Кинетические закономерности функционирования рецепторно-ферментных систем при длительном введении морфина Ильина, Анна Дмитриевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблемо возникновения лекарственной зависимости и такого заболевания как наркомания - одна из фундаментальных проблем биохимии'и медицины. Морфгаювая интоксикация - наиболее.типичная фэрма наркомании. Исследования последних лет показали, что длительное ввбдоние морфина вызывает глобальные изменения, затрагивающие различные системы организма - нервную,, иммунную,.эндокринную и механизмы их взаимодействия.

МОрфиновая наркомания развивается во времени и охватывает механизмы функционирования многих рецепторно-ферментннх систем.

Это делает актуальным проведение комплексного исследования механизмов действия морфина с применением методов химической кинетики, позволяющих выявить кинетические закономерности формирования физической зависимости.

' Цзль работы. Целью настоящей работы явилось исследование кинетических закономерностей эффектов морфина-на нервную и иммунную ' системы организма, вклотая изучение центральных и периферических. опиоидши рецепторов, системы передачи сигнала внутрь клетки; через рецепторы и g-оєлки, системы моноаминов, системы энальгетического эффекта морфина. Особое внимание было уделено теоретическому аналізу кинетических- принципов функционирования рецепторыо-фермонищ систем в условиях длительного воздействия морфина иформирования физической зависимости от него. .,''.- Научная новизна. Для описания поведения рецепторно-ферментных систем в;условиях длительного, введения наркотического препарата предложена кинетическая модель .двойного действия вещества.'; Модель двойного действия, предполагающая влияние морфина' на синтез' и деградацию продукта ферментативного процесса, использована в исследовании поведения дофамгаергической и серото-нинергической систем ..моиоаминов' при хронической морфинизацш. Сформулированы основные кинетические принципы функционировашія рецепторно-ферментшх систем в процессе-формирования зависимости от лекарственного препарата. Проведено изучение кинетических закономерностей влияния морфина на анальгетический ответ, систем моноамин'ов, \ системы шмунокомпетентных органов, снетеш оплоид-шх рецепторов коры головного мозга мышей и периферичесісих органов,, а также., динамики изменения кг ццентрзции морфина в плазме

крови. На основании анализа полученных кинетических параметров
выявлены корреляции ь зіМ'ік'гах морфша. С помощью физико-
химических методов исследования установлен факт различной регу
ляции морфином оппоишшх рецепторов центральной нервной системы
и ремяшносящнх щютоков мышей, а также супервысокоафршних цен
тров связывания и- и s- лигандов кори головного мозга животных.
Обнаружение, что длительное ебєдєниє морїлша не влияет на харак
теристики комплексоооразованил м-реценторов, однако, вызывает
увеличение сродства сугюрвысокоаффш-шого центра связывания
А-лигандов в процессе длительной'мобилизации. Исследование ки
нетики диссоциации ц- и г- лиганд-рецелторних комплексов поі
действием gtp показало различное влияние иорфіша на сопряжение
G-белков с и- и е- рецепторами. Устацовлеїш отличия кинетических
параметров динамики эффектов морфина на селезенку.и тимус - им-
мунекомпетентные органи. Оошружеіщ отличия в,физико-химических
характеристиках процесса комплексообразования лигандов с опиоид-
ншлк рецепторами линий мишей, обладающих различной генетической
чувствительностью к алкоголю. . ' '

Практическая ценность работы. Модель двойного- действия вещества , предложенная для описания поведения рецепторно-ферментных систем в условиях длительного введения наркотика и возникновения зависимости от него, создает основу, для исследования поведения многих рецепторно-ферментных систем в условиях адаптации к действию лекарственного вещества,Сформулированные кинетические принципи формирования физической зависимости создают основу для изучения наркогенных'свойств новых фармакологических препаратов. Апробация работы. Основные результаты были представлены/ на 8-ом конгрессе Европейского Нейрохимического Общества (Лейпциг, 1990 г.). на Всесоюзном симпозиума "Биохимия рецепторних систем" (Таллин, 1990 г.).

Структура диссертации. Диссертационная работа.,- состоит из сведения, литературного обзора, экспериментальной части, 3 глав,, в которых излагаются результаты исследований и их обсуждение, выводов и сішска литературы (&&9 наименований), Работа изложена на 4 іР^ страницах, включает -/^- таблиц и ЗЦ рисунков. '

Публикации. Ііо материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Методика эксперимента. Для , морфияязации мышей . линии

F-ПібрИД (СВЛхС57СЬ) и линии овл использовали метод подкожной имплантации таблеток с морфином (75 мг из таблетку) и плэцобо в качестве контроля. Кинетические эксперимента просолили во временном интервале от Б до 96 часов морфинизапии. Анэльгетический эффект морфина исследовали "tnii-riick" тестом. Развитие зависимости наблюдали по синдрому отмени морфина при введении налоксо-на. Концентрации морфина в плазмо крови определяли двумя методами: радиорецепториым анализом и поляризационным иммунофпкюромет-рическим анализом. Концентрации моиоэмштоп в стрнатуме мозга определяли высокоэффективно» жидкостной хроматограф-лей. Изучение свойств опиоидних рецепторов семявниосящих протоков мышей проводили, исследуя влияние опиоидних лигаидов на электрически стимулируемые сокращения органа. Изучение комшіексообразовзштя МечеН-ЙОГО ТрИТИеМ м-ЛИГаЯДЭ {t'l1]-Tyr,D-Ma³,M-tte-Pfte\Gly⁵ol]- энке-

фэяина <³h-dago) я з-лйгзндэ n'jij-Tyr, o-sor². Leu]- энкефэлгат-<№rV (^ic-csbETi с оппояднш.пі рецепторами мембранного препарата коры головного мозга мышей проводили с помощью метода вакуумного фильтрования через стекловолокошше фильтры Gf/B, неспеші-фпческое . связывание определяли при добавлении I0"^f'M немеченого яигаядэ. При исследовании эффектов gtp использовали ст4?-регенерирумцую систему: креатинфосфзг 2 -ыМ и креатинфосфзт-ішиаза 1 ед. Математическую обработку данных проводили с использованием программы "sutgrnphics" и программы "ДКЛЬТА", рэзрэбо-танной в секторе .биокинетики Ыежфакультетской проблемной НИЛ им. А.ІІ. Белозерского.

РЕЗУЛЬТ/ТН РАБОТЫ Терретц2ШСкіШ^ана^пі^і«№еиіч^га«

gejejrropHOHjejM^

лекарственных препаратов и формирования зависимости.

Легальное рассмотрение известных гипотез действия физиоло-.гически активных, веществ на рзцепторно-фермептные системы показало, что все ОНИ МОГУТ бЫТЬ СВедеїШ К ПрОСТеЙИИМ МОДеЛЯМ ДВУХ'

типов: I)моделям с отрицательной обратной связью между ключевым продуктом р и синтезирующей' его рецепторпо-фзрментной системой re,, на, активность которой действует. вещество L; 2)моделям двойного деПот-вия физиологически активного соединения ь, в рамках

*

которых предполагается, что наркотическое вещество обладает двумя противоположно направленными эффектами: с одной стороны - изменяет активность рецепторно-фериентной системы, с другой сторони - влияет на концентрацию и метаболизм ее компонентов.

Задача проведенного нами кинетического рассмотрения факти
чески сводилась к виявленню,взаимосвязей, которые должны сущ&ст-
0овать в выбранных нами моделях, чтобы соблюдались следующие
свойства системы; -

1. консервативное поведение рецепторно-ферментной системы относительно внешних воздействий, то есть-способность, поддерживать на постоянном уровне концентрации жизненно важных продуктов (р) при длительном воздействии наркотика;

2. значительное, отклонение от контрольного уровня концентрации ключевого продукта (р) рецеяторно-фзрмен-тной системы при О.ТМВДЄ Длительного'введения препарата;

На рис.1 представлена .теоретическая, кривая изменения, концентрации КЛЮЧеБОГО Продукта Р реЦеПТОРНО-фермеНТНОЙ СИСТеМЫ Щ

е-бедение отмена эффектов і Эффектора

_'3

Рис.1 Поведение ключевого продукта (р) рецепторно-ферментной системы в условиях: а) длительного влияния эффектора и б) его отмены, (Р_стз -значение концентрации ключевого продукта рецепторно-ферментной системы в,отсутствии эффектора, ' .'

в условиях введения и. отмены аффектора ь, обладающего.ингибирую-. щим влиянием на re , которая .отражает обсуждаемые свойства сие-.

темы. -'''.'"''.'

Мы исследовали условия консервативного поведения по отношению к воздействию ь для схемы Ш. предполагая, что концентрации s и l в системе постоянны, .а взаимодействие ь' с рецепторно-ферментной системой re происходит в равновесном режима и,может

включать самые различные типы ингибировапия или активашш, скорость оттока р и re линейно зависит от концентраций р и re,

к ч

RE + S =— . RES

K_L ь\\ «к.

К,

LRE + S ' _ *- LRES —g%—-> LHE + Р (I)

**" КВТ |

V . V '

где к_п, к_квг, а, із - параметра, характеризующие ферментативный синтез и влияние на него лиганда, к₍. - равновесная константа диссоциации комплекса і. с рецепторно-фермвнтной системой; к_ин -константа скорости ипэкгивэшш комплекса лиганда с рецепторно-фзрменгной системой; . г_ГЕ, - v - скорости синтеза и деградации рецепторно-ферментнои системы ;v_p и v_p' - скорости независимого от re притока продукта р и его оттока..

Соответствующая схеме (і) система дифференциальных уравнений будет иметь следующий вид:

<»{Р) - V - V ' 4- k ' (tt])tRE]_a (2)

ГДЄ ... ' ^k ' ^(tL])* а (К, +[LJ) ~

+ rs)

«K_l + [L]

к [1,}

ми^l ' ,

к_иі'₍([Ь])=-—ПьТ'^,[КЕ'а" Щ^ЗЯ концентрация всех

форм фермента в.данный момент времени.

Полученные дифференциальные уравнения были проанализированы на устойчивость решения л условия консервативного поведения р.

При этом для моделей с отрицательной обратной связью в качестве
^vhe и ^vnt были шзраш следующие функции:I) v =—-~ ;

^HL К" + [Р]^п

к if) . v [P]ⁿ ^.

2) v.—^т-грг^{(REJ; Э) v}«-^v - -#TTp-7 '

Аналогично бит исследованы четыре модели двойного действия, предполагающие влияние лиі'анда на ферментативный синтез р, и также: I) на ойосиятез фермента (v_|iE( [Ь])); 2) на инактивацию фермента (v^cfbj)); 3) на независимый от re синтез продукта >; 4) на деградаций продукта (v_p'.

Проведенное наш рассмотрение позволяет сделать следующие вывода.

Во-первых, в моделях с отрицательной обратной связью.консервативность в системе no {p_ctj(рис.1); возможна только в том случае, если в системе (1)-(2) d[RE]_a/at не зависит от концентрации (КЕ)_а. Это предполагает нулевой no [RE)_a порядок скоростей изменения концентрации фермента, что в реальных системах кажется маловероятным. Поэтому особое внимание мы уделили моделям двойного действия лиганда. ' -. .

Во-вторых, в случае моделей двойного действия консервативное поведение системы определяется типом функций, характеризующих "второе" действие.лиганда.

В-третьих, оба рассмотренных типа моделей даш? устойчивые состояния равновесия [г>_сі] и [ИЕ)_сі, Однако', как видно из проведенного анализа, в отличие от проанализированных нами моделей двойного действия, где состояние равновесия всегда соответствует устойчивому узлу, в случае моделей с отрицательной обратной связью состояния равновесия при некоторых соотношениях параметров отвечают устойчивому узлу, при других - устойчивому фокусу. Вместе с тем, в присутствии l и соответствующих измененных параметрах, например k' ((L]), может наблюдаться переход от состояния устойчивого узла к состоянию устойчивого фокуса либо, наоборот. Следствием этого является возможность появления в системе затухающих колебаний концентраций р и re в процессе восстановления исходной концентрации [р_ст],

В-четвертых,'проведенное нами рассмотрение модели двойного действия даже в простейшем варианте для случая влияния лиганда

на синтез и деградацию фермента позволяет заключить, что она достаточно удовлетворительно лает качественное совпадение повеления (EE)(t) и (P)(t) с поведением реалышх метаболитов при вводе и отмене наркотика.

Развитие привыкания-к наркотику, возможно, связано со свойством консервативности системы.

Механизм двойного действия обеспечивает не только консервативность системы по ключевому продукту р, но и по ключевому ферменту re при условии, что "второе" действие лиганда направлено на регуляцию независимого синтеза или оттока продукта и выполняется. СООТНОШеНИЯ ДЛЯ СкорОСТеЙ ЭТИХ ПрОЦеССОВ (V_p([L)) или

v_p'([b])> ,. определяющих консервативность системы. Такого рода механизмы отвечают "идеальной" по концентрации (REJ_a и по продукту (Р] консервативности система.

.-< Однако в случае влияния лиганда па независимый синтез продукта будег наблюдаться изменение концентрации предшествешшкоп продукта, участвующих в независимом от рецепторно-ферментной системы re притоке продукта."' Для механизма двойного действия, . предполагающего влияние наркотика на ферментативную активность re и деградацию продукта р, существенные изменения происходят в концонтрэщта метаболитовпродукта. V

" В-пятых, нами. Сы-'.о. исследовано поведеіше моделей двойного действия і предполагающих влияние лигандэ на синтез и деградацию фермента, в. режиме. отмены наркотического вещества. В'кинетике изменения концентрации; продукта р отклонение от стационарного состояния вследствие удаления лиганда наблюдается в случае, ког-. да характерное время процесса оттока р значительно меньше аналогичного времени для re. Из'анализа ютнетйческих уравнений следу-' /етучтб другим-неоОходиАлм'условием'такого поведения р является ; медленная инактивация' рецепторной системы: без этого невозможно изменение re до'нового'.стационарного уровня, который и .определя- ет ашлитуда.отклонения.р после отмены воздействия. "' -

j.Таким образом,.-"данный теоретический анализ позволяет сфор- мулировать основные кинетические принципы,^- которым; должна удов-' .- летворять система в условиях длительного'..введения морфина и фэр-;' мирования физической зависимости:.:^'^^.^;:^-;1^;; .-'.,''. ..'-.;.' ',

I) значительное'отличие характерных.времен процессов оттока про- , '..дукіа' и фермента; -'^ib^-V^-h-^. ^-Й^ч'^ ..-'v^;.' .

2) медленная инактивация рецепторной системы в процессе длительного воздействия лекарственного вещества. .

Кроме того, в ходе анализа Сило показано, что модели двойного действия в большей степени соответствуют, поведению ключевого продукта р в условиях длительного введения наркотического вещества , чем модели с отрицательной обратной связью,

Анализ кинетических кривых изменении концентраций . морфина в плазме крови f -гибрид (cbaxC57bl| мышей .

Были исследованы: кинетика изменения концентрации опиатнр-активной формы морфина с помощью радиорёцепторвдго метода анализа, кинетика изменения концентрации иммунореактивных форм морфина с помощью поляризационного иммунофлюорометрического анализа.

Обнаружено, что концентрация опиагно-активной формы морфина значительно ниже .( на два порядка ) чем концентрация его иммуно-реактиввдх форм ( рис.2 А,. Б). Как видно из рис.2, кинетические

С.МхЮ

-?

с, м>ю

2.0

І0-

_I

_Ц^1

$г~

t,a

о го

v.

во loo t,s

Рис.2 Кинетические кривые изменения концентрации морфина в

мыщей при подкожной (75 мг на таблетку): иммунореактивная форма

плазме крови f -гибрид

(CBAXC57BL)

имплантации таблетки с препаратом

А)опиатно-активная форма морфина; Б)

морфина, кривив изменения концентрации морфина проходят через максимум, а затем концентрация изменяется до уровня порядка 2,0 t ї.2-10"⁷ М

для опиатно-активного морфина и 1,5 '* 0,3 І0"⁵ М для его)иммуно-

' \

реактивных ({юрм. После 12 часов введения препарата кинетика изменения концентрации оппзтно-э'ктивиой и иммуноре активной форм морфина удовлетворительно описывается функцией, содержащей одну экспоненту. Показатели экспонент равны, соответственно: а) 0,08 ± 0,02 (ч"'); б) 0,13 і 0,04 (ч"').

Таким образом, показано, Что в процессе морфинизацни уровень концентрации опиатио-активной форми морфина существенно ниже концентрации иммунореэктивных Форм вещества , однако, относительно висок в течение 96 часов.

Взаимосвязь кинетических параметров кривых изменения

концентрации морфина с аналъгетическим действием морфина.,

Один из основных физиологических эффектов опиатов - увеличение порога болевой чувствительности. Исследование анальгети-чзского' ответа проводилось с помошыо "tali-flick" теста. На рис.3"представлена кинетическая кривая изменения анэльгетичес-

% анальгезии і

Рпс.З. Кинетическая кривая изменешія в процессе длительной морфинизации анальгети-ческого эффекта морфина, измеренного "tail-flick" TSCTOM

О 90

кого ответа в процессе"морфянизвши. Из сопоставления кинетических кривых рис.2 и рис.3 видно, что в присутствии значительных концентраций морфина процент анальгезии уже на 72.часах морфини-ззции стремится к нулю/ то есть s системе,энэльгетического ответа развивается привыкание' (Толерантность)' к морфину. . ", - Одновременно с изучением анальгезии было, показано развитие

физической зависимости от морфина по изменению поведенческих реакций при введении антагониста - налоксона,

таким образом, длительная морфинизация Р₁-гибрид('свАхС57ВЬ)
мышей сопровождается формированием привыкания к морфину и разви
тием физической зависимости от него. ,, ' '<. ..':''

Исследование влияния морфина на ыетаболизм норадреналина, дофамина и серотошїна в стриатуме головного мозга мышей

Поскольку в фармакологических и поведенческих эффектах мор
фина большую.роль играют биогенные амины, мы исследовали кинети
ку изменения концентраций нейрогормонов -' норадреналина, дофами
на (рис.4а) и серотошїна (рис.5а), а так же метаболитов дофамина
3,4-даоксифзнилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты
(ГВК) и метаболита серотошїна - 5-гидроксииндолуксусной кислоты
(5-ОИУК) в стриатуме f-гибрид (свахсзуЪь) при длительной обра
ботке морфином. '''".."",- ."' ./'V. ''" ";/.'. .-

Обнаружено, что содержание в стриатуме норадреналина; дофамина, серотонина и ДОФУК не изменяется в процессе морфинизации. мишей. Концентрации ГВК (рис.46) и 5-ОИУК (рис.50) изменяются в процессе морфинизации. Кинетические кривые., рис.46 и 50, имеют

Рис.4 Изменение концентрации дофамина (а) и его метаболита гомовашшшовой кислоты (ГВК) (О) в стриатуме f₍-гибрид мышей в процессе' длительной морфинизации: о - измерения в опыте'; о - контрольные измерения.;.;

г ткани

дофамин, »|

ГВК на

_тЦп

вО 400 t,M О 20 60 .-'toO-tfi

иг иг.

СЄРОТОНИН, -g гм_М \j 5-ОИУК, ГтіЙіін

ioo t,.e о га ео doo t,a

морфшш-измеремия в оглте; о^- контрольные измерения.

Рис.5 Изменение койцеаіратош . соротогаша (а) и 5-гидроксииндолуксусгои. кислота (5-ОИУК) (0) в стриатуме f-пк5рид(свАхС57вь> мышей в процессе длительной

зэцил:

максимумы при различных временах морфишізащш. Однако параметра-, характеризующие скорость уменьшения концентрации ГВК и 5-ОИУК,- » пределах 'ишаки эксперимента совпадают и равни, соответственно-,. 0,029 і 0,008 Чч''> № 0,033" t 0,01-2 (ч'')₍ :

Для описания подобного поведения дофаминергической и серо-тогашергической систем моноаййнов, когда концентрации предшественников метаболитов посгоянйй*. а концентрации метаболитов возрастают (рис' 4,5), мы пра;йй>аЙЛи модель двойного действия наркотика, предаолагавдуїокойй&ЙСирующие; друг друга эффекта морфина на синтез и дергадацйкг #о$амйна и серотошдаа: . Активация морфи- : v " ' '' ''Активация мор-

ном синтеза ней рогормона

"Увеличений концентрации метаболитов (ГВК.5-0ИУК)

ЙЄЇІ

Ш ротойШУ

\$5$-~v Фйном деграда-

Щф± ,. ции нейрогормона

Таким.образом, мы обнаружили, что развитие физической зависимости ВСЛеДСТВИе ДЛИТеЛЬНОЙ МОРфИШЗаЦИИ F^ril'opHUICBAxCSVBL)

мышей сопровождается значительными изменениями в-' поведении дофаминергической и серогонинергической систем моноаминов. Полу-

ченныи результат согласуется с теоретическим анализом кинетических моделей двойного действия физиологически активного вещества в процессе формирования физической зависимости.

Изменение веса иммунокомпетентных органов в процессе норфишіззции.

Поскольку изменения в метаболизме моноаминов могут отражаться на состоянии значительно иннервпрованных органов, было

ИЗУЧеНО ВЛШПШе ДЛПТеЛЫЮЙ МорфИНИЗаЦИИ F -ГИбрИД(СВАхС57ВЬ) мышей на вес тимуса и селезенки.

Установлено, что развитие физической зависимости сопровождается уменьшением веса тимуса и селезенки (рис.6).

Рис.6 Изменение вера иммуно
компетентных органов относи
тельно контроля в процессе
формирования физической за-,
висимости от морфина:
О - отношение опытных зна-
оМ ~ ^it ' ?s~^~^M— чеши к контрольным дли веса

го во„' -loot,а

тимуса; о -'для . веса . селезенки, вес органа нормирован на вес мыши в момент измере-. ІШЯ. ':'.*

Тимус является первичным лимфоидным органом, поставляющим в кровь Т-лммфоцитн. Селезенка - вторичный лимфойдный орган, являющийся депо в основном В-лимфоцитов. Из-рис.6 видно, что,кинетика уменьшения веса тимуса и селезенки различна. '

Показано, что дополнительная морфинизация ( введение еще одной таблетки с морфином ) Не сопровождается-эффектом, морфина на вес шмунокомпетентшх, органов, "то есть в.системе развивается привыкание к наркотику. При дополнительной морфинизацш, э также при отмене наркотика вес селезенки увеличивается. 'Величина эффекта уменьшения; веса тимуса- при' повторном ^введении ' таблетки меньше по сравнению с величиной эффекта при'первичной обработке ^: мышей наркотиком. При отмене.препарата также Наблюдается.незначительное уменьшение веса; тимуса.'- .-...-.,.-'^;'. '.'.-.*'''..'. ';,„.-.'.:;

Таким образом, проведенные исследования говорит о различной регуляции морфином первичного лішфопдного органа - тимуса и вторичного лимфэидоого органа - селезенки.'

Влияние^ длительного введшіия^оріїша^иасіїстеш

ОПИОНДПЫХ рецепторов F -ni6pim(CBAxC57BL) МЦШЄН.

і. Многообразные эффекты морфина опосредуются взаимодействием наркотика с опиоидними рецепторами. .Поэтому било проведено исследование влияния длительной морфшшащш I) на свойства периферических опиоиддах рецепторов, расположенных на сємявиїюсящих протоках мышей; 2) «а поведедое опиоидшх рецепторов кори головного мозга мыте}}; 3) на механизм сопряжения опиондпых рецепторов с G-Оелками. Кроме того, были изучены сиетеки опиоидних рецепторов линий мышей с различной генетической чувствительностью к алкоголю - веществу, как и морфин, вызывающему физическую зависимость.

I, Кинетика изменения ингцйщщщего эффекта опиоидного пеп~

ГШОа [D-Ala², D-Leu*] - 'эНКефаМОШ Ш 9АЄКтрІІЧЄС№ СЩЩ)ЛируЄЯиЄ

сокращения семявыносящих протоков лышей в процессе морфинизацш.

Было показано, что длительная морфинизация мышей вызывает

двойную регуляцию s-опибидных рецепторов сємявиїюсящих протоков

мышей. Это видно . из рис.7, где кинетика изменения величины

Рис.7 Изменение в процессе

длительной морфинизации г -

?.

ГИбрИД(СВАхС57ВЬ) МЦШЄЙ ВЄ-

личины ed_5Q равной дозе

[0-А1а²,0-Ьеи⁶]-ЭНКефалшш ,

соответствующей ингибирова-нию электрически стимулируемых сокращений сємявиїюсящих протоков мишей на 50:

О - измерения в опите;

*х> t,s

О -контрольные измерения.

Е0_Г)О-дозн (п-Аія^г,п-ьєи⁵]-знкефзлина, соответствующей ингибиро-'
ватта электрически стимулируемых сокращений семявыносящих прото
ков мнтпеи на 50. имеет максимум. Увеличение ed₅₀ отражает
уменьшение чувствительности 6-ошюидных рецепторов, органов,
уменьшение ed₅₀ свидетельствует об увеличении .чувствительности
ошюидннх рецепторов. ' . ' '.".' .

3. Кинетика излечения характеристик колплексообразования и-и ь~опи.оивннх рецепторов' коры головного ;.",. лозга r_t-au6pud(CDAxc57BL) лышвй 6 процессе длительной лорфинизации.

На коре головного мозга г^гибрид мышей было показано сущвт-ствование двух и- и двух «-центров связывания ( Табл.1 ).'

Из анализа изотерм связывания ³h-dago на препаратах, мембран
морфшшэировэнннх и . контрольных,мыией обнаружено, что длительная
обработка морфином не влияет .на ,свойства центров связывания
іі-лиганда. -.... ;. ' _:, »-.';''''' ' -'^:-^:''.'.''' .-. .' .:

В отличие , от комплексообразования ³h-dago связывание
s-лигандэ ³ii-dslet с рецепторами препарата мембран "морфинизиро-: .
ванных мышей отлично от контрольных. .'...;.. .",;.*,г

Таблица I. Характеристики процессов комплексообразования . ,'

селективного и-лиганда.³h-dago и селективного .«-лиганда ³h-dslet с рецепторами кори головного мозга ,;_:.

F₍-ГИбрИД (CBAXC57BL) .мышей./-' "; V;^4~''";>^:-/'-\'У':^ЛЛ' V -.',

Анализ результатов по' связыванию, г-лиганда _;;'.;;,:;:'. ^:;.^;\ пока-" зал, что характеристики высокоаффинного центра связывания. (Q^ и к₂), а также концентрация супервысркоаффкнного центра связывания';.' (Q_t) не изменяются в процессе мЬрфишзайш.''':однако, наблюдается-уменьшение константы диссовдации.;(,..к₁).кошл&кса лиганда. с;'Су-,.^:_; первысокоаффинным центром.связывания .(рис.8)'/'-.: '";:. /';, ;'<.;:.,;;, Ч'^:.'.'

Различная регуляция в процессе морфинизации супервысоковф- ; фишшх центров .связывания и-,'-и *- лигэндов."подтверждает нашу,.ги--; .потезу о независимости, этих центров."-."..'^;,_; "-.;-'х-у'-' "і-:/У.л (S.'.¹''.''-?'-.

Рис,8 Кинетическая кривая изменения константы, диссоциации суііершсокоаффшшого б-центра связывания лиганда dsllt относительно контроля в процессе длительной морфшшзации

F -ГИйрИД (CI3AXC57BL) МЫШОЙ.

о го во loo t,a

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют oQ отсутствии изменений в характеристиках м-рецепторов, через которые, как известно, реализуются наркотические эффекты мордаша. Это полностью подтвервдает наш теоретически!! вывод о ;том, что кинетической особеїшостью формирования физической зависимости является медленная инактивация рецепторних систем.

3, Исследовсшие длительного введения, лорфина иа яежтизл сопряжения, рецепторов с а-белками?г

Взаимодействие ошюидных рецепторов с с-оелками является ключевым моментом передачи сигнала опиатов через клеточную мембрану. Изучено влияние 96-часовой '' морфиннзации к -гибрид (cbaxC57bl) мышей на сопряжение рецептора и G-белка.

Исследование начальной скорости ассоциации селективных и- и 5-агошістов ³h-dago и ³o-dslet показало, что прединкубация С GTP существенно не влияет на начальную скорость ассоциации лигандов на препаратах контрольных и морфшшзироваш-шх мышей.

Обнаружено значительное уменьшение скорости диссоциации ли-ганд-рецепторного комплекса под действием 0,1 мМ gtp на препаратах мембран коры головного мозга морфшизированных мышей (Табл,2) и, кроме того, уменьшение величины максимального инічі-Оирующего эффекта gtp. Как видно из Табл.2, 5-рецептори в большей степени подвержены изменениям, чем ii-рецепторы чоры головного- мозга.

V--

Таблица 2. Скорость диссоциации комплексов . лигандов

³Н-05ЬЕГ (2.5 НИ) И ³H-DAGO (2нМ) С РЄЦЄПТ0РЗМИ ПОД ДЄЙСТ-

вием 0,1 мМ gtp на препаратах мембран коры головного мозга морфинизировашшх и. контрольных мышей.

опыт

лиганд

II-DAGO

Скорость диссоциации, раси .7мин

контроль

ггооо

Б67'

Таким образом, в процессе формирования у.' мышей.
f-ги6ршцсвахс57вь') физической зависимости от морфина наблюда
ются изменения в системе передачи сигнала внутрь клетки (сопря
жения а- и б-рецепторов с с-белками), причем, для г-рецепторов
наблюдаемые изменения выражены в значительно" большей .степени,
чем для д-рецепторов," с которыми в первую очередь связывают нар
котические эффекты морфина. Длительная морфинизация не приводит
к существенному ухудшению в системе. сопряжения ц-реиепторов X
G-белками. ..'..''..'"'"''.'

4. ' Исследование различий систем.опиоидных рецепторов линий лышей с различной генетической чувствительностью к алкоголю. .'

Длительное употребление алкоголя, как и морфина, приводит к
формированию физической.' зависимости. Поэтому, мы исследовали
системы опиоидных рецепторов жяеотанх с различной генетической'.
чувствительностью к алкоголіз. В Тайя/ 3 приведены характеристики
комилексообразовзния'к- и і-'лвгтеов с рецепторами коры голов
ного мозга мышей линии с57ои,^:оіличаговд;уся повышенной восприим
чивостью к алкоголю, и мышей, линии db'a, невосприимчивых к алко-'.
голю. :..' ;"-. ,.''"'" ' ;''' '-:'-'' '.'.-''." ^:

Из результатов Табл.3 'видно,' Что-характеристики комплексо-образованяя ц-лигадна 'н-dago на препаратах мембран, .исследуемых линий мышей, 'одинаковы и удовлетворительно описываются моделью с двумя независимыми центрами связывания. ., ',-.' '"'. ''":..

В системе,г- опиоидных рецепторов линий мышей, отличающихся пристрастием к алкоголю, наблюдаются существенные отличия - от- сутствиэ супервнсокоафіинногб центра связывания лиганда ³h-dslet у овл мышей. ( Табл.З ).. Кроме того, на мембранных препаратах.

Таблица 3. Характеристики связывания лигандов ³h-dago и ³h-dslet на препаратах мембран коры головного мозга мышей

ЛИНИЙ C57BL И DBA. В ТЭбЛИЦв ПреДСТЗВЛвНЫ ИеДИЗІШ ЗНЭЧеНИй.

I - супервдсокоаффинный центр; 2 - високоаф$гашип центр.

0.30

C57BL мышей константа диссоциации комплекса ³h-dslet и високоаф-фннно'го центра связывания хуже, чем константа диссоциаціш на препаратах мембран dba мышей.

Различия .систем 5-опиоидных рецепторов, возможно, лежат в основе различной генетической чувствительности к алкоголю.

Кроме того, мы показали, что длительная морфгашзация не влияет на свой.ства ^-рецепторов кори головного мозга dba мышеи.. Получешшй результат подтверждает вивод теоретического анализа о медленной инактивации рецепторов, отвечающих за эффекты наркотика и участвующих в формировании физической зависимости.

'/

ВИВОДИ І. Для описания .поведения рецепторно-ферментной системы в условиях длительного введения наркотика предложена, теоретически отісзиа и экспериментально подтверждена модель двойного действия физиологически активного вещества.

' 2. Впервые сформулированы кинетические принципы формирования физической зависимости: I) значительные отличия в характерних временах процессов деградации ключевого .продукта и фермента; 2) необходимость медленной инактивации рецепторов.

3. Показано, что при длительном введении морфина поведение дофэминергпческоп и серотонние.ргической систем моноаминов стриа-туиа описывается моделью двойного действия физиологически активного вещества.

4. Установлена различная регуляция гюрфиирм ,ц- и а- супер-высокоаффшшых центров связывания., wo «з-адетельствует о независимости этих" центров. - '.'

5. Обнаружено, что линии мышей., «эйтадавдио различной генетической чувствительность к алкоголю., имеют существенные отличия в системе ОПП0ИДІШУ. «-рецепторов.

6. Установлено,что длительная'морфшизаьш не вызывает.существенных изменений ошюїдашх v рецепторов , .с которыми связывают наркотические эффекты морфина, а также системы сопряжєшія м- рецепторов с g - белками. Это подтверждает'вывод теоретического анализа о медленной ішактивашш рецепторов как кинетической особенности рецентерно-фзрментной системы при формировании физической зависимости.