Введение к работе
Актуальность проблемы. Активация протеолиза является важным патогенетическим звеном в развитии деструктивных, воспалительных, аллергических реакций, нарушении процессов гемостаза, а также одним из факторов, способствующих инвазии клеток злокачественных опухолей. Наиболее деструктивным ферментом организма признана лейкоцитарная эласгаза (HLE), способная расщеплять практически все компоненты соединительной ткани. В случае патологически повышенной активности протеиназ в организм в терапевтических целях вводят ингибиторы протеолитических ферментов. Актуальность хинетического изучения взаимодействия протеиназ с их белковыми ингибиторами связана с возможностью использования кинетических параметров, измеренных in vitro, для предсказания эффективности антипротеиназньгх лекарственных средств in vivo. Еще более важной задачей является изучение возможности создания на основе белковых ингибиторов протеиназ нетрадиционных лекарственных средств, используя инженерно-энзимологические подходы, целенаправленно изменяя свойства белка.
Цель и задачи исследования. Целью работы является физико-химическое исследование возможностей биомедипинского применения соевых ингибиторов протеиназ типа Баумана-Бнрк (ВВІ). В связи с этим поставлены следующие задачи:
Разработка метода выделения и очистки соевых ингибиторов протеиназ.
Изучение аминокислотного состава, физико-химических и иммунологических свойств выделенных ингибиторов.
Кинетическое исследование специфичности выделенных ВВІ.
Получение .высохоахтивных иммобилизованных к модифицированных форм классического соевого ВВІ, изучение их свойств.
-Изучение фармакокинетики нативного и модифицированного классического соевого ВВІ.
Научная новизна и практическая значимость работы. 1) Выделены и охарактеризованы как классический ВВІ, так и новые, ранее неизвестные двухцелтровые белковые ингибиторы протеиназ из соевых бобов (богатые глицином, высокомолекулярные ингибиторы), способные подавлять активность трипсина, HLE и химртрипсиноподобных протеиназ. 2) Определены кинетические и равновесные константы процесса взаимодействия выделенных соевых ингибиторов протеиназ с трипсином, химотрипсином, эластазой и катспсином G гранулоцитов человека. 3) Детальное кинетическое исследование взаимодействия ВВІ с протсиназами привело к выводу о том, что данные ингибиторы могут быть классифицированы как медленно реагирующие и прочно связывающиеся с протеиназами. А) Проведена дискриминация механизмов иигвбироваиия протеиназ
классическим соевым ВВІ. Показано, что процесс ингибирозания является двухстадийным. Он включает быстрое образование фермент-ингибиторного комплекса ЕІ и последующий медленный переход в более прочный комплекс ЕГ. 5) Продемонстрировано, что классический ВВІ является эффективным ингибитором эластинолиза, катализируемого HLE, на разных стадиях протекания этого процьсса. 6) Установлено, что с кинетической точки зрения классический соевый ВВІ в микромолярном диапазоне концентраций может рассматриваться как перспективное эффективное антипротеиназное лекарственное средство. 7) Предложено использоваїь аффинный сорбент, содержащий классический ВВІ, для выделения HLE из экстракта лейкоцитов как более эффективный по сравнению с традиционно применяемым сорбентом, содержащим панкреатический ингибитор трипсина. 8) Впервые созданы на основе классического соевого ВВІ модифицированные оксиэтилхрахмалом и блоксополимером окиси этилена и окиси пропилена (проксанолом) препараты для потенциального медицинского применения. 9) Выявлено, что модификация классического соевого ВВІ проксанолом приводит к пролонгированию действия и изменению биораспредеяения препарата.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзных конференциях "Современные методы выделения и очистки биологически активных веществ" (Ялта, 1990), "Ферменты - народному хозяйству" (Черновцы, 1990), "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная этимология" (Москва, 1991), Международной конференции "Современная энзимология: проблемы и пути развития" (Санкт-Петербург, 1992), III Симпозиуме "Химия протеолитичесхих ферментов" (Москва, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (294 наззания). Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 19 таблиц.