Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ, обусловлена необходимостью структурного исследования межбелковых контактов а поверхности белковых молекул, дающего ценную и новую информацию, важную для обсуждения кинетических закономерностей диссоциативной инактивации (в, части ости, термоанактивацнк) ферментов и в проблемах их стабилизации.
В предыдущих работах на основе анализа кинетических данных термоинактивации ряда ферментов-димеров и тетрамеров была предложена концепция копформационпого замка, предполагающая постадийное изменение соединяющих участков в области межбелкового взаимодействия, последовательное разрушение которых приводит в итоге к потере ферментом активности. Структурные исследования дают независимые данные, существенно дополняющие выводы кинетических исследований.
Так как результатом данной работы явилась разработка ряда программ, применимых для любой белковой молекулы, то круг рассматриваемых проблем может оказаться более широким и затрагивать многие важные вопросы современной молекулярной биологии.
Так, в работах последних лет было также установлено, что димеризация может выступать как способ передачи сигнала внутри клетки и наравне с "аллостерией" может служить механизмом регуляции активности ферментов (см. разделы "Щелочная фосфатаза" а "Глнкогея-фосфорилаза"). Регулируемая димернзацяя белков имеет важное значение в таких клеточных процессах, как передача сигнала я траясхрипция.
Кроме того, исследование свойств поверхности белков необходимо при изучении адсорбции белков на различных поверхностях раздела и в связи с проблемами синтеза биокатализаторов.
Многостадийная диссоциативная термоинактивация ферментов, возможные механизмы которой обсуждаются в данной работе на примере нескольних ферментов, происходит в узком температурном антервале и в ограниченных интервалах рН я концентраций ионов металлов, необходимых для работы некоторых ферментов. Вероятно, вследствие этого, диссоциативная инактивация была практически не исследована и, соотвественно, никем не проводилось и структурное обоснование многостадийной инактивации олигомерных ферментов.
С другой стороны, существуют работы, связанных с исследованием межбелкопых контактов, в которых описываются их разные структурные, (точнее, геометрические) характеристики. Как правило, эти работы проводятся при помощи программ и на большом наборе структур белков (200-300) и, как правило, преследуют задачи нахождения каких-то общих
чисто структурных характеристик белка, а не решения конкретных кинетических проблем, которые обсуждаются в данной работе.
ЦЕЛЬ ДАННОЙ РАБОТЫ состояла в получении отсутствующих к данному времени данных о ряде важных для кинетики свойств межбелковых контактов и поверхности олигомерных ферментов. Для этого было необходимо:
1. Разработать программно-воплощенные методики структурного
анализа межбелковых контактов олигомерных ферментов, пространственное
строение которых установлено методом РСА с разрешением не ниже 2.5 А.
2. Разработать программно-воплощенные методики анализа
молекулярной поверхности белковой глобулы.
3. Разработать методы для нахождения возможных структурных
механизмов разрушения межбелковых контактов димерных ферментов для
их применения к обсуждению инактивации соотвествующих ферментов и
нахождению соответствия между данными кинетических исследований и
результатами структурного анализа.
4. С помощью разработанных методов изучить межбелковые контакты олигомерных ферментов. Были подбробно изучены структуры четырех ферментов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ обусловлена в значительной мере совместным анализом кинетических к структурных данных, относящихся к свойствам межбелковых контактов п строению поверхности белковых глобул. Такие данные для щелочной щелочной фосфатазы из E.coli, алкогольдегидрогеназы из печени лошади, енолазы из пекарских дрожжей и гликогенфосфорилазы из мышц кролика получены впервые.
-
Написан комплекс программ, позволяющих разносторонне а нализировать любую белковую структуру, в частности, с целью нахождения взаимосвязи между активным "центром" белка и межбелковым контактом.
-
Результаты анализа позволяют выделить наиболее структурно значимые аминокислотные остатки, что может оказаться полезным для белковой инженерия посредством мутагенеза отдельных остатков.
3. Указана возможность того, что различные воздействия на молекулу белка, обусловлениые нагревом, образованием межбелкового контакта (олнгомеризациея), связыванием аллостеряческого лиганда я пост-трансляционой регуляцией (фосфориларованием) со структурной точки зрения эквивалентны и сводятся к частичному развертыванию (или свертыванию в случае связывания лиганда) находящихся на поверхности петель и топологических мотивов (совокупности петель и других элементов вторичной структуры белка). Данный вывод позволяет использовать результаты различных видов кинетических исследований ферментов (как in vitro, так и in vivo) для нахождения взаимосвязи структуры и активности.
і. Использование трех различных методов структурного анализа поверхности белковой молекулы, и, в частности, поверхности межбелкового контакта позволяет судить о возможных функциях различных участков поверхности белковой молекулы, и, следовательно, может быть важным для многих наук, исследующих биологические объекты (например, в молекулярной биологии, эязимология, цитологии ).
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ данной работы определяется прежде всего важностью кинетического исследования стабильности ферментов в связи с их использованием в различных разделах науки и отраслях промышленности.
АППРОБАЦИЯ РАБОТЫ-доклад яа II съезде Биохимического общества РАЛ 1997 (Москва) и доклад на конференции "Ломоносов-96" (Москва)
ПУБЛИКАЦИИ По результатам данной работы опубликовано 4 статьи.
ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация представляет собой рукопись на 170 страницах, содержит 23 иллюстрация и 30 таблиц. Список цитируемой литературы содержат 145 ссылок.
Работа состоит из введения (литературный обзор) и трех глав. В литературном обзоре (глава 1) рассмотрены: концепция "конформационного замка"и кинетическое изучение механизмов инактивации олигомерных ферментов, методы структурного анализа межатомных нековалеятых взаимодействий в пределах белковой глобулы н методы расчета площади поверхности и точек поверхности молекулы белка. Приведено качественное описание физической модели инактивации в водном растворе и рассмотрена взаимосвязь кинетических и структурных параметров.
В главе 2. под названием "Кинетическое изучение стабильности щелочной фосфатазы из различных источников. Материалы и методы. Методика эксперимента" рассмотрены Физико-химические свойства щелочных фосфатаз из различных источников, определение активности щелочной фосфатазы и концентрация белка в растворе, изучение кинетики ассоциации димер-тетрамер и результаты кинетических исследований термоинактивации щелочной фосфатазы.
В главе 3. под названием "Методики изучения межбелковых контактов и свойств поверхности белковых молекул по данным РСА" описаны разработанные методики анализа нековалентных взаимодействий в межбелковом контакте, нахождения взаимодействующих аминокислотных остатков и анализа поверхности белковой глобулы.
В главе 4 под названием "Строение, конформационяый замок, связь свойств поверхности молекулы в активности нескольких олигомерных ферментов." рассмотрены результаты изучения структур щелочной фосфатазы из E.coli, алкоголь-дегидрогеназы из печени лошади, енолазы
из пекарских дрожжей и глпкогеифосфорилазы из мышц кролика и обсуждаются структуры межбелковых контактов димеров, их связь с активным центром и возможные механизмы их инактивации.