Введение к работе
. Актуальность проблемы. В настоящее время очевидно, что варьировании нэдкотекулярной оргзнизащт ферментов играет исключительно важную роль в регуллщш их каталитической активности. Известно, что изменения надмолекулярных состава и структуры олигомерных ферментов может сопровождаться их активацией (инактивацией), изменением субстратной специфичности и т.д. Многие ферменты в процессе метаболизма, например, в результате присоединения к белковой глобуле (или отщепления от нее) гидрофобных якорных групп переходят из растворимой формы в мембрэно-связаннуга (либо наоборот). Такое изменение надмолекулярной организации ферментов также монет сопровождаться существенным изменением их каталитической активности.
Изучение этих процессов в экспериментах in vivo затруднено сложностью оргашізащпі живой клетки и одновремешшм протеканием в ней множества взаимосвязанных процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой цели различные модельные системы. Слюй из наиболее перспективных модельных систем является система обращенных мицелл поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. При солюбшшззции в таких системах ферменты включаются во внутрештею полярную полость мицелл, приобретая оболочку из монослоя гидрзтігроваїшьгА молекул ІІАВ. В 1977 году в работах ІС.иартинека п сотр. (Докл. АН СССР, 236, 920 (1977)) было установлено, что вклтелптв в такие системы ферменты проявляыг каталитическую активность. Эти работы поло;:зглп начало "мицеллярной энзкмэлогии" - научному направлению, изучающему катализ ферментами в системах обращенных мицелл.
Размер внутренней полости шщелл мзкно в широком диапазоне варьировать (от десятка до сотен и более А), изменяя степень гидратации ПАВ - н - F/.олярное отнопешіе [н2о]/[ПАВ] в системе. Таким образом, в обращенной мицелле при различных степенях гидратации может помещаться как одйа молекула белка, так и крупные белковые комплексы как целое. Иными слоза?оі, обращенные шцеллц могут служить матрицами регулируемого размера для сборки белковых комплексов различного состава. С другой стороны, использование мицеллярной системы в качестве реакщ'.ошюй среды позволяет исследовать свойства ферментов различной природы (как гндрофобішх мембранных, так и водорастворимых немембраншх) в стандартных условиях.
Цель работы. При выполнении работы были поставлены следующие основные задачи. Во-первых, исследовать возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов (щелочной фосфатазы и r-глутамилтрансферазы) в системе обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях (Аэрозоля ОТ1 в октане). Во-вторых, исследовать взаимосвязь надмолекулярной структуры этих ферментов и их каталитической активности в системе обращенных мицелл. В-третьих, провести сравнительное изучение кинетических закономерностей функционирования мембранных и растворимых Форм ферментов (щелочная фосфатаза, у-глутамилтрансфераза, ашшопептидаза) в системе обращенных мицелл.
Научная новизна работы. На примере щелочной фосфатазы и зг-глута-милтрансферазы, показана принципиальная возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов в системах обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях при изменении степени гидратации ПАВ. Установлено, что зависимость каталитической активности этих ферментов от степени гидратации тлеет вид кривой с несколькими максимумами -различные максимумы соответствуют функционированию, различных надмолекулярных структур. Впервые установлено, что отделыше субъединицы 7-глутзмилтррчсфзразы и щелочной фосфатазы обладают каталитической активностью. Предложен метод разделения субъединиц гетеродимерных ферментов в неденатурирувдих условиях, основанный на скоростной седиментации содержащих эти ферменты систем обращенных мицелл. На примере r-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы и аминопептидазы установлены различия в закономерностях регуляции активности мембранной и ізствори-мой форм ферментов в системе обращенных мицелл: каталитическая активность мембранных форм зависит от концентрации ПАВ при постоянной сте-пени гидратации, для растворимых форм такая зависимость не обнаруживается. Зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ может служить тестом на мембраноактивность ферментов.
Практическое значение работы. Установленная в работе возможность использования обращенных мицелл в качестве матрицы регулируемого размера для целенаправленного изменения надмолекулярной структуры олигомерных ферментов может быть положена в основу новой стратегии нсследо-
1. Аэрозоль ОТ (АОТ, натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфэянтарной кислоты)
вания взаимосвязи структуры и функции олигомерных ферментов, полифер ментных систем и надмолекулярных комплексов других биополимеров
Полученные результаты представляют практический интерес для моделирования природного окружения мембранных ферментов и изучения регуляции каталитической активности ферментов при их обратимом переходе из мембранной в растворимую форму.
Материалы диссертации используются в лекционных курсах, читаемых на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ.
Апробация работы. Основные результаты работы были изложены на y Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (КоОулети, 1985), Y Всесоюзной конференции "Физико-химические основы ферментативного катализа" (Москва, 1987), хи Всесоюзном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987), yi Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии (Вильнюс, 1988), Международной конференции "Химическая физика ферментативного катализа" (Таллин, 1987), xiy Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), yi Конференции молодых ученых по органической химии (Бехин, ЧССР, 1989).
Публикации. По материалам диссертации опубліковую II печатных работ. .
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (по организации белков на биологических мембранах и свойствам ферментов в системах обращенных мицелл), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов п списка цитируемой литературы (из 191 наименования).Работа изложена на 132 страницах н вклячает I таблицу п 57 рисунков.