Кинетические закономерности и механизмы взаимодействия лигандов с рецепторами. Ацетилхолиновый рецептор мускаринового типа Ярв, Яак Лембитович

Введение к работе

Актуальность проблемы Центральное место в рецепторной теории передачи информации в живых организмах занимает представление о взаимодействии эндогенных и экзогенных лигандов со связывающими центрами рецепторов. На этой стадии обеспечивается селективность действия рецепторних систем, а также открывается путь к модуляции или блокированию физиологически активными веществами процесса передачи информации. Заложенные здесь практические возможности целенаправленного влияния на регуляторные процессы живого организма объясняют актуальность исследования реиептор-лигандных взаимодействий и интерес к созданию "фармакофоров" для оптимизации и прогнозирования структур физиологически активных веществ. С этой целью интенсивно развиваются количественные методы анализа взаимосвязи активности и строения физиологически активных веществ,включая конформационный анализ молекул лигандов с помощью ЭВМ.

С другой стороны, развиваются и экспериментальные возможности исследования рецептор-лигандных взаимодействий. С начала семидесятых годов широкое применение нашел метод радиолигандного анализа, что привело к появлению в литературе большого числа экспериментальных данных, полученных в равновесных условиях связывания лигандов с рецепторами. При этом, однако, не раскрывается механизм процесса и нельзя установить физическое содержание вычисляемых параметров, что уменьшает информативность и надежность результатов анализа.

Кроме того, анализ собранного нами из литературы банка данных по взаимодействию лигандов с мускариновым рецептором показывает, что в практике часто не соблюдается требование о равновесном состоянии системы, что приводит к дополнительным трудностям интерпретации результатов. Все это в значительной степени мешало реализации фундаментальных и практических задач в области рецепторологии.

Выходом из сложившейся ситуации является развитие кинетической теории рецептор-лигандных взаимодействий и анализ механизмов этих процессов методами физической органической химии. Только при этом можно ожидать прорыва в сторону более глубокого понимания физико-химических основ рецепторных механизмов, включая и молекулярные основы селективности их функционирования .

В данной работе на примере мускаринового рецептора проведен комплекс кинетических исследований с целью выяснения

молекулярных механизмов рецептор-лигандных взаимодействий. Изученный рецептор распространен в. центральной и периферической нервной системе и участвует в регуляции ряда важных физиологических процессов. В связи с этим фармакологические свойства этой рецепторной системы подробно описаны и соответствующие представления послужили отправной точкой для нарих исследований, проводившихся с конца семидесятых годов и положивших начало практическому применению кинетического подхода для исследования механизма взаимодействия лигандов с рецептором. Далее эти методы исследования нарли применение и в других лабораториях мира в целях изучения закономерностей взаимодействия лигандов с рецептором.

Конкретные цели и задачи исследования связаны с физико-химическим изучением механизма и специфичности лиганд-рецеп-торных взаимодействий, а также с выявлением некоторых структурных и функциональных особенностей мускаринового рецептора из центральной и периферической нервной системы. Основным подходом явилось последовательное применение методов химической кинетики. Для достижения поставленных целей был рещен ряд фундаментальных и практических задач, к которым можно отнести следующие.

Во-первых, определение физико-химических свойств лиганд-связываюиего центра мускаринового рецептора и выявление закономерностей солюбилиэации рецепторного белка.

Во-вторых, установление кинетических закономерностей связывания антагонистов с мембранным рецептором и исследование эффектов температуры и концентрации электролита на кооперативный характер этого процесса. Кроме того, изучена кинетика диссоциации комплексов рецептора с антагонистами и разработана многостадийная кинетическая схема рецептор-лигандного взаимодействия.

В-третьих, исследование кинетических закономерностей взаимоотношения агонистов и антагонистов при их связывании с мускариновым рецептором.

В-четвертых, изучение взаимной зависимости свойств рецепторного белка и биомембраны и определение роли липидного окружения рецептора в кооперативном механизме связывания лигандов.

В-пятых, на основе разработанных кинетических схем рассматриваются вопросы взаимоотношения строения и активности мускариновых лигандов. Составлен банк литературных данных, содержаний более 6000 отдельных констант диссоциации для 400

взаимодействующих с мускариновым рецептором венеств. На базе этого банка данных проведен анализ современного состояния и тенденция развития физико-химической рецептологии на частном примере мускаринового рецептора.

Научная новизна работы связана с созданием нового научного направления, заключающегося в исследовании механизма и специфичности рецептор-лигандных взаимодействии методами химической кинетики и количественного анализа эффектов строения и среды на теоретической основе принципа линейности свободных энергия реакций.

Разработаны методы изучения кинетики связывания радиоактивных и нерадиоактивных лигандов с мембранным и солюбили-зированным рецепторами и диссоциации рецептор-лигандных комплексов. Впервые проведено систематическое исследование кинетики этих процессов сравнительно для мускариновых рецепторов мозга, сердца и тонкой кирки крысы.

Доказан многостадийный механизм связывания антагонистов с мускариновым рецептором мозга, сердца и тонкой кирки крысы, включающий ряд медленных стадий изомеризации рецептор-лиганд-ного комплекса. Для рецепторов мозга и сердца обнаружен факт кооперативной регуляции скорости комплексообразования и доказано существование разных лиганд-связывающих центров на мембранном рецепторе. Систематически изучена зависимость кооперативного эффекта от температуры и концентрации электролита, что позволило более детально охарактеризовать физико-химическую природу обнаруженного феноменона.

Доказан неконкурентный характер связывания агонистов и антагонистов с рецептором, что свидетельствует об образовании тройного комплекса в этом процессе.

Измерена кинетика химической модификации функциональных групп, контролирующих лиганд-связывеюиие свойства мускаринового рецептора, с целью получения количественных параметров для характеристики доступности этих групп в мембранном и солюбилизированном рецепторах. Получено доказательство участия -SH и -СООН групп рецептора в определении его лиганд-свя-зываюыих свойств и -SS-rpynnu при стабилизации активной кон-формации рецепторного белка.

Разработан подход к изучению сольватационных свойств лиганд-связываюиих центров белков с применением иона N.N-ди-метил-2-фенилазиридиния в качестве зонда. Установленные для сольволиза этого зонда количественные закономерности влияния среды дают возможность охарактеризовать сольватационные

свойства в лиганд-связываюших центрах белков.

В работе исследовалась функциональная взаимосвязь муска-ринового рецептора и виомемсраны путем сопоставления свойств мембранного и солюбилизированного рецепторов, в том числе актиеационных параметров для инактивации этих препаратов. Применение биоспецифических УФ зондов показало, что взаимодействие лигандов с мускариновым рецептором изменяет микровязкость биомембраны.

Установленные кинетические закономерности впервые дают возможность обсудить эффекты строения лигандов на отдельных стадиях их взаимодействия с мускариновым рецептором. В рамках данной работы был составлен уникальный банк литературных данных радиолигандного анализа, охватывающий более 6000 констант диссоциаций для препаратов мускаринового рецептора из разных тканей. Обобиение этих данных позволило продемонстрировать несостоятельность одностадийной равновесной схемы для связывания с мускариновым рецептором хинуклидинилбензилата, наиболее часто применяемого лиганда в опытах с этим рецептором. На базе собранного материала дана оценка современному состоянию и тенденциям развития физико-химической рецеп-торологии на частном примере мускаринового рецептора.

Практическая значимость работы состоит в том, что в ней сформулирован ряд общих подходов к исследованию механизма взаимодействия лигандов с клеточными рецепторами, представляющих интерес для целенаправленного поиска новых физиологически активных веществ. Кроме того, многостадийный механизм связывания лигандов с рецептором имеет, очевидно, более обмую распространенность и представляет интерес при исследовании других рецепторних систем. В работе проведен синтез радио-лигандов, меченных тритием до высокой удельной радиоактивности, что отменяет необходимость в импортных препаратах для научных и практических целей. Составленный банк данных, допускающий автоматизированный поиск информации на ЭВМ по необходимым признакам, является уникальным справочным материалом и будет включен в состав пакета экспертных систем, составляемых фирмой "CompuDrug", Венгрия. Результаты данных исследований внедрены в практику при выполнении планов научно-исследовательской работы Тартуского университета. Результаты работы и теоретические обобщения по механизмам рецептор-лигандного взаимодействия используются в преподавании основ физической биохимии на химическом отделении Тартуского университета.

Объектом исследования данной работы был ацетилхолиновый рецептор мускаринового типа (мускариновый рецептор) коры больших полушарии мозга, сердца и тонкой кирки крысы. В опытах использовали суспензии мембранных фрагментов в буферных растворах,а также препарат солюбилизированного рецептора мозга. В отдельных опытах использовали синаптосомы коры мозга крысы. Связывание радиолигандов с мембранным рецептором определяли на стекло-волокнистых фильтрах фирмы Whatman (GF/B и GF/C). Солюбилизированный рецептор определяли методом гель-фильтраций на миниатюрных колонках Sephadex G-50. Следует отметить, что осе эти методики были приспособлены к проведению

кинетических измерений методом отбора проб.

з В работе использовали коммерческие препараты L-[ Н]хи-

нуклидинилбензилата (30-40 Ки/ммоль, L-[ Н]ХБ) и L-[ Н]метил-

з скополамина (32 Ки/ммоль, L-[ Н]МеСА) фирмы "Amersham", Анг-

лия. L-[ Н]Мегилхинуклидинилбензилат (32 Ки/ммоль,Ь-[Н]МеХБ)

з 3 был нами синтезирован метилированием L-[ Н]ХБ, [ Н]метил-

3 пиперидинилбензилат(72 Ки/ммоль,[ Н]МеПБ) был любезно предоставлен проф. Т.Бартфаем (Стокгольмский университет). Другие лиганды были коммерческие продукты, либо синтезировались в нащей лабораторий, либо предоставлялись для исследования проф. Н.Н.Годовиковым (ИНЭОС АН СССР, Москва).

1.1. Солюбилизация рецептора

Из исследованных нами 15 детергентов (Triton Х-45,100, 102,114,165 и 405, Tween-20,40,60 И 80, додецилсульфат, холат и дезоксихолат натрия, CHAPS, дигитонин) для солвбилизации мускаринового рецептора применим дигитонин, дающий максимальный выход солюбилизации до 50, и CHAPS о выходом до 10%. Условия солюбилизации оптимизировали варьированием температуры и длительности обработки мембран детергентом,а также отношения концентрации белка и детергента. Комплекс рецептора с

3 L-C Н]ХБ солюбилизируется кроме дигитонина и CHAPS такте

детергентами Triton Х-100, 102, 114 и 165 с выходами до 50». Соединения ряда Tween оказались неэффективными, хотя они хорошо солюбилизируют другие белки мозговых мембран. Рецеп-торные частицы в мицеллах дигитонина или Triton Х-100 элюиру-гатся при гель-хроматографии в виде симметричных пиков и характеризуются стоксовыми радиусами 5в% и 46А\ соответственно. Рецепторний белок удалось очистить афинной хроматогра-

фией до 1000 раз по сравнению с исходным дигитониновым солю-билизатом. Эта процедура, однако, не оказалась тривиальной в связи с малой скоростью диссоциации рецептора из комплексов с афинными сорбентами, синтезированными из з-(2'-аминобенз-гидрокси)тропана, рекомендованного К.Хага и Т.Хага (J.Biol. Chem.,1983) в качестве афинного лиганда. Емкость сорбента определялась структурой и длиной "ножки" и оказалась максимальной в случае цепочки из 12 звеньев:

-NH(CH₂)₆NHC(0)(CH₂)₂C(0)-L. Из этого афинного сорбента удалось при 25С и в присутствии 1,5 нМ ХБ вытеснить в течение 2 часов 10 связанного с гелем рецептора, а в течение 12 часов выход элюирования увеличился до 20. Поэтому афинную хроматографию не удалось применить для рутинной очистки рецептора в целях его использования в кинетических измерениях. Резюме. Оптимизированы условия солюбилизации мускаринового рецептора коры больших полуріарий мозга крыс, изучены возможности очистки рецептора афинной хроматографией и установлены стоксовские радиусы солюбилизированных рецепторних частиц.

1.2. Функциональные группы, контролирующие связывание

антагониста с рецептором.

По данным литературы химическая модификация SH-,SS-,NH„-и соон'-групп мускаринового рецептора приводит к икгиаированию части лиганд-связывающих центров, что было принято как доказательство химической гетерогенности этого белка в биомембранах (Hedlund & Bartfai, 1979; Цемурокин и др., 1982; Birdsall & Hulme, 1983; Sokolovsky, 1983). В отличие от использованного в этих работах традиционного подхода, нами была измерена кинетика ингибирования связываюиих свойств рецептора при разных концентрациях модифицирующих реагентов. Опыты показали, что при достаточном избытке модифицирующего реагента достигается полное ингибирование лиганд-связываюыих свойств рецептора и этот процесс описывается кинетикой реакции первого порядка (Рис.1). Такие результаты не подтверждают представление о структурной гетерогенности мускаринового рецептора мозга. Кроме того, наблюдаемые кинетические закономерности говорят о том, что для ингибирования рецептора достаточно модифицирования одной функционально важной группы белка. Доступность этой группы в структуре белка модифицирующим реагентам характеризуется бимолекулярной константой скорости процесса и сопоставление последних величин для разных состояний рецептора дает информацию о структурных изменениях белка.

Рис.і.Ингибирование мембранного мускаринового рецептора мозга крыс п-хлормеркурийбензоатом (l-контроль, 2-О.ОЗмМ, 3-о,07мМ, 4-0,15мМ, 5-0,ЗмМ) и зависимость к._навл для ингибирования мембранного (1) и солюбилизированного (2) рецепторов от концен-

3 трации реагента, B_t- специфическое связвание L-[ Н]ХБ.

По нарим данным активный центр мускаринового рецептора формируется с участием -SH, -SS- и СООН-групп. Можно предположить, что первая из них расположена в активном центре, так как связанные с рецептором лиганды защищают эту группу от модифицирующих реагентов. В то же время доступность -SS- и

СООН-групп химическим модификаторам не меняется при образо-

з вании комплекса рецептора с [-[ Н]ХБ. Следовательно, эти

группы расположены вне активного центра и важны для сохранения активной конформации рецепторного белка. Для солюбилизированного рецептора соблюдаются те же закономерности и увеличивается только скорость реакций.

Нари опыты с этиловым ацетимидатом не подтвердили участие Ш„-группы при формировании активного центра мускаринового рецептора. Важно отметить, что в отличие от реагентов, использованных другими авторами для определения аминогрупп, этиловый ацетимидат не дает побочную реакцию с SH-группами, что существенно в связи с наличием этих групп в активном центре рецептора. * Резюме. Лиганд-связываюыие свойства мускаринового рецептора контролируются SH-, -SS- и соон-группами белка, из которых лве последние расположены вне центра связывания лиганда и отвечают за активную конформацию белка. Анализ кинетики химического модифицирования свидетельствует о гомогенности популяции рецепторних участков в препарате мозговых мембран.

2*

1.3. Физико-химические свойства лиганд-связывавнего центра рецептора

В настоящей работе предлагается способ зондирования ак
тивных центров белков, которые специфически связывают катион-
ные лиганды, путем измерения кинетики модифицирования белка
ионом И.ы-диметил-г-фенилазиридиния (I). Скорость процесса
лимитируется стадией размыкания азиридиниевого цикла в актив
ном центре белка с образованием карбониевого иона (II), кото
рый алкилирует доступные для реакции нуклеофильные группы.
Phe-CH - J3H,, Phe— СН⁺- СН„

>: ^{2 г}>

Me Me Me Me

I II

Если при этом ингибируются связывающие или каталитические свойства белка, это можно использовать для измерения кинетики модифииирования. Чувствительность метода зависит при этом от методики определения данного белка, что особенно важно при изучении минорных компонентов биологических систем, к которым относятся и рецепторы клеточных мембран.

В основе метода лежит установленная для сольволиза иона Н,И-диметил-2-фенилазиридиния зависимость скорости реакции от общей основности реакционной среды:

log к » (-6,7+0,8) + (0,011+0,003)В, (1)

которая представляет собой упрощенную форму корреляционного уравнения Коппеля-Пальма:

log k = log к + уУ + рР + ЪВ + еЕ , (2)

где У и Р характеризуют полярность и поляризуемость растворителей, В и Е -параметры общей основности и обиеи кислотности среды. На базе уравнения (1) решается обратная задача определения по скорости разложения азиридиниевого иона параметра В для среды, в которой протекает реакция.

Метод был апробирован в случае холинэстераз, для которых отдельно доказано соблюдение единой изокинетической зависимости реакций азиридиниевого иона в органических растворителях и в активном центре ферментов. Для ацетилхолинэстераз яда кобры,электрического органа электрического угря и мозга крыс, а также для сутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади получили значения В в интервале от 140 до 170. Такие значения В весьма близки Б=156 для воды, а также величинам В для ряда других гидроксильных растворителей. Следовательно, соответствующий участок активного центра холинэстераз открыт для воды.

Ионы М,И-диметил-2-фенилазиридиния ингибируют связывание

лигандов с мускариновым рецептором, что допускает определение параметра В=261 для этого белка. Оказывается, что свойства связывающих центров холинорецептора и холинэстераз значительно различаются. При этом В для рецептора сопоставима с этой константой для амидов и алкиламидов карбоксильных кислот, моделирующих пептидные фрагменты белковой структуры. Одновременно можно высказать предположение об отсутствии сольватационноя воды в этом центре связывания лигандов. Резюме. Разработан и на примере холинэстераз и мускаринового рецептора применен метод "химического зондирования" лиганд-связываюиих центров белков ионом Г1,Н-диметил-2-фенилазири-диния и показано различие в их сольватационных свойствах.

2.1. Кинетический анализ связывания радиолигандов

Кинетику связывания радиоактивных антагонистов с мембранным рецептором измеряли в псеадомономолекулярных условиях, при которых процесс описывается уравнением кинетики первого порядка:

В,.

В + В (1 ns sp

-lc t набл . e )

(3)

где В -обиее связывание радиолиганла с фильтрами в момент

времени t, В -величина неспецифического связывания и В -
ns sp

максимальное значение специфического связывания радиолиганла. Опыты показали, что неспецифическое связывание быстро достигает равновесного состояния и во времени не меняется (Рис.2), что технически упрощает проведение кинетических измерений. Константы ^к_набЛ' а также параметры В и В рассчитали по уравнению (3) нелинейным методом наименьших квадратов.

5 10 Врэмя.мин

Рис.2. Ассоциация L-[ Н]ХБ (2,7 нМ) с мембранным мускариновым рецептором мозга крыс, 0,05 М К-фосфатныя буфер, 25С, 1-обиее связывание, 2-неспецифи-ческое связывание в присутствии 10 мкМ атропинсульфата, концентрация белка 0,04 мг/мл, обьем пробы 1 мл.

Далее мы анализировали зависимости ^к_навл ^от концентрации реагента, а также от условий реакционной среды или концентрации добавляемых в реакционную среду других лигандов. До нащих исследований это не было общепринятым подходом в ре-цепторологии, где в основном ограничивались проведением экспериментов равновесного связывания, предполагая соблюдение одностадийной схемы комплексообразования:

R + А - -- RA , (4)

по которой для количественной характеристики рецептор-лиганд-

ных взаимодействий достаточно определения константы К.

заимодеї

[R] [А]

К - . (5)

^Q [RA]

Резюме Разработан кинетический подход для изучения механизма связывания радиолигандов с мускариноэым рецептором.

2.2. Изомеризация комплекса антагониста с ыускариновым рецептором.

Согласно схеме (4) псевдомономолекулярная константа скорости комплексообразования должна линейно зависеть от концентрации лиганда:

^кнабл = ^k-! ^{+ к}1^{[А] (6}>

На(ііи опыты, однако, выявили более сложный характер этой зависимости (Рис.3), что свидетельствует о неадекватности

одностадийной равновесной схемы связывания мускариновых ан-

тагонистов с рецептором. Связывание L-f HJMeCA и ь-[ н]МеХБ с

мембранным рецептором мозга (Рис.За,б) описывается в изученном интервале концентрации лигандов гиперболической зависимостью к_ от [А]. В случае L-[³H]XB (Рис.Зв) и [³Н]МеПБ при увеличении концентрации лиганда наблюдается дополнительное ускорение комплексообразования с достижением нового предельного значения к _ . Последний факт свидетельствует о

кооперативной регуляции этого процесса. Аналогичная зависи-

3 мость характеризует также связывание L-[ Н]ХБ с рецептором

сердца, в случае же рецептора тонкой кищки кооперативная регуляция скорости процесса отсутствует (Рис.Зв). Таким образом, уже качественное сопоставление результатов для рецепторов разных тканей выявляет определенные различия, установление которых методами равновесного анализа невозможно.

10 нМ

2 4 6 8 [Н³Н]МеСд]

2 4 6 6 10 [Ь-[Зн]МеХБІ,нМ

Ю-Ф-О-ф-3

[ь[³н]хб].нм

5 10 [1г[³Н]ХБ].нМ

Рис.3. Зависимость к „ от
„ , набл

[ Н]МеХБ (Б) и L-[ Н]ХБ (В) ДЛЯ

концентрации L-[ Н]МеСА (A), L-мембранных препаратов муска-

ринового рецептора мозга(ОЬ сердца(0 ) и тонкой кишки(fj ) ,

О 3

25 С, и результаты титрования этих рецепторов с L-[ Н]ХБ (Г).

Гиперболическая зависимость к от концентрации лиганда соответствует последовательной реакционной схеме, учитывающей образование по меньшей мере двух рецептор-лигандных комплексов:

(7)

^КА ^ki ^-^- RA -^-^- (RA)

^k-i

из которых в качестве продукта реакции при выводе уравнения скорости процесса учитывается только последний. Иными словами, только комплекс (RA) определяется фильтрационным методом и RA смывается с фильтра. Конечно,обратимой реакиией следует признать также образование комплекса (RA), так как радиоли-ганд вытесняется из этого комплекса избытком других лигандов.

3*

С учетом этого получим для реакции образования рецептор-

лигандного комплекса следующее уравнение:

к, [А]

^кнабл ⁼ — ^{+ к}-1 ' '⁸>

^на0л К_А + [А] ¹

по которому можно рассчитать параметры к _ , к, и к ,. В

НЭОЛ 1 ~х

случае изученных соединений, однако, значения к _ были

набл

значительно больше к*» что не допускало в большинстве случаев определения последней величины по данным кинетики.

Смешение равновесного состояния стадии изомеризации рецептор-лигандного комплекса невозможно при добавлении избытка реагента. Последний факт необходимо учесть наряду со скоростью диссоциации комплекса при подборе радиолигандов для количественного определения рецептора методами, в которых для отделения связанного лиганда от его избытка в растворе пользуются методом фильтрации проб или центрифугированием. Резюме. Доказана двухстадийная реакционная схема для связывания эффективных антагонистов с мускариновым рецептором, включаючая медленную стадию изомеризации рецептор-лигандного комплекса и выявлена кинетическая характеристика тканевой специфичности для этого рецептора.

2.3. Кооперативное связывание антагониста с рецептором

Сигмоядальные части зависимостей к _ от [А] в реак-
з з наол

ииях L-[ Н]ХБ и [ Н]МеПБ с мембранными рецепторами мозга и

сердца говорят о кооперативной регуляции скорости этого процесса в результате связывания с рецептором дополнительных молекул антагониста. Титрование рецептора теми же радиолиганда-ми, однако, показывает, что стехиометрия определяемого на стекло-волокнистых фильтрах комплекса при высоких концентрациях лиганда не меняется (Рис.зг). Это означает, что кооперативно регулируется только скорость перехода комплекса в медленно диссоциирующую форму. Следовательно, независимо от конкретного механизма кооперативного эффекта, в мембранных препаратах мускаринового рецептора мозга и сердца можно различать два типа центров, взаимодействуюиих с антагонистами. Эти центры различаются по эффективности связывания лиганда, а также тем, что в регуляторних участках не происходит образования медленно диссоциирующегося комплекса (RA).

Количественный анализ кооперативного эффекта проводили по следующей кинетической модели:

^KA ^ki

^,.. . -". RA * - (RA)

K_x ^ 1 (9)

<*^KA V (*^kx _RA ^л -, RA,,. . J ^X - A (RA)

-x

которую можно рассматривать как комбинацию двухстадипноя схеми и кооперативной модели Хилла с учетом всех связанных с последней теоретических ограничений. Также предполагается, что кроме изомеризационной стадии все остальные равновесия в системе достигаются быстро, и соответствующие комплексы,включая п молекул антагониста а комплексе A (RA), не поддаются экспериментальному определению методом фильтрации.

В соответствии со схемой (9) выражение для к - записывается при с^=1 следующим образом:

к, [А] К ^п V^Al" СА]

к = __± ^х +. ^х ₊ к'. (10)

набл ^ _{+ [д]} К_хП_+[А]п К_Х^П+[А]^П К_Д+[А]

Первое слагаемое этого уравнения описывает начальную гиперболическую часть зависимости к,,.,, от [А], где [А]<К , второе

наол х

слагаемое соответствует сигмойдальной части этой зависимости.

Константа к' характеризует диссоциацию комплекса и малая ско-

3 3 рость этого процесса в случае !-[ Н]ХБ и [ Н]МеПБ позволяет

пренебречь свободным членом уравнения (10) при обработке данных. В расчетах ограничивались определением цельночисленных значений коэффициента Хилла.

Рецепторы мозга, сердца и тонкой кивки характеризуются близкими значениями констант К и к. (Табл.1), что, очевидно, свидетельствует об одинаковой природе лиганд-связываюиих центров этих белков и протекающих в них процессов конформаци-онной изомеризации. Отсутствие кооперативного эффекта в случае рецептора тонкой кишки скорее всего связано отличием его надмолекулярной структуры в биомембране.

В соответствии с моделью Хилла п не может превышать числа лиганд-связывающих центров кооперативно функционирующей системы. Поэтому трудно присвоить конкретное содержание высоким значениям n. Тем не менее удовлетворительное соответствие теоретической кривой и экспериментальных данных по связы-

3 3 ванию L-[ Н]ХБ и [ Н]МеПБ с рецепторами мозга и сердца достигается при значениях п>6-7. Вместе с первым слагаемым в уравнении скорости (10) это указывает на возможность кооператив-

ного функционирования до восьми лиганд-связывающих центров. Резюме. Обнаружена кооперативная регуляция скорости связывания эффективных антагонистов с мускариновым рецептором мозга и сердца, что возможно при существовании в структуре мембраны комплексов из нескольких взаимозависимых центров. В мембранах тонкой кирки кооперативная регуляция скорости комплексо-образования не обнаруживается.

Таблица 1
Кинетические параметры взаимодействия радиоактивных антаго-
истов с мембранным мускариновым рецептором мозга крысы, 25С,
рН 7,40, 0,05М К-фосфатный буфер.
__ _ _^___,^__

І.Ь-МеСА 9,7±2,1 2. ИеПБ 5,5±3,1 З.Ь-ХБ 1,3±0,5 4.І.-МЄХБ 5,0+2,3

М с нМ с с_2 нМ

11,9±0,8 - - - 9 ±4 0,08±0,01

1,4±0,3 21+8 3,6+0,4 7 6,7±0,8 0,4±0,1

1,2±0,3 4,4±1 1,8іО,2 6-7 1,3±0,4 ~0,002

4,6+0,5 - - - 14 ±4 0,13±0,04

2.4. Влияние температуры на кооперативное взаимодействие з [ Н]МеПБ с мускариновым рецептором мозга

Варьирование температуры приводит к изменению кинетичес-

3 кого механизма взаимодействия [ Н]МеПБ с мембранным рецептором мозга, что отражается в разной форме зависимости к„_авл от концентрации этого антагониста (Рис.4). Полученные при оси 42С кривые могут быть при этом рассмотрены как предельные случаи более сложной зависимости, наблюдаемой при 25С. Формально этим случаям соответствуют отдельные слагаемые уравнения (10), т.е. гиперболическая функция в условиях [А]<К при 42С, и зависимость Хилла в условиях к.->0 при О С. При низкой температуре скорость изомеризационноя стадии рецептор--лигандного комплекса, не поддерживаемой кооперативным эффектом, крайне малая, что говорит о резкой зависимости константы к, от температуры. Такой качественный вывод согласуется с приближенной оценкой активационной энергии Е =95 кДж/моль для изомеризационноя стадии на основе кинетических данных при

температурах 25С и 42С. В то же время константа скорости

3 диссоциации комплекса [ Н]НеПБ и рецептора мозга в интервале

температур от 0С до 42С хорошо описывается уравнением

Аррениуса и допускает расчет активационной энергии процесса

58+20 кДж/моль. Высокие значения активационной энергии сви-

[[Эн]МеПБ],нМ

[[ЗН]МеПБ].нМ

0 20 І0 [[ЗН]МеПБ].нМ

Рис.4. Кинетика ассоциации

о [ Н]МеПБ с мембранным муска-

0С(Л),

риновым рецептором мозга крысы

при температурах (Б) и 42С(В).

детельствуют о конформационных переходах рецепторного белка в изомеризационных процессах рецептор-лигандного комплекса.В то же время константа равновесия изомеризационного процесса,рассчитанная как отношение k,/k ,, мало зависит от температуры. Резюме. Изомеризационные процессы рецептор-лигандного комплекса характеризуются высокими значениями активационной энергии, что свидетельствует о значительных конформационных изменениях рецепторного белка.

2.5. Влияние концентрации электролита на кооперативное

з взаимодействие L-[ В]ХБ с ыусхариновым рецептором

Форма зависимости k _я от [А] меняется при добавлении соли в реакционную среду (Рис.5). При этом наблюдается сдвиг кооперативной части зависимости в область более высоких концентраций лиганда, что свидетельствует об уменьшении эффективности связывания молекул антагониста с обоими типами рецепторних участков. Последний факт хороро согласуется с представлением о первичном солевом эффекте при сорбции катионного реагента в т.н. анионном центре связывания, который предположительно является компонентом активной

ц*

Рис.5. Влияние КС1 ( - 0,1 М; -0,2 М; Q -0,5 М; -0,8 М; Д-2,0 М; ф - без добавки соли) на кинетику связывания L-[³H]XB с мембранным мускариновым рецептором мозга крысы, 25С, рН 7,40, О,05М К-фосфатный буфер. О 10 20 [1-[ЗН]ХБ].нМ

поверхности холинорецепторов.

В отличие от сорбционных стадий, скорость изомеризации рецептор-лигандных комплексов не зависит от свойств реакционной среды. Следовательно, изомеризаиионные процессы протекают в изолированном от эффектов внешней среды центре связывания лиганда. Из тех же результатов следует,что умеренное изменение концентрации соли не вызывает в белково-липидной структуре мембран мозга таких изменений, которые могли бы повлиять на динамику конформационных переходов рецепторних комплексов в мембранной структуре.

Резюме. Изомеризация рецептор-лигандного комплекса - внутримолекулярный процесс конформационной перестройки рецепторного белка и ее скорость не зависит от концентрации добавленного в реакционную среду электролита.

2.6. Двухстадияная изомеризация комплекса антагониста и рецептора

В литературе встречаются противоречивые данные о кинетике диссоциации комплекса антагонистов с мускариновым рецептором. В ряде случаев этот процесс подчиняется кинетическим закономерностям реакции первого порядка (Yamamura et al,1974; Hosey et al, 1981; Luthin et al, 1984), в то время как в других работах кинетические данные описывают уравнением скорости,которое включает два экспоненциальных члена (Aguilar et al, 1982,-Galper et al, 1982; Klein, 1980).

Проведенное нами исследование кинетики диссоциации комп-

лексов Іі-[ Н]ХБ и L-[ Н]МеСА с мускариновым рецептором мозга

показало, что наблюдаемые кинетические закономерности этого

процесса зависят от длительности предварительной инкубации

антагониста с рецептором до начала измерения кинетики диссоциации (Рис.6). При коротких временах предварительной инкубации кинетика диссоциации описываетсп уравнением с двумя экспоненциальными членами,

""«И*

В,.

(11]

В + п

В ,е spl

что соответствует овразованию двух типов комплексов рецептора и антагониста,(RA) и ((RA)). Эти комплекси различаются по скорости диссоциации, но они ова определяются фильтрационным методом. Доля комплекса, диссоциирующего с большей скоростью, уменьшается во времени по мере его перехода в медленно диссоциирующую форму и через определенное время процесс диссоциации описывается кинетикой реакции первого порядка.

Рис.Є. Кинетика диссоциации

комплекса мускаринового рецеп-

3 тора и L-( Н]ХЕ d зависимости

от длительности предварительной

инкувации реакционной смеси. 1-

4 МИН, 2-12 МИН, 3-25 МИН, 4-

62 МИН И 7-1440 МИН.

500 Время,мин

Следовательно, в случае L-[ Н]ХБ равновесие ^- ((RA))

(12)

(RA) ===

сдвинуто в сторону более медленно диссоциирующего комплекса ((RA)). Аналогичные закономерности, объясняющие возможности получения кинетических кривых разной формы для диссоциации

комплекса радиолиганда и рецептора,

были получены также в

случае L-[ Н]МеСА. Измерение кинетики диссоциации комплекса

путем вытеснения из него радиолиганда избытком нерадиоактив-

3 ного антагониста не позволяет случае L-[ Н]ХБ исследовать

-5 -1 1,3-10 с соответствуют

к =1,0-10 ⁴с ¹ У

непосредственно вторую изомеризационную стадию, так как а этом случае молекулы лиганда связываются также в регуляторних центрах рецептора. Поэтому вычисляемые для этого лиганда

константы k =1,0-10 'с * и к

-V

превращению комплексов A (RA) и A ((RA))

в которых п но

лекул лиганда А связано с регуляторними центрами рецептора.

Для L-[ HJMeCA можно определить константы скорости второй

-4 -1 —4 -1

изомеризационной стадии, к =8'10 с и к_ =3,5-10 с.

Резюме. Установлен факт двухстадияной изомеризации определяемого методом фильтрации комплекса антагониста и мускаринового рецептора.

2.7. Кажущаяся необратимость взаимодействия ХБ с ыускариновыы рецептором мозга

Первым коммерчески доступным и до сих пор наиболее широко применяемым радиолигандом для определения мускаринового рецептора является ХБ и особенно его L-энантиомер. С начала семидесятых годов для этого лиганда в литературе опубликовано Сольное количество значений К., вычисленных по уравнению:

[R] [А]

[RA] = . (13)

K_d+ [А]

Анализ этих данных, однако, выявляет разброс результатов, который в отдельных случаях превышает несколько порядков величины константы К., несмотря на одинаковый источник рецептора и идентичные условия эксперимента. При этом обнаруживается тенденция изменения величин pK_d в зависимости от года опубликования результатов (Рис.7). Аналогичная тенденция проявляется при сопоставлении рК. и величин удельной радиоактивности использованного в опытах L-[ Н]ХБ.

Такие факты находят обьяснение в рамках представления, 3 согласно которому для L-[ Н]ХБ в координатах уравнения (13)

получают не кривые равновесного связывания радиолиганда, а

кривые титрования рецептора. Форма последних определяется

концентрацией рецептора в пробе, которая в свою очередь

уменьшается исследователями по мере увеличения удельной

радиоактивности доступного им лиганда.

Рис.7. Сопоставление приведенных в литературе К. для взаимодействия L-[ Н]ХБ с мембранным рецептором мозга крыс (рН 7,4, 0,05 М К-фосфат-ный буфер, 25С) и года их опубликования.

Можно добавить, что в некоторых работах для Ь-[Н]ХБ прямо показана зависимость кажущихся величин К. от концентрации рецептора (HecUund et al,1979,-Ludford,1980;Nilvebrant, 1986). Однако этим фактам не было уделено должного внимания.

Кажущаяся необратимость взаимодействия ХБ с мускариновым рецептором связано, во-первых, исключительно высокой эффективности связывания лиганда, так как наблюдаемая константа

диссоциации К . определяется комбинацией констант К,, К,, и
a All

К.„. В случае L-ХБ оба изомеризационные равновесия сдвинуты в сторону продукта и вычисляемая по данным кинетики К.<2пМ.

Во-вторых отметим, что истинное равновесие многостадийного процесса комплексоовразования достигается в случае ХБ медленно и необходимое для этого время инкубации значительно больше одного часа, что часто используется в опытах с этим лигандом.

Таким образом, по кинетическим причинам одностадийная реакционная схема не обеспечивает адекватное описание взаимодействия мускаринового рецептора с L-ХБ, хотя именно этим радиолигандом получено подавляющее большинство опубликованных в литературе результатов радиолигандного анализа. Естественно, что аналогичные кинетические аспекты необходимо учесть и в случае других радиолигандов, используемых для определения мускаринового рецептора.

На основе полученных нами данных более подходящим

антагонистом для применения в качестве лиганда-"репортера"

з является L-[ HJMeCA, который относительно быстро связывается

с рецептором и имеет в изученном ряду радиолигандов наименьшую эффективность комплексообразования (Табл.1), что важно для проведения опытов при концентрациях радиолиганда ниже К . Резюме. По кинетическим причинам L-ХБ не является удобным радиолигандом мускаринового рецептора в опытах, требующие

достижения равновесного состояния системы, а в качестве

з лиганда-"репортера" рекомендуется L-[ Н]МеСА.

3.1. Измерение кинетики ассоциации нерадиоактивного лиганда с мускариновым рецептором

Возможность измерения кинетики взаимодействия нерадиоактивных лигандов с мускариновым рецептором с помощью меченного тритием антагониста в качестве лиганда-"репортера" принципиально расширяет возможности кинетического подхода при ана-

5*

лизе механизма рецептор-лигандных взаимодействий. Предпосылкой применимости этого метода является установление механизма ассоциации "репортерного" лиганда с рецептором. Выбирая на основе полученных в предыдущей части работы данных наиболее подходящую структуру "репортерного" лиганда и оптимальные условия эксперимента, можно ограничиться простейшей кинетической моделью для этого лиганда, учитывающей только две стадии процесса комплексообразования.

В простейшем случае связывание нерадиоактивного лиганда L с рецептором описывается как быстрое равновесие по сравнению с диссоциацией и ассоциацией радиоактивного антагониста А:

^КА ^ki + А ~~ RA -~ (RA)

^k-i

(14)

+ L ~ Rf,

В условиях [R]<<[L] и [R]<<[A] связывание радиолиганда А с

рецептором описывается уравнением скорости реакции первого

порядка и зависимость к_навл от концентрации обоих лигандов

задается выражением:

к [А]

к = і + к . (15)

^НабЛ (1 + [L]/K_L) К_А + [А] ¹

Как видно, при реализации такого механизма рецептор-лигандных взаимодействия наблюдается уменьшение k _fi по мере увеличения концентрации лиганда L, и константу диссоциации К_г можно рассчитать из этой же зависимости.

В более сложном случае взаимодействие L с рецептором может сопровождаться медленной изомеризацией комплекса RL в (RL):

^КА ^ki + А ^ " ^ RA -^ (RA)

^k-i
R . (16)

К к'

+ L ^L - RL * ~- (RL)

^K -І

В условиях избытка концентраций обоих лигандов по сравнению с
концентрацией рецептора, изменение во времени концентрации
комплексов (RA) и (RL) описывается двумя экспонентами:
^C(RA) ⁼ СцЄХРІС^) * C₁₂exp(C₂t) + С₁₀ , (17)

^C(RL) ⁼ С₂₁ехр{С^) + C₂₂exp(C₂t) + С₂₀ , (18)

^cl⁼

-a + Va* -it' -d - V^{d2 -4f}

+ k_. + k'

k^A] k'^L]

K_A + [A] K_L + [L]

k,[A] k¹ [L]

f = і k'_ + і к + к к'.

K_A + [A] ^a K_L + [L]

Если к. и k'_. - малые величины по сравнению с наблюдаемой константой скорости ассоциации "репортерного" лиганда с рецептором, получим при постоянной концентрации радиолиганда

гиперболическую засисимость к„___ от концентрации нерадиоак-

наол

тивного лиганда L:

k'^L]

^кнабл ^{= + const} ' ⁽¹⁹⁾

^набл K_r + [L]

которое допускает расчет параметров К_т и к'.. При этом наблю-даемая константа скорости увеличивается в присутствии добавленного нерадиоактивного лиганда, открывая возможность выбора между двумя кинетическими моделями (14) и (16). Для проверки нами исследовалось взаимодействие радиоактивного и нерадиоактивного МеХБ с рецептором мозга, используя в последнем случае

3 "репортерныя" лиганд L-[ Н]МеСА. Полученные обоими методами

результаты хорошо согласуются (см. Табл.1 и 2). Резюме. Кинетические закономерности связывания радиолиганда с рецептором в присутствии нерадиоактивного лиганда позволяют выбрать между двумя моделями рецептор-лигандного взаимодействия и определить кинетические параметры для нерадиоактивного лиганда.

3.2. Два типа ыускариновых антагонистов

з Измерение кинетики связывания L-[ H]MeCA с мускарино-

вым рецептором мозга в присутствии нерадиоактивных антагонистов показало, что эфиры бензиловой (Рис.8а) и троповой кислот ускоряют этот процесс. Следовательно, эти соединения взаимодействуют с рецептором по кинетической модели (16), индуцируя в активном центре рецептора конформационныя переход, который приводит к образованию медленно диссоциирующей формы комплекса (RL). Ряд других антагонистов образует, однако, с рецептором быстро диссоциирующие комплексы и в соответствии со схемой (14) обратимо ингибируют процесс ассоциации L-[ Н]МеСА с рецептором (Рис.86) . Кнетические параметры, измеренные для ряда нерадиоактивных антагонистов приведены в Табл.2.

Таблица 2

Кинетические параметры взаимодействия антагонистов с муска-риновым рецептором мозга крыс, измеренные применением L-[ Н]МеСА в качестве радиолиганда-"репортера", 25С, рН7,40, 0,05М К-фосфатный буфер.

N Антагонист п/п

А нМ

^{10 k}-i ^Kd

Ph 4.HOCC(O)0fV^|

6,8+2,3 5,6+0,9 14 ±4 0,13+0,03

N^Me

5.HOCC(O)0C H N(CH ) 38 ±13 3,4±0,6 68 ±10 9,6 ±1,7 Ph

?^h +

6.H0CC(0)0C„H.N (CH.)„ 9,2±2,2 3,3+0,5 50 ± 9 2,3 ±0,2

6,3±2,0 6,0±1,0 10 ± 1 0,20±0,03 3,0+1,0 6,1±1,0 21 ± 3 0,11±0,02

Ph ² * ^{3 3}

0)0-/"

7.H0CH₂CHC(

0-/ N⁺Me,

Ph 8.H0CH₂CHC(0)

0)0-/"

0 3,7±1,2 3,0±0,5 30 ± 7 0,14±0,03

Ph 9.H0CH CHC(

10.H0CC(0)0C„H.N (CH„). 8,5±0,8 (K_T)

А ,т і 4 Jo Li

СУС₅Н₉ ll.PhC(0)0C-H„N⁺(CH,)_o 3760±540 (K_r)

% О J Li

12.PhCH₂C(O)0C₂H₄N⁺(CH₃)₃ 4530±380 (Kj.)

[МеХБ].нМ

10 '0 1 2 3

[Бензоилхолин]. мкМ

Рис.8. Влияние МеХБ (А) и бензоилхолина (Б) на кинетику

з ассоциации L-[ Н]МеСА (0,8 нМ) с мембранным рецептором мозга

крыс при 25С, рН 7,40, 0,05 М К-фОСфатный буфер.

Таким образом, по данным кинетики комплексоовразования мускариновые антагонисты можно разделить на две группы в соответствии с рассмотренными вире кинетическими моделями ре-цептор-лигандного взаимодействия. Следовательно, при анализе взаимосвязи активности и структуры, все мускариновые антагонисты не могут быть рассмотрены в рамках единой реакционной серии. Это, однако, было неизбежным до наших исследований, когда константы К, были единственными параметрами, предоставляющими возможность анализа специфичности рецептора.

Важным выводом из полученных результатов является также тот факт,что наличие медленной изомеризационной стадии рецептор- лигандного комплекса не есть решающий фактор, отличающий мускариновые антагонисты от агонистов. Как видно,среди эффективных антагонистов встречаются также лиганды, взаимодействие которых с рецептором описывается как быстрое равновесие. Резюме. Классические мускариновые антагонисты разделяются на две группы на оснований наличия или отсутствия медленной стадии изомеризация рецептор-лигандного комплекса.

3.3. Кинетика вытеснения лиганда из комплекса с рецептором

Процесс вытеснения из рецепторного комплекса лиганда L избытком лиганда А условно можно разделить на два этапа: освобождение рецептора при диссоциации L из комплекса и связывание А с освободившимся рецептором:

к¹
(RL) =i-> Н + L , (20)

1с
R + А ^НаЛ)(ИА) . (21)

При условии ^к'_1^<к_набл скорость превращения (RL) в (RA) определяется стадией диссоциации комплекса (RL). Это позволяет определить одним радиоактивным лигандом А константу к', для нерадиоактивных лигандов L. Использование при этом достаточно продолжительных времен предварительной инкубации рецептора с нерадиоактивным лигандом L позволяет селективно характеризовать наиболее медленную стадию многостадийного изомеризационного процесса. Эта методика была проверена сопоставлением данных вытеснения [ н]МеПЕ из рецепторного комплекса избытком ХБ и соответствующего "зеркального" опыта,

заключавшегося в измерений кинетики вытеснения МеПБ из рецеп-

з торного комплекса с помоию L-( Н]ХБ. При этом получали к-,,_„^ш

-4 -1 -4 -1 -ДИСС

(6,7+0,8)10 с и ^к_ДИсс⁼ <б,3±О,б)10 с , соответст-

венно.

Предлогаемой методикой измеряли константы скорости диссоциации комплексов рецептора мозга с двумя рядами N-алкил-замеценных бензилових эфиров III и IV (Таблица 3).

Ph Ph

^{,,.,^2,}

носе (о) -fy> носе (о) ос₂н₄м* (сн₃) ₂ (сн₂) _пн

Ph [ (J Ph

III IV

Таблица З

Константы скорости диссоциации антагонистов типа III и IV из комплекса с мускариновым рецептором мозга крысы, 25С, рН 7,40, 0,05 М К-фосфатный буфер.

^1о3кдисс'^с_1 ряд III ^дисс ряд IV

1. 1,4+0,4

2. 2,4+0,5

3. 3,0 +0,4

4. 2,9+0,4

5. 3,0+0,2

6 3,9+0,3
1 2,7+0,2

8 3,9+0,3

9 3,6+0,3
10 4,1 +0,5 2,9 +0,2

Из этих результатов видно, что скорость диссоциации

комплекса мало зависит от длины н-алкильного заместителя у

атома азота в спиртовой части изученных бензилових эфиров.

Кроме того, эти зчения 1с практически не зависят от

дисс

строения углеводородного скелета спиртовой части, отделяющей атом азота от сложноэфирнои группы в молекуле антагониста. С другой стороны, однако, в случае аналогичных бензилатов с третичным атомом азота в спиртовой части обнаруживается значительное уменьшение к _ по мере осложнения структуры спиртовой части при переходе от линейной полиметиленовой цепочки к эпициклическим структурам.

Резюме. Предлагается способ измерения кинетики диссоциации комплекса мускаринового рецептора и нерадиоактивногр лиганда с применением радиоактивного лиганда-"репортера" и показано, что кватернаризация атома азота в спиртовой части бензилових антагонистов приводит к потере чувствительности рецептора относительно к структурным особенностям этих лигандов.

З .4. Неконкурентная характер взаимодействия иускариновнх

агонистов и антагонистов с рецептором

В присутствии мускариновых агонистов скорость связывания з [ Н]МеПБ с рецепторами мозга и тонкой кирки уменьшается, что

согласуется с моделью быстрого равновесного связывания аго-ниста с рецептором. Однако, влияние агониста на зависимость к _ от концентрации антагониста, а также зависимость скорости связывания антагониста при разных концентрациях агониста, не описываются закономерностями, которые следовало вы ожидать при соблюдении конкурентноя схемы рецептор-лиганлного взаимодействия. Так, например, зависимость к_наа_ от концентрации карбамоилхолина не описывается гиперболической функцией и отличается от нее более плоской формой. Важно добавить, что аналогичная плоская форма характеризует также кривые вытеснения агонистами радиоактивных антагонистов в равновесных условиях связывания лигандов. Последний факт многократно обсуждался в литературе (Birdsall et al,1980; Aronstam et al,l979) и использовался как довод в пользу гетерогенности центров связывания мускариновых агонистов.

Для дальнейшего понимания механизма взаимозависимого комплексообразования агонистов и антагонистов с рецептором

нами исследовалось влияние карбамоилхолина и оксотреморина на

з кинетику связывания [ Н]ИеПБ с рецептором тонкой кирки

(Таблица 4). В случае этого рецептора отсутствует эффект

з кооперативной регуляции скорости связывания [ Н]МеПБ, что

упрощает анализ результатов.

J L

О Ю 20 [[зн]МеПБ].нМ

Рис.9.Влияние карбамоилхолина (L) на кинетику ассоциации з С Н]МеПБ с мембранным мускариновым рецептором тонкой кирки

крысы, 25С, рН7,4, 0.05М К-фосфатныи буфер.

Таблица 4

Влияние карбамоилхолина и оксотреморина на кинетику связыва-

з ния [ Н]МеПБ с мембранным рецептором тонкой кирки крысы,

25С, рН 7,40, 0,05 М К-фоСфатный буфер.

В присутствии агониста скорость изомеризация комплекса рецептора с антагонистом уменьшается (Рис.9). В то же время агонисты в пределах точности эксперимента не влияют на эффективность связывания антагониста с рецептором, характеризуемой константой К. (Табл.4). Формально такая ситуация соответствует неконкурентному механизму ингибирования агонистом L связывания с рецептором антагониста А, что возможно при одновременном взаимодействии этих реагентов с рецептором:

^КА ^ki

R -~ RA =-=> (RA)

_]

k_l «k_l ⁽²²⁾

*^КА I f>^ki I

RL_- *-^r.RA SMRA)

В этой схеме LRA - тройной комплекс антагониста, рецептора и агониста, (RA) и L(RA) обозначают определяемые методом фильтрации комплексы радиолиганда с рецептором. В условиях быстрого равновесия между R, RL, RA и LRA, а также пренебрегая ввиду малой скорости процессами "деизомеризации" комплексов (RA) и L(RA), для наблюдаемой константы скорости связывания радиолиганда получим следующее выражение:

^ki<^KL ⁺ ~ I")

^кнабл <²³>

К_т(1+ —) + (__. + *-)[!.]

[А] <* [А]

В случае рецептора тонкой кирки для изученных агонистов з и [ Н]МеПБ «* =1, так как наблюдаемое значение X, от концентрации агониста не зависит. Одновременно Л=0, т.е. тройной комплекс с экспериментально определяемой скоростью не изо-меризуется. При этом получаются для карбамоилхолина K*6il мкМ и для оксотреморина К_т=80і14 нМ. Несколько иная ситуация характеризует рецептор мозга, при одновременном взаимодейст-вии которого с карбамоилхолином и [ ЩМеПБ имеем /ї=0,3±0,1 и К,=11±4 мкМ. Как было показано раньре, эти рецепторы проявляют также разные кооперативные свойства при связывании антагонистов, что скорее всего связано с их разной надмолекулярной структурой.

Таким образом, мускариновые агонисты и антагонисты образуют тройные комплексы с рецептором, не влияя на эффективность быстрого равновесного связывания второго лиганда с белком. Это возможно при наличии на рецепторе двух типов центров связывания, различающихся по специфичности к лигандам и по функциональной роли. В то же время проявляется взаимозависимость протекающих в этих центрах процессов. С одной стороны, связывание агонистов с рецептором уменьшает скорость изомеризации комплекса рецептора с антагонистом. С другой стороны, важнейшим физиологическим ответом связывания антагониста с рецептором является ингибирование передаваемого агонистом сигнала в нервной клетке. В свете полученных результатов можно высказать гипотезу, что это происходит не в результате простой конкуренции этих лигандов. Предлагаемая модель позволяет также уточнить понятие частичного агониста, который, повилимому, является лигандом, обладающим одинаковым или близким сродством к обоим типам связывающих центров рецептора.

В более общем плане следует отметить, что реакционная схема (22) также отражает гетерогенность связывающих центров для мускариновых антагонистов, которая, однако, возникает в результате многостадийного механизма связывания антагониста, используемого в качестве радиоактивного "репортерного" лиганда. Эти осложнения удалось бы избегать при применении радиоактивных агонистов для непосредственного изучения механизма их взаимодействия с мускариновым рецептором. Однако, посредством радиоактивных агонистов удается определить только часть рецепторних участков, которая согласно общепринятой интерпретации соответствует доле васокоафинных центров связывания агониста. С другой стороны, также известно, что резуль-

таты определения рецептора радиоактивными агонистами в значительной степени зависят от условии, при которых происходит отделение связанного с рецептором лиганда от его избытка в реакционной среде. Это можно объяснить выстрой диссоциацией этих лигандов из комплекса с рецептором. В последнем случае агонисты не могут быть применены в качестве радиолигандов для количественного определения мускаринового рецептора. Резюме. Агонисты неконкурентно ингибируют связывание антагонистов с мускариновым рецептором, свидетельствуя об образовании в этом процессе тройного комплекса: агонист-рецептор-антагонист.

Мускариновый рецептор структурно интегрирован с био-мембраной как трансмембранный белок (Kubo et al, 1986), что позволяет ожидать также интегрированное функциональных свойств этого белка и окружающих его белкого-липидных комплексов. Для оценки влияния мембранного окружения на рецептор нами сопоставлялись данные для мембранного и солюбилизирован-ного препаратов рецептора мозга, в частности, стабильность белка, доступность функциональных групп химическим модификаторам и кинетические закономерности связывания лиганда. С другой стороны, исследовалось воздействие рецепторного белка на состояние сиомембраны.

4.1. Биоыембрана и стабильность рецептора Механизмы спонтанной инактивации солюбилизированного и мембранного рецепторов существенно различаются, о чем свидетельствуют разные температурные зависимости констант скорости этого процесса (Рис.10). В первом случае высокое значение кажущейся активационнои энергии Е,=15&±7 кДж/моль хорошо согласуется с аналогичными величинами для денатурации многих растворимых в воде белков (Joly,1965), стабильность которых определяется взаимодействиями между отдельными частями молекулы белка. Значение Е,=57±8 кДж/моль для мембранного рецептора значительно ниже Е. для растворимых белков, но

сравнимо с параметрами аналолгичного содержания в интервале значений от 20 до 70 кДж/моль, вычисленных из температурной зависимости разных физико-химических свойств биологических и искусственных липидных структур (Boldyrev, 1981; Deveaux, 1985; De Kruijff et al, 1985).

Рис 10. Инактивация мемеранного (і) и солюбилизированного дигитоштом (2) мускаринового рецептора мозга крцс.

3.0 3.5 І.О 10³-Т¹

Из Рис. 10 видно, что линепная зависимость In k от l/T для мембранного рецептора охватывает данные при -15С. Следовательно, механизм инактивации мембранного рецептора не меняется при замораживании мембранных фрагментов. В то же время при замораживании солюбилизированного рецептора терпетсп значительная часть лиганя-свпзываюыеП активности препарата. Эти данные можно понять, если предполагать, что стабильность мембранного рецептора контролируется состоянием его липидного окружения, которое, в свою очередь, зависит от температури.

Обработка фрагментов биомембран фосфолипазами инактивир-ует связанный с ними мускариновыя рецептор, что объясняется нарушением структуры липиднои фази минорным количеством лизо-липидов (Aronstam et al,1977; Parthasarathy et al,1984). Неожиданным результатом, однако, была найденная нами инактивация фосфолипазоя А солюбилизированного дигитонином рецептора. Этот факт свидетельствует о важной роли одной или нескольких молекул лецитина для сохранения связываюиих свойств рецептора в мицелле детергента.

Резюме. Стабильность мембранного мускаринового рецептора определяется состоянием окружающей белок липиднои фазы и для сохранения активности солюбилизированного рецептора требуется взаимодействие белка с молекулами лецитина.

4.2. Биоыембрана и кооперативные свойства рецептора

Кинетика комплексообразованип антагонистов с мембранным мускариновым рецептором мозга и сердца говорит о кооперативном взаимодействии разных центров связывания лиганда. С целью выявления роли биомембраны при такой функциональной интегра-

ции лиганд-связываюцих центров рецепторного комплекса, нами

з исследовалась кинетика связывания L-[ Н]ХБ со солюбилизиро-

ванным рецептором мозга. Полученные результаты показывают,

что разрушение мембранного окружения рецептора препятствует

кооперативной регуляции скорости изомеризационной стадии

рецептор-лигандного комплекса так как зависимость ^к_навл ^от

концентрации L-[ Н]ХБ описывается в случае солюбилизирован-

ного рецептора мозга гиперболой в соответствии с двухстадий-

ной кинетической моделью комплексообразования (Рис.11). Таким

образом, биомембрана играет решающую роль при реализации

кооперативного взаимодействия лиганд-связываюших центров

рецептора, что может быть объяснено агрегацией нескольких

рецепторних субьединиц в мембранном комплексе.

О 10 [1_-3[Н]ХБ].нМ

Рис.11. Кинетика ассоциации L-з [ Н]ХБ со солюбилизированным

мускариновым рецептором мозга

крыс,25С, 0,05 М К-фосфатный

буфер, рН 7,40, К_д=3,8+0,8 НМ,

к.=(2,3+0,2)10~³С¹.

Разрушение мембранного окружения рецептора сопровождается кроме качественных изменений в механизме связывания L-[ Н]ХБ также изменением подвижности белковой структуры рецептора, так как скорость изомеризационной стадии рецептор-лигандного комплекса уменьшается при солюбилизации более чем 5 раз. Уменьшается также эффективность быстрой стадии связывания антагониста с рецептором, говорящая об изменениях в структуре и свойствах соответствующего центра связывания лиганда.

К аналогичному выводу можно придти при рассмотрении данных химической модификации функциональных групп активного центра: в результате солюбилизации белка эти группы становятся более доступными модифицирующим реагентам (Рис.1). Резюме. Интеграция рецепторного белка в структуру биомембраны определяет конформационную динамику и кооперативные свойства его лиганд-связывающих центров.

4.3. Изменение состояния биоиекСрани при связывании лиганлов с мускариновым рецептором

Взаимодействие специфических лиганлов с рецептором мозга крысы вызывает уменьшение микровязкости липидноя части Оиомембран, изменение которого прослеживалось с помощью флюоресцентного зоила 1-ацил-2-[12-(9-антрил)-11-транс-додеценоилІ-єп-глицеро-З-фосфохолина, предварительно включенного в структуру мембранных фрагментов. Эти опыты выполнялись совместно с лабораторией проф. Л.Д.Бергельсона (ИБОХ АН СССР, Москва). Оказалось, что состояние липилного бислоя меняется под действием мускариновых агонистов и антагонистов (Рис.12). Неспецифические лиганды, например ионы тетраметиламмония, не влияют на микровязкость мембраны (Рис.12). Поляризация флюоресцентного излучения зонла меняется в течение 1-2 минут после добавления лиганлов, в том числе и ХБ, в мембранную суспензию, это означает, что изменение состояния биомембраны индуцируется первой быстрой стадией связывания антагониста.

13 11 9 7 5 log Ш

Рис.12. Изменение поляризации флюоресценции УФ-зонда в мембранных фрагментах мозга карба-моилхолином (1), атропином (2) и ионами тетраметиламмония (3).

Измерение микровязкости мембраны оказывается наиболее чувствительным из известных способов определения рецептор-лигандного взаимодействия, и наблюдаемые при этом эффекты насыщаются при концентрациях лиганла, которые сопоставимы или ниже концентрации активных центров рецептора. Это можно понять исходя из представления о псевдо-кристаллическом состоянии биомембраны, в котором возможно распространение кооперативного фазового перехода, индуцированного взаимо*-действием лиганла с одним рецептором, но охватывающего множество других рецепторних частиц на мембранной поверхности. В результате этого связывание лиганда с дополнительными молекулами рецептора не сопровождается лальнеяиим изменением

свойств биомембраны.

Резюме. Взаимодействие вгонистов и антагонистов с мускарино-вым рецептором влияет на состояние биомембраны, вызывая уменьшение микровязкости липидных компонентов.

В соответствии с классическими представлениям, молекулы мускариновых антагонистов сохержат помимо полярных фрагментов (аммониевые, сложноэфирные„ эфирные или гидроксильные группы) также аполярные (углеводородные) заместители, от строения которых в значительной степени зависит эффективность действия этих веиеств (Abramson et al,1969; Barlow et al,1963; Baker et al,1971; Ing,1949). В рамках данной работы обсуждяются механизмы молекулярного узнавания мускариновым рецептором мозга крыс этих аполярных заместителей, используя для количественной характеристики последних константы гидро-фобности (log Р) и молекулярной рефракции (НИ) (Hansch et al,l973). При этом установленные нами кинетические механизмы взаимодействия лигандоз с рецептором открывают возможность изучения эффектов строения на отдельных стадиях рецептор-лигандного взаимодействия. Кроме результатов собственной работы при этом применялись также некоторые константы диссоциации из составленного нами банка литературных данных.

5.1. Разные uexasscuu влияния аполярных заместителей на эффективность сгїп:;сзсі!ия лигандов с рецептороы

Корреляция рК. с константами гидрофобности log Р разбивает мускариновие антагонисты на подсерии в зависимости от наличия или отсутствия в ыолекуле полярных функциональных групп (Рис.13а). В случае алкиламмониевых соединений, простых эфиров и спиртоа соблюдается корреляционное уравнение

pK_d = рК + (Clog Р (24)

с близкими коэффициентами ф в интервале от О,6 до о,8, но разными отрезками ординаты. Ряд сложных эфиров описываются этим же уравнением ciP=Q,7±0,2. С другой стороны, для бензи-латов получим iP=i,5±0,2, что отличается от Ч? для остальных лигандов. Отдельную группу составляют также сложные эфиры троповой кислоты, эффективность взаимодействия которых с рецептором мало зависит от строения аполярноп части молекулы. Следовательно, в зависимости от некоторых других факторов строения проявляются разное механизмы взаимодействия аполяр-

ных заместителей антагонистов с мускариновым рецептором.

Весьма близкие выводы о возможности разных типов связи рецептора с лигандами сделаны и в других исследованиях взаимосвязи структуры и биологической активности мускариыовых лигандов (Трощиа и др, 1985), результати которых выли опубликованы спустя несколько лет после наріей работы.

Если изменение наклона зависимости рК, от log Р свидетельствует о изменении механизма взаимодействия лиганда с рецептором, то наблюдаемые на Рис. 1ЭА параллельные сдвиги корреляционных зависимостей можно объяснить также тем, что (акалы констант гидрофобности длп этих групп соединений сдвинуты в результате появляения в молекуле дополнительных полярных атомов, характеризующихся отрицательными инкрементами log Р. В таком случае параллельным сдвигам корреляционных зависимостей трудно присвоить конкретного физического содержания.

В отличие от log Р рікала MR не отражает сольватационные эффекты и характеризует прежде всего объем молекул. Оказывается, что применением MR вместо log Р те же данные для алкиламмониевых соединений, простых эфиров и спиртов можно описать обией зависимостью (Рис.136):

pK_d = с + ^MR , (25)

где vi) =0,091 ±0,009 и c=-l,l±o,7. При этом отдельные реакционные серии составляют бензиловне эфиры ( W =0,17iO,05) и тропаты ( у~0) .

Таким образом, параметры MR предоставляют альтернативную возможность корреляции эффективности иускариновых лигандов, давая при этом более универсальные зависимости. Этот факт не объясняется просто тем, что между параметрами log р и MR соблюдается хорорая корреляция, так как включение полярных функциональных групп в структуру лигандов приводит к раздроблению этой зависимости. Следовательно, описываемый величиной MR объем молекулы следует признать по сравнению с log P более универсальным параметром для описания взаимодействия антагонистов с мускариновым рецептором, хотя в рамках существующих теорий белок-лигандного взаимодействия наблюдаемым закономерностям, включая значения наклонов корреляционных зависимостей, трудно присвоить конкретное физическое содержание. Резюме. Мускариновые антагонисты разделяются по характеру зависимости рК. от строения лигандов на несколько группы, отражая разные механизмы молекулярного узнавания этих веществ рецептором.

О 1 2 3 k 5 6 7 8 9 10 togP'

Рис.13. Зависимость рК. (Q ,Ди[]| и рК. () для мускариновых антагонистов от гидрофобности (А) и от объема (Б) лигандов (О и Q -сложные эфиры, Д -простые эфиры, -алкиламмониевые соединения). Значения log Р' вычисляли без учета вклада атома азота. Номера соединений 1-12 соответствуют Табл.1 и 2.

Остальные соединения имели следующую структуру:

15- Ph₂CHC0OC₂H₄N Me₃;

(Ph)(CYHex)C(OH)COO(CH₂)₂N Et₂Me;

_1в'«^№_'^!

16- PhCH₂COO-/ /^+Ме₂

18- Ph₂CHCH₂OC₂H₄NMe₃; 20- PhC,H.OC„H^N⁺Me„;

17- PhCH₂COO

N Me,

19- cyHexC₂H₄OC₂H₄N Me₃;

21- EtOC„H,N⁺Et,; 2 4 3

22- Ph₂CHC₄H_gN Ме₃;

24- cyHexC.H,„N Me„; 5 10 о

"- Очг>

NH„

ЗО-

Ph

25- PhC₅H₁₀N Me₃;

27- PentN Et„

NH„

5.2. Сопоставление параметров К. и К.

Л а

Антагонисты, в случае которых соблюдается двухстадийная схема рецептор-лигандного взаимодействия, характеризуются двумя константами диссоциации, К. и К.. При этом параметры К, имеют одинаковое содержание с константами К. для других лигандов. Это вытекает из единой зависимости соответствующих величин от MR, а также из одинаковых наклонов зависимостей рК и рК. от log Р¹ (Рис.13). Значение vP=0,8±0,2 для рК

бензилатов хорощо согласуется с представлениями о гидрофобном связывании лигандов в активных центрах белков.

С другой стороны, из этих же результатов следует, что процесс изомеризации рецептор-лигандного комплекса индуцируется только в случае Сензиловых эфиров и тропатов. Остальные антагонисты, рассматриваемые в рамках приведенной на Рис. 13 корреляции связываются с рецептором в соответствии с одностадийной реакционной схемой как обратимые лиганды.

Оказывается, что константы К. для бензилатов и тропатов можно рассматривать в рамках единой зависимости, если учитывается влияние только алкильного заместителя этих сложных эфиров (Рис.14). При этом нет принципиального различия между щкалами log р и MR, так как в обеих случаях в получаемых зависимостях проявляется четкий излом. Подобные изломы хороро известны из химии ферментов и обычно интерпретируются в рамках представления об ограниченных размерах связывающего центра белка. Вероятно, что этим и обьясняется факт, что эффективность связывания тропатов не чувствует изменений в структуре лиганда (Рис.13), так как по значениям ^MRAlk ^эти вещества останутся за "точкой излома". До "точки излома" соблюдается линейная зависимости рК. от MR...

(РИС.14):

Р^КА - ^СА ⁺ V^RAlk ' <²⁶>

где МЛ=0,11±0,04.

В случае бензилатов и тропатов К =к„К,, где К,=к ,/к,.

а А і 1-11

Последняя величина характеризует изомеризационное равновесие, которое также зависит от строения лиганда. При этом проявляется аналогия в зависимостях рК. и рК. от MR_Alk. включая соблюдение корреляционного уравнения:

\j/^=0,12±.0,05. Таким образом, в случае бензилатов

константы К и к, дают свои вклад в

строения лиганда, о/= Ф. +4^-

т г

І і і і I I 1 1 1 1

30 U0 50 30 І-0 50

MR_A,_k MR_ulk

Рис.14. Зависимость рК. и рК, от строения алкильной части сложноэфирных антагонистов, номера соединений соответствуют Табл. 1 и 2.

Оерамает на себя внимания факт, что рецептор "узнает" строение лиганда на двух следующих друг за другом стадиях рецептор-лигандного взаимодействия. Аналогичный эффект повторного проявления гидрофобности субстрата на стадиях сорбции и катализа известен для ряда ферментов и нарел объяснение в рамках представления о возможности вторичной сорбции реагента со стороны фермента в результате замыкания гидрофобной полости его активного центра на стадии активации (Aaviksaar et al,1971; Мартинек и др,1974; Клесов 1977; Березин и Мартинек, 1977). Можно высказать предположение о том, что повторное проявление одинакового фактора специфичности на последовательных стадиях сорбции и изомеризации рецептор-лигандного комплекса также связано конформационной перестройкой рецепторного белка в процессе взаимодействия с лигандом. Резюме. Установлены закономерности влияния строения антагонистов на стадиях связывания лиганда и последующей изомеризации рецептор-лигандного комплекса.

5.3. Влияние структуры антагониста на изомеризационные

процессы

Объем (или гидрофобность) молекулы антагониста не определяет возможности протекания конформационной изомеризации рецептор-лигандного комплекса. Инициация этого процесса очевидно связана с особенностями структуры кислотной части этих соединений. К этим факторам строения можно отнести

наличие гидроксильной группы и ароматического цикла, как это имеет место в случае эфиров троповой и бензиловоя кислот. Для соединений первого типа скорость изомеризационного процесса превраиения комплекса в обоих направлениях мало зависит от строения антагониста (Табл. 1 и 2). В случае бензиловых эфиров, однако, переход от полиметиленовой к алициклической и затем к бициклической структуре алкильноя части уменьшает значения обеих констант скорости, к, и к, (Табл. 1 и 2). Наиболее малая скорость изомеризационных процессов характеризует L-ХБ. С другой стороны, объем алкильных групп тропатов больше по сравнению с этой группой в молекуле ХБ, что отражается в величинах MR ... и комплексы рецептора с тропатами изомеризуются быстрее. Скорость изомеризационных процессов увеличивается также при алкилировании ХБ (Табл. 1 и 3). На основании этих данных можно высказать предположение о существовании некоторого оптимального размера (объема) спиртовой части антагонистов, котрой соответствует наиболее малая скорость конформационных перестроек. В случае тех же лигандов происходят предположительно и наиболее существенные изменения конформации рецептора.

Резюме Скорость конформационного перехода рецепторного белка на стадии изомеризации рецептор-лигандного комплекса контролируется объемом заместителя алкильноя части этих лигандов.

В качестве основного подхода в наших исследованиях применялся метод кинетического анализа взаимодействия муска-ринового рецептора с лигандами, а также процессов химической модификации, термоинактивации и солюбилизации рецепторного белка. Необходимо подчеркнуть, что нашей целью, естественно, было не простое приспосабливание методов кинетики к изучению рецепторов, а получение ответов на определенные вопросы, в первую очередь касающейся кинетической модели рецептор-лигандного взаимодействия и механизмов молекулярного узнавания структуры лиганда рецептором. Оказывается,что при этом многие проблемы в принципе не могут быть решены общепринятыми методами равновесного связывания радиолигандов с рецептором, так как в рамках этого подхода характеризуется суммарный процесс и определению поддаются только медленно диссоциирующие рецептор- лигандные комплексы. Кроме того, скорость изомеризации этих комплексов в отдельных случаях может оказаться настолько малой, что не допустит достижения в условиях эксперимента

истинного равновесного состояния. Все это указывает на принципиальные преимущества методов кинетического анализа.

Обнаруженный многостадийный механизм взаимодействия ряда эффективных антагонистов с мускариновым рецептором составляет конкретную основу для интерпретации результатов,полученных также другими методами рецепторологии и открывает принципиально новые возможности анализа механизмов молекулярного узнавания лиганда в связывающем центре рецептора. При этом, на основе кинетических закономерностей взаимодействия мускариновых антагонистов с рецептором, выявлялась необходимость разделения этих лигандов на две группы и только после этого стало возможным обсуждение факторов,определяюиих эффективность связывания этих лигандов с рецептором и контролирующих стадию конформаиионной изомеризации рецептор-лигандного комплекса.

Проявление максимумов в зависимостях скорости изомериза-ционных стадий от строения антагонистов свидетельствует о существовании некоторого оптимального пространственного соответствия этих молекул или отдельных их частей и связывающего центра рецептора. Вероятно, что при этом образуются наиболее тесные контакты между рецептором и лигандом, обеспечивающие максимально глубокое "внедрение" лиганда в полость связывающего центра в результате изомеризационных процессов рецептор-лигандного комплекса.

Принципиально важным результатом следует признать установление факта о том, что связывание агонистов и антагонистов с мускариновым рецептором на быстрой стадии рецептор-лигандного взаимодействия не является конкурентным, что подводит к модели рецептора с разными лиганд-связывающими центрами. Аналогичный вывод вытекает также из факта кооперативной регуляции скорости изомеризации комплекса рецептора с антагонистом. Однако в этом случае связывание дополнительных молекул лиганда с рецептором не ингибирует изомеризацию рецептор-лигандного комплекса, а наоборот, ускоряет этот процесс. Вероятно, что именно на этом этапе рецептор-лигандного взаимодействия имеет место разделение лигандов на агонисты и антагонисты. В рамках такой модели можно дать конкретное объяснение действию частичных агонистов, которые с близкой эффективностью взаимодействуют с центрами обоих типов.

Существует, естественно, предел применимости кинетического подхода в целях изучения механизмов клеточного рецептора, поскольку исследуемая система лищена функциональной взаимо-

связи с нейрональной клеткой, что несомненно отражается в свойствах рецептора. С другой стороны, однако, даже извлечение рецепторного белка из биомембраны сохраняет определенные черты кинетического поведения этого белка, несмотря на теснуп взаимозависимость свойств рецептора и его мембранного окружения. В этой связи можно надеяться, что определенная часть установленных закономерностей и механизмов рецептор-лиганд-ного взаимодействия отражает протекающие в живой природе ре-цепторные процессы и выявление соответствующих закономерностей в рамках разработанного нами научного направления кинетической рецепторологии способствует достижению более обыих целей изучения клеточных рецепторов.

ОСНОВНЫЕ выводы

1. Разработанный на основе комплексного использования методов химической кинетики подход для изучения механизма взаимодействия лигандов с мембранным и солюбилизированным рецепторами является информативным и эффективным, несмотря на сложность изучаемых биологических структур, на их исключительно низкую концентрацию, а также на наличие ряда методических и экспериментальных трудностей и позволяет переоценить и качественно дополнить многие общепринятые представления, основанные на применении простой одностадийной равновесной модели рецептор-лигандного взаимодействия.

2. Взаимодействие с мускариновым рецептором эффективных антагонистов, производных бензиловой и троповой кислот, протекает как многостадийный процесс, включающий стадии мономолекулярной изомеризации рецептор-лигандного комплекса. Этим изомеризационным стадиям соответствуют внутримолекулярные конформационные переходы рецептор-лигандного комплекса, скорость которых не зависит от концентрации добавленного в среду электролита.

3. Скорость связывания бензиловых антагонистов с мускариновым рецептором мозга и сердца кооперативно регулируется избытком лиганда, если в случае рецептора гладких мырш тонкой киціки этот эффект отсутствует. На активной поверхности кооперативно регулируемых рецепторов обнаруживаются два типа ли-гандсвязывагацгих центров. Определена эффективность связывания L-ХБ и МеПБ с этими центрами и по закономерностям влияния соли на эти константы диссоциации установлена роль ион-ионных взаимодействий при образовании рецептор-лигандного комплекса.

і. Влияние агонистов на кинетику связывания антагонистов с мускариновым рецептором носит неконкурентный характер и свидетельствует ое образовании тройного комплекса агонист-рецептор-антагонист в этом процессе. Образование такого комплекса необходимо учесть при интерпретации результатов радиолигандного анализа.

5. Лиганд-связываюыие свойства мускаринового рецептора контролируются -SH, -С0ОН и -SS- группами белка и химическая модификация -ин„ групп не влияет на связывающие свойства рецептора. Кинетические закономерности реакции модифицирования свидетельствуют о гомогенной популяции рецепторов в мозговых мембранах. Степень доступности SH-группы рецепторного белка к химическим модификаторам меняется при связывании лигандов в активном центре рецептора, а также в процессе его солюбилизации.

6. Скорость реакции иона Н,Н-диметил-2-фенилазиридиния с нуклеофилами зависит от общей основности реакционной среды, описываемой параметром В, что открывает возможности применения этого реагента в качестве зонда для оценки сольватаии-онных свойств лиганд-связываюиих центров белков. Показано, что лиганд-связываюиий центр мускаринового рецептора характеризуется основностью, близкой к основности амидных групп и не включает сольватную воду.

7. Мембранное окружение мускаринового рецептора определяет его лиганд-связывающие свойства и кооперативный характер взаимодействия с антагонистами, а также закономерности процесса инактивации рецепторного белка, как следует из сопоставления свойств мембранного и солюбилизированного рецепторов. Исследование временной зависимости выхода солюбилизации рецептора при разных концентрациях детергентов позволило оптимизировать этот процесс, а также оценить влияние структуры детергента на эффективность их действия. Решающим для сохранения лиганд-связывающея активности солюбилизированного рецептора является взаимодействие рецепторного Оелка с несколькими молекулами фосфолипидов.

8. Специфическое взаимодействие мускаринового рецептора в мембранных фрагментах коры мозга крысы с агонистами и антагонистами непосредственно влияет на физическое состояние биомембраны, о чем свидетельствует изменение её микровязкости, измеряемой с помощью липидного флюоресцентного зонда.

9. На основе кинетических закономерностей взаимодействия высокоэффективных сложноэфирных антагонистов с мускариновым

рецептором проведен анализ физико-химических основ молекулярного узнавания этих лигандов на отдельных стадиях процесса. Образование первого, быстро диссоциирующего комплекса в последовательном механизме взаимодействия рецептора с антагонистами определяется строением аполярной части лигандов. Возможность изомеризации рецептор-лигандного комплекса определяется структурой ацильного фрагмента сложноэфирного антагониста. Скорость изомеризационноя стадии лиганда контролируется строением алкильноя группы реагента.