Введение к работе
Актуальность проблемы. Классическая энзимология - это энзимология водных сред. Большинство работ в этой области, касающихся структуры активных центров и выяснения физико-химических механизмов биокатализа, ;; были выполнены с высокоочищенными препаратами ферментов, выделенных из природных объектов. Однако, при использовании высокоочищенных препаратов ферментов естественно возникает вопрос: насколько свойства ферментов, наблюдаемые in vitro, адекватно коррелируют с условиями их функционирования in vivo. Сейчас стало очевидным, что местонахождение ферментов в клетке играет существенную роль в регуляции их каталитических функций и способности участвовать в клеточном метаболизме. Так, множество ферментов, если не большинство, -окализованы на поверхности биологических мембран или внутри них. Доже а-химотрипсин, считавшийся долгое время свободно-диффундируемым ферментом, функционирует (А.М.Уголев, 1972) в прочно адсорбированном состоянии на щеточной кайме энтероцитов (рис.1). Немало ферментов находятся в составе комплексов с мзкромолекулярными компонентами клеток, такими как белки и полисахариды.
Относительно недавно было установлено, что мно ие ферменты содержат в своем составе углеводы, т.е. являются гликопротеинами. Особенности поведения гликопротеинов обусловлены наличием на их поверхности углеводных фрагментов. Ус.ановпено, в частности, что именно благодаря олигосахаридным фрагментам гликолротеины проявляют способность к олигемеризации; гликозилирование необходимо белкам для взаимодействия с биомембраной и стабильности образующегося комплекса.
В то же время, определенная ограниченность в понимании роли небелковых компонентов в биокатализе в немалой степени обусловлена тем, что в процессе очистки ферменты теряют свое природное
окружение, и изучение
Ферменты
таких препаратов в
водной среде
зачастую не позволяет
выявить механизмы
регуляции
Гликокаликс
каталитической
активности и
надмолекулярной
Лнпидная мембрана
Є.-, .- . -г -.
структуры in vivo. Благодаря
использованию
Рис. 1. Схема мембранного пищеварения.
систем обращенных мицелл, моделирующих
природное биомембранное окружение ферментов in vivo, в качестве среды для ферментативных реакций стало возможным выявлять функциональные особенности надмолекулярной структуры ферментов, обнаруживать отличия в поведении мембранных и немембранных форм белка. Значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярных процессов, происходящих в обращенных мицеллах, и причин того или иного поведения белков в них, делает весьма перспективным использование этой системы для выявления и изучения различий в свойствах разных форм фермонтез.
Цяьк> работы явилось изучение влияния углеводных
фрагментов на свойства гликопротеинов. То обстоятельство, что гликопротеины представляют собой сложные биополимерные структуры, делает чрезвычайно трудоемким . и трудно интерпретируемым исследование функционирования природных гликопротеиноо с целью выяснения роли их углеводных фрагментов. В этой связи для изучения влияния углеводных фрагментов на свойства связанного с ними белка многообещающим представляется
использование предлагаемого нами подхода, суть которого состоит б получении искусственно гликозили.рованного белка, моделирующего свойства природного гликопротеина, методом химической модификации природного нсгликозилированного белка. Так, при искусственном гликозилировании мы имеем возможность не только контролировать и варьировать количество и локализацию углеводов, но и задавать их структуру на стадии синтеза. При таком подходе всегда есть контроль - исходный негликозилированный белок. Это должно позволить выяслять различия, появившиеся в поведении фермента в результате гликозилирования.
В данной работе мы использовали е качестсе модельного объекта хорошо изученный нсгликсзилированкый фермент - ос-химотрипсин. Основной задачей работы было получение путем химической модификации гликозилированного аналога а-химотрипсина и выявление различий в поведении исследуемых ферментов в системе обращенных мицелл.
Научная негмізна рпботьц В работе для изучения влияния
углеводных фрагментов на свойства гликопротеинов впервые предложен и реализован подход, суть которого заключается в получении искусственно гликозилированного фермента, исходя из природного кегликозилирозанного. В качестве модель .что объекта был выбран хорошо изученный негликозилированный фермент а-химотрипсин. Были получены препараты а-химотрипсина, модифицированного D-глюкозамином по карбоксильным группам белка и модифицированного 0(+)-целлобиозой по аминогруппам с различными степенями модификации. Показано, что гликозилирование придает а-хііілотрипсину свойства, характерные для природных гликопротеинов: способность к олигомеризации (димеризации) в системе обращенных мицелл и мембранотрошюсть (способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей).
Обнаружено, что а зависимости от степени модификации D(+}-
целлобиозой гликозилированный а-химотрипсин способен
образовывать димеры различной формы. Объяснение выявленных закономерностей дано исходя из предположения о способности а-химотрипсина находиться в виде двух различных форм (конформаций) -"открытой" и "закрытой".
В работе обнаружено и доказано существование в молекуле нативного а-химотрипсина центра связывания с углеводами, благодаря которому он способен образовывать иековалентные комплексы с искусственными (гликозилированный u-химотрипсин) и природными (на примере пероксидазы из корней хрена) гликопротеинзми.
Обнаружено, что комапексообразование нативного а-химотрипсина с гликопротеином придает u-химотрипсину (в форме комплекса) способность взаимодействовать с мицеллярной матрицей.
Методом конкурентного подавления комплексообразования а-химотрипсина с пероксидазой в системе обращенных мицелл сахарами различной природы предпринята попытка изучения специфичности углевод-связывающего центра а-химотрипсина. Показано, что из изученных Сахаров, наибольшей способностью подавлять комллексообразование обладает целлсбиоза (концевой фрагмент глюкоза, р-тип связи 1->4).
Раактучсскоя значимость работы. Обнаруженная в работе способность а-химотрипсина (благодаря его углевод-связывающему центру) образовывать иековалентные комплексы с углевод-содер:*ащими молекулами (материалами) открывает новые перспективы конструирования и регуляции надмолекулярных структур с участием этого фермента, используемого в медицине и биотехнологии. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: Ш-ем Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (г. Москва, Россия, 1993), Int. Conference "Biocata!ysis-95" (г. Суздаль, Россия, 1995); VI Int. Conference "Frontiers in Biochemistry and Molecular Biology. The legacy of Andrey Belozersky" (Moscow, Russia,
1995); XI Int. Symposium on Surfactants in Solution (Jerusalem, Israel, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 іечатньїе работы.
Объем it структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литератуты, постановки задачи, экспериментальной части, результатов, и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (180 наименований). Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает 2 таблицы и 41 рисунок.