Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование водно-органических сред для проведения ферментативных реакций имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с водными растворами. В первую очередь, это улучшение растворимости гидрофобных субстратов и эффекторов и сдвиг термодинамического равновесия многих практически важных реакций в сторону образования требуемых продуктов. Однако, эти преимущества, как правило, могут реализоваться только при высоких концентрациях органических растворителей, когда ферменты теряют каталитическую активность. Для повышения устойчивости ферментов в водно-органических смесях в литературе разработан ряд подходов. Наиболее широко изучены методы стабилизации ферментов в водно-органических средах, основанные на использовании гетерогенных систем (фермент-содержащие суспензии и ферменты, иммобилизованные на нерастворимых носителях). Гетерогенные биокаталитические системы характеризуются высокой технологичностью, связанной с легкостью отделения продукта реакции и регенерации катализатора, и широко применяются для практических целей. В то же время, для проведения ферментативных реакций крайне привлекательны гомогенные водно-органические системы ввиду отсутствия диффузионных ограничений и высоких скоростей реакций. К существенным преимуществам гомогенных систем относится также их оптическая прозрачность, что позволяет определять каталитическую активность ферментов и изучать их структурные свойства оптическими методами, например, спектрофотометрическим и флуоресцентным. Таким образом, разработка эффективных и универсальных методов стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических системах весьма актуальна. Отметим, что в настоящее время методы и механизмы стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических смесях систематически не изучены, проведенные исследования были направлены, в основном, на разработку биокаталитических систем, применимых для конкретных практических целей.
Настоящая работа посвящена разработке методов и изучению механизмов стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических системах. Для повышению устойчивости ферментов в таких системах нами предложено
использовать методы, основанные на образовании нековалентных комплексов и
ковалентных конъюгатов с использованием как высоко-, так и низкомолекулярных
соединений.
Цель работы. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
1. На примере ос-химотрипсина изучить влияние на каталитические свойства
ферментов в гомогенных водно-органических смесях:
а) образования нековалентных комплексов с полиэлектролитом;
б) образования нековалентных комплексов с олигоаминами;
в) образования ковалентных конъюгатов фермента с полиалкиленоксидами;
г) ковалентной модификации низкомолекулярными гидрофильными
соединениями;
д) комбинацией методов ковалентной модификации низкомолекулярными
гидрофильными соединениями и нековалентного комплексообразования с
полиэлектролитами и олигоаминами.
2. Физико-химическими методами изучить структуру модифицированных
препаратов а-химотрипсина в водно-органических смесях с тем, чтобы соотнести
кинетические эффекты, обусловленные модификацией фермента, со
структурными изменениями, происходящими в белках в присутствии органических
растворителей.
Научная новизна работы. Найдено, что профиль каталитической активности а-химотрипсина в водно-органических смесях имеет два характерных вида, в зависимости от используемого субстрата. В случае субстратов, для которых скорость лимитирующей стадией является образование ацилфермента, при невысоких концентрациях органических растворителей (10-30 об. %) наблюдается активационный эффект. При дальнейшем увеличении содержания органического растворителя в смеси происходит снижение каталитической активности фермента до нуля. В случае субстратов, для которых скорость лимитирующей стадией является деацилирозание, наблюдается уменьшение каталитической активности фермента во всем интервале концентраций органического растворителя.
В настоящей работе систематически изучены пути и молекулярные причины стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических смесях (на примере а-химотрипсина). Показано, что при образовании нековалентных комплексов с
поли- и олигоаминами и ковалентной модификации полиалкиленоксидами и низкомолекулярными гидрофильными соединениями интервал концентраций органических растворителей, в котором фермент сохраняет каталитическую активность не ниже 10% от "водного уровня", существенно расширяется.
Найдено, что образование нековалентных комплексов фермента с поли- и олигокатионами и ковалентная модификация полиалкиленоксидами приводит к существенному увеличению активационного эффекта (в реакции гидролиза анилидных субстратов) в водно-органических смесях по сравнению с нативным ферментом.
Установлено, что при комбинации методов ковалентной модификации низкомолекулярными заряженными соединениями и нековалентного комплексообразования с поли- и олигокатионами активационный и стабилизационый эффекты усиливались. Таким образом были получены препараты а-химотрипсина, высокоактивные в широком интервале концентраций органических растворителей (от 0 до 90-95 об.%).
Показано, что основными механизмами стабилизации химотрипсина в водно-органических смесях являются: подавление агрегации, многоточечное закрепление нативной конформации фермента, изменение микроокружения фермента.
Практическая значимость работы. Предложенные в работе методы стабилизации ферментов в водно-органических смесях: образование нековалентных комплексов с поли- и олигокатионами, ковалентная модификация высоко- и низкомолекулярными соединениями и комбинация методов ковалентной модификации и нековалентного комплексообразования расширяют круг практического использования ферментов для целей анализа и тонкого органического синтеза благодаря существенному повышению уровня каталитической активности биокатализатора в широком интервале концентраций органических растворителей.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 3 Всероссийском Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), 16 Международной Конференции "Биохимия и Молекулярная биология" (New Delhi, India, 1994), Международном Симпозиуме "Молекулярная подвижность
и порядок в полимерных системах" (Санкт-Петербург, 1994), Международной
конференции студентов и аспирантов "Ломоносов 96" (Москва, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы (3 главы), постановки задачи, экспериментальной части,
изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой
литературы ( наименований). Работа изложена на страницах и включает
таблиц и рисунков.