А/A гена IL-10 у этих
больных ассоциированы только с индуцированной продукцией IL-10. У больных
хронической аутоиммунной крапивницей выявлен высокий уровень IL-17A в сравнении с группой больных идиопатической крапивницей, который не связан с полиморфизмом (G-197A) гена IL-17.
Выявлено снижение показателей TGF- у больных идиопатической крапивницей по сравнению с группой больных хронической аутоиммунной крапивницей, ассоциированное с генотипами: -589С/С и -589Т/Т гена IL-4; -592С/А и -592А/А гена IL-10; -1082G/A и -1082A/A гена IL-10 и -197G/А и -197A/А гена IL-17.
Разработаны диагностические критерии для выявления аутоиммунной формы крапивницы. Диагностическим критерием хронической аутоиммунной крапивницы среди цитокинов регуляторных Т-клеток являются показатели – IL-17А (спонтанная продукция) – выше 28,50 пг/мл.
Теоретическая и практическая значимость работы
Отсутствие различий в уровне экспрессии транскрипционного фактора FOXP3 у больных ХАК и ХИК по сравнению со здоровыми людьми может свидетельствовать об отсутствии дефекта естественных (CD4+CD25+) Тreg-клеток.
Выявленные различия в продукции цитокинов адаптивных регуляторных Т-клеток: IL-10 – у больных ХИК и IL-17A – у больных ХАК могут свидетельствовать о вовлечении синтезирующих их клеток в патогенез ХК.
Определены наиболее значимые и информативные полиморфизмы генов цитокинов (IL-4, IL-10, IL-17), ассоциированные с определенной формой хронической крапивницы. Для подтверждения диагноза ХАК необходимо определять генотип -197А/A гена IL-17, а для подтверждения ХИК - -1082А/A гена IL-10 и -197G/A гена IL- 17.
Разработанные диагностические критерии, учитывающие показатели
спонтанной продукции IL-17A клетками крови, могут быть рекомендованы для
использования в клинической практике с целью оценки разных форм
хронической крапивницы. Диагностическим критерием хронической
аутоиммунной крапивницы являются показатели спонтанной продукции IL-17А
выше 28,50 пг/мл. Показатели ниже указанных значений могут
свидетельствововать в пользу идиопатической крапивницы.
Полученные результаты внедрены и используются в цикле лекций
кафедры аллергологии и иммунологии Государственного бюджетного
образовательного учреждения дополнительного профессионального образования
«Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ).
Методология и методы исследования
Методология настоящего исследования спланирована в соответствии с
поставленной цели. В работе проведено изучение уровня экспрессии мРНК
Treg и полиморфизмов генов IL-4, IL-10, IL-17 методом ПЦР в реальном
времени, спонтанной и индуцированной продукции цитокинов адаптивных
регуляторных Т-клеток методом ex vivo c оценкой их концентрации методом
ИФА, а также исследование популяций CD4+, CD8+, CD19+, CD16+-популяции
лимфоцитов методом иммунофлюоресценции. Научная литература,
посвященная проблеме хронической крапивницы, проанализирована
формально-логическими методами исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов.
Предметом исследования служили 95 образцов венозной крови и сывороток больных хронической крапивницей в возрасте от 25 до 58 лет.
Проведено одномоментное, рандомизированное исследование.
Критериями включения пациентов в исследование явились: наличие
аутоиммунной формы хронической крапивницы, наличие идиопатической
формы хронической крапивницы, возраст пациентов 25-58 лет,
информированное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения явились: острая крапивница, психические заболевания, туберкулез любой локализации в активной фазе, онкологические заболевания, беременность и период лактации.
Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ГБОУ ДПО ПИУВ МЗ РФ, получено информированное согласие от пациентов на участие в исследовании.
В соответствии с целью исследования из 95 пациентов с ХК пациенты с ХАК составили 50 человек (9 мужчин и 41 женщина) и пациенты с ХИК – 45 человек (6 мужчин и 39 женщин). Средний возраст больных ХАК составил 37±12 лет, больных ХИК – 41±14 лет. В качестве контрольной группы было обследовано 30 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основными группами.
Диагноз ХАК и ХИК устанавливался на этапе предварительного обследования на основании клинических проявлений болезни, анамнестических данных, сопутствующих заболеваний, а также результатов постановки проб с аутосывороткой по методу М. Hide [Hide M. et al.,1993]. Пациентам с диаметром пробы 7 мм и более был поставлен диагноз ХАК. Пациентов, у которых была отрицательная проба с аутосывороткой, относили в группу с ХИК. Пробы и иммуногенетическое обследование было проведено в стадию ремиссии заболевания.
Иммунологическое обследование больных включало исследование
популяций CD4+, CD8+, CD16+, CD19+-популяций лимфоцитов методом
непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием
моноклональных антител серии ИКО производства ООО «Сорбент» (Россия). Изучение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ключевых цитокинов IL-4, IL-10, IL-17A клетками крови было проведено методом ex vivo [Исаченко Е.Г. и соавт., 2002] и оценено методом ИФА с помощью наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).
Оценку экспрессии мРНК FOXP3 проводили методом ПЦР в режиме «реального времени» [Хаитов Р.М. и соавт., 2009].
Материалом для исследования служила периферическая кровь, которую забирали в пробирки с ЭДТА в конечной концентрации 2 мг/мл. Этапы исследования включали:
-
Выделение лимфоцитов из цельной крови. Разделение клеточных элементов крови осуществляли путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл).
-
Выделение РНК.
Для выделения нуклеиновых кислот использовали комплект реагентов «РНК-Экстран» («ООО Синтол», Россия), предназначенный для выделения тотальной РНК из образцов цельной крови, тканей и культуры клеток.
-
Обратную транскрипцию проводили с помощью набора реагентов («ООО Синтол», Россия) согласно инструкции производителя.
-
Амплификация. Полученную кДНК использовали для амплификации, которую проводили на приборе «ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия) в режиме «реального времени». Количество фрагментов кДНК гена FOXP3 определяли при использовании наборов ООО «Синтол» (Россия) согласно инструкции производителя. Детекцию проводили по каналу HEX.
Уровень представленности транскрипта гена FOXP3 определяли относительно экспрессии мРНК гена «домашнего хозяйства» - В2МГ. Определение количества фрагментов кДНК гена р2-микроглобулина проводили набором реагентов ООО «Синтол» (Россия) согласно инструкции производителя по каналу FAM. Определение уровня экспрессии генов FOXP3 и 2-микроглобулина проводили параллельно в одной постановке.
Расчет уровня экспрессии гена FOXP3 проводили по формуле:
?"АС = О -(СtFOXP3-CtВ2МГ)
где OFOXP3 -пороговый цикл в образце для FOXP3, СtВ2МГ -пороговый цикл для В2МГ. 2 - эффективность амплификации, величина, характеризующая прирост матрицы на каждом цикле. Результаты выражали в условных единицах (у.е.).
Оценку полиморфизмов генов IL-4(C-589T), IL-10 (G-1082A и С-592А) и
IL-17(G-197A) проводили методом ПЦР в режиме «реального времени»
набором реагентов «SNP-экспресс» (ООО НПФ «Литех») на амплификаторе
«ДТ-Лайт» («ДНК-Технология», Россия). Анализу подвергалась геномная ДНК,
выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» (ООО НПФ «Литех») согласно инструкции производителя.
Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью
пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0», а также с применением
программы SPSS для ROC-анализа. Использовали традиционные методы
статистического анализа [Халафян А.А., 2009]. При обработке полученных
результатов иммунологических исследований использовались следующие
методы. С помощью теста Колмогорова-Смирнова проводилась проверка на
нормальность распределения по выборке. Так как большинство параметров не
имело нормального распределения, были применены методы
непараметрической статистики. Для каждого параметра определяли среднее
значение, медиану (Ме) и интерквартильный размах – 25% и 75%. Сравнение
количественных признаков в независимых группах проводили по методу
Манна-Уитни и Вальд-Вольфовица, в зависимых группах – по методу
Вилкоксона. Для наиболее значимых факторов (иммунологических
показателей, имеющих достоверную связь с критерием эффективности) проводился ROC-анализ для установления пороговых значений.
Личное участие автора в получении результатов
Автором составлен план работы, проведен аналитический анализ отечественной и зарубежной литературы. Самостоятельно выполнены все основные разделы работы: вызов пациента на проведение обследования, выполнение иммунологических исследований.
Клинический раздел работы по подбору пациентов осуществлен
совместно с сотрудниками кафедры аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО
«Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (заведующий кафедрой – д.м.н., профессор Б.А. Молотилов). Генетические исследования проводились автором совместно с к.б.н. О.А.Левашовой в центральной научно-исследовательской
лаборатории (ЦНИЛ) ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (заведующая – д.б.н., Н.И.Баранова).
Положения, выносимые на защиту
1. Уровень экспрессии мРНК FOXP3 у больных хронической
аутоиммунной и идиопатической крапивницей не отличается от показателей у
здоровых лиц. Иммунологические нарушения в изучаемых группах
сопровождаются повышением показателей CD4+ и снижением CD8+-
лимфоцитов, а также повышением выработки IL-17А в супернатанте
стимулированных клеток у больных аутоиммунной крапивницей. У больных
идиопатической крапивницей выявлено повышение показателей IL-10 в
сыворотке и в супернатанте стимулированных клеток. Установлено повышение
показателей натуральных киллеров (CD16+) и снижение CD19+ В-лимфоцитов
в обеих группах больных.
2. Вариант -1082 A/A гена IL-10 и вариант -197G/A гена IL-17 чаще
встречаются у больных хронической идиопатической крапивницей, в то время
как вариант -197А/А гена IL-17 – у больных с аутоиммунной крапивницей по
сравнению со здоровыми людьми.
3. У больных хронической идиопатической крапивницей выявлено
снижение показателей TGF-, которое ассоциировалось с генотипами: -589С/С и -
589Т/Т гена IL-4; -592С/А и -592А/А, -1082G/A и -1082A/A гена IL-10 и -197G/А и -
197A/ А гена IL-1 7 по сравнению с больными аутоиммунной крапивницей.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты настоящего исследования являются достоверными, так как проведен достаточный объем исследований с использованием адекватных и современных методологических подходов.
Диссертация обсуждена и одобрена на заседании межкафедральной комиссии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (протокол № 14 от 21 октября 2015 г.).
Материалы диссертационной работы доложены на On-line конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (2013); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2013); Первом Университетском фестивале терапевтической науки (Москва, 2014); Юбилейной научно-практической конференции «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокиновой регуляции», посвященной 40-летию ФГУП «Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России (Санкт-Петербург, 2014); XVII научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных» (Пенза, 2014); Всероссийской научно-практической конференции «Иммунопатология и иммунореабилитация: от теории к практике» (Пенза, 2015).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 8 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации