Введение к работе
Актуальность темы. Изучение взаимосвязи структуры и стабильности белков представляет собой одну из фундаментальных проблем современной биологии. Без понимания основных закономерностей воздействия различньи факторов среды на конформационное состояние и стабильность белков невозможно ни изучение сложных ферментативных процессов, ни создание ферментных систем с заранее заданными свойствами. С дрзтой стороны, применение ферментов на практике во многих случаях сдерживается низкой стабильностью ферментных катализаторов. Поэтому разработка общих незмпирических принципов стабилизации белков является важнейшей задачей инженерной энзимологии.
Все существующие в настоящее время методы стабилизации ферментов против необратимой термоинактивациик являются разновидностями трех основных подходов.
Первый подход заключается в упрочении белковой молекулы в результате изменения ее первичной структуры. Замена аминокислотных остатхов с помощью генно-инженерных процедур, ковалентная модификация внутренних областей глобулы, наложение поперечных сшивок и т. д. позволяет усилить "слабые" по отношению к инактивации места молекулы фермента. Такие процедуры требуют подробного знания структуры фермента для точного воздействия на конкретные группы. Это делает подход технически сложным, часто он приводит к непредсказуемым результатам.
Второй подход основан на защите фермента от влияіпія неблагоприятных факторов среды путем создания благоприятного мккроскружения. Воздействие на белок осуществляется на уровне третичной структуры молекулы. Реализация этого подхода осуществляется путем иммобилизации фермента, его солюбилнзации в мицеллах, ксвалентной и нековалентной модификации поверхности белка. Эти методы хорошо изученны и трлдкционны для энзимологии. Основным их недостатком является гетерогенность, а также непредсказуемость свойств полученного модифицированного препарата или созданной системы.
Этих недостатков лишен третий способ воздействия на стабильность - создание оптимальной для стабильности фермента макросреды. Он основан на изменении структуры растворителя в
присутствии различных . растворенных веществ, например, солеи, органических растворителей и т. п. В результате изменяется гидратация фермента и опосредованно - его структура и стабильность. Принцип универсален и просто реализуется, т. к. применим для ферментов различных классов и не требует точного знания их структуры.
До недавнего времени разобщенные, иногда противоречивые литературные данные не позволяли сформулировать общую идею стабилизации белха низкомолехулярными добавками. В литературе отмечено, что, например, соли влияют на термоинактивацию ферментов, как правило, согласно положению в ряду Гофмейстера, сделаны многочисленные попытки описать в виде корреляционных уравнений влияние на стабильность ферментов органических растворителей. Однако, полное понимание влияния свойств среды на термосгабильносгь ферментов, особенно при высоких температурах, пока не достигнуто.
Основная 'цель работы состояла в том, чтобы изучить термоинактивацига ферментов (на примере а-химотрипсина и рибонуклеази А) в присутствии различных солей, денатурантов, органических растворителей и установить ее основные закономерности при высоких температурах.
Научная новизна работы. Проведено ишрокошюигабисе исследование термсяшакгиващт а-химотрипсина в различных солевых системах. Показано, что зависимость константы скорости необратимой термоиигктивации нативньк химотрипсина и рибонуклеази от температуры в координатах Аррениуса при низких значениях рН, а также в растворах хаотропных веществ имеет необычный "пилообразный" характер. Нелинейная зависимость объяснена в рамках кинетической схемы, основным элементом которой является обратимый конформационный переход кгтизяой формы фермента в более развернутую форму, стабильную при высокой температуре. Показано, что "высокотемпературная'' форма а-:шмотрипсина не обладает каталитической активностью по отношению к специфическому модельному субстрату, но сохраняет протеолігпгческую ферментативную аіггавность по отношению к полимерному белковому субстрату.
Предложены количествеїсиле критерии выбора оптилиимлюй (с токхи гргяия стабильности белха) водно-солевой среды. Обнаружена корреляция стабильности а-химотрипсина по отношению х необратимой инактивации при высоких температурах с хаотропкыми (всализающими) свойствами среды. Корреляция объяснена влиянием расгвореьных
веществ на конформационное равновесие между двумя формами фермента, различающимися по стабильности. Показано, что вещества разной природы: органические и неорганические соли, денатураты, органические растворители, а также их смеси воздействуют на стабильность фермента аддитивно. Для а-химотрипсина в сильновсаливающих растворах достигнуты более чем стократные стабилизационные эффекты, сравнимые с эффектами, достигаемыми методами химической модификции и иммобилизации.
Научная и практическая значимость. Продемонстрированная в работе возможность регуляции стабильности и каталитической активности ферментов целенаправленным изменением хаотропных свойств среды может быть положена в основу стратегии создания высокостабильных растворимых ферментных систем с заданными свойствами.
Достигнутые для а-химотрипсина стабилизационные эффекты могут представлять интерес для решения практических задач, в которых требуются препараты, способные выдерживать воздействие высоких температур без существенной необратимой потери каталитической активности, например, в условиях стерилизации, при производстве синтетических моющих средств, в кожевенной промышленности и т. п.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VI и VII Всесоюзных симпозиумах по инженерной эшимологии (Вильнюс, 1988, Москва, 1991), XX Конференции федерации европейских биохимических обществ (Будапешт, 1990), VII Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Варна, 1990), Всесоюзной конференции НПО "Биолар" по методам получения^анализа и применения ферментов (Рига, 1990).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (посвященного механизмам инактивации белков и влиянию на их стабильность низкомолекулярных веществ), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (из 2.1 ^_ наименований). Работа изложена на 1SP страницах и включает 2 таблицы и 'і^.рисунков.