Введение к работе
Актуальность теми. В настоящее время очевидно, что варьирование надмолекулярной организации ферментов играет исключительно важную роль в регуляции их каталитической активности. Известно, что изменения надмолекулярных состава и структуры олигомерных ферментов могут сопровождаться их активацией (инактивацией), изменением параметров связывания субстратов. Кроме того, процессы изменения структурной организации окружающих фермент мебран, известные под названием лнпидного полиморфизма, также могут приводить к изменениям в организации ферментных комплексов и их активности. Изучение этих процессов в экспериментах in vivo затруднено из-за сложности организации живой клетки и одновременного протекания в ней множества взаимосвязанных процессов. Поэтому исследователи, как правило, используют для этой цели различные модельные системы. Одними из наиболее перспективных систем, моделирующих липидный полиморфизм биомембран, являются тройные системы поверхностно-активное вещество (ПАВ)-вода-органическнй растворитель. В таких системах при различных соотношениях концентраций компонентов могут образовываться агрегаты различной структуры , как бислойиые (ламеллярные), так и небислойные (мицеллярные, гексагональные, кубические).
Размер внутренней полости агрегатов ПАВ можно варьировать в широком диапазоне (от десятка до сотен и более А), изменяя степень гидратации ПАВ wQ - молярное отношение [Н20]/[ПАВ] в системе. В гидратированных ассоциатах ПАВ при различных степенях гидратации могут помещаться молекулы белков и белковые комплексы различных размеров.
Иными словами, тройные системы ПАВ-вода-органический растворитель могут служить матрицами регулируемого размера для сборки белковых комплексов различного состава и моделирования влияния процессов липидного полиморфизма на надмолекулярную организацию и каталитическую активность ферментов.
Цель работы. При выполнении работы были поставлены следующие основные задачи. Во-первых, исследовать возможность регуляции надмолекулярной структуры несферических субъединичных ферментов (алкогольдегидрогеназы из печени лошади и бактериальной формиатдегидрогеназы) в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель. Во-вторых, исследовать взаимосвязь надмолекулярной структуры этих ферментов и их каталитической активности в различных структурных типах агрегатов ПАВ в подобных тройных системах.
Научная новизна работы. На примере алкогольдегидрогеназы из печени лошади (АДГ) и формиатдегидрогеназы из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.IOl (ФАГ) показана принципиальная возможность регуляции надмолекулярной структуры олигомерных ферментов несферической формы в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель при изменении степени гидратации ПАВ.
Установлено, что зависимость каталитической активности этих
ферментов от степени гидратации обращенных мицелл имеет вид кривой с
несколькими максимумами, причем различные максимумы соответствуют
функционированию различных надмолекулярных структур. Впервые
установлено, что отдельные субъединицы бактериальной
формиатдегидрогеназы обладают каталитической активностью во всех фазах системы Аэрозоль ОТ1 -вода-октан. Показано, что в агрегатах ПАВ с ламеллярной и обращенной гексагональной структурой, также как и в обращенных мицеллах, молекулы ФАГ диссоциируют на субъединицы. На примере алкогольдегидрогеназы в обращенных мицеллах при оптимальной по каталитической активности фермента wQ обнаружено, что фермент претерпевает конформацнонные изменения, аналогичные тем, которые вызывает образование фермент-коферментного комплекса.
Научная и практическая значимость. Установленная в работе возможность использования агрегатов ПАВ различной структуры в качестве матрицы регулируемого размера для целенаправленного изменения надмолекулярной структуры олигомерных ферментов может быть положена в основу новой стратегии исследования взаимосвязи структуры и функции олигомерных ферментов, полиферментных систем и надмолекулярных комплексов других биополимеров.
Полученные результаты представляют практический интерес для моделирования природного окружения гидрофильных белков и понимания влияния структурной организации агрегатов ПАВ и липидов на каталитическую активность ферментов. Установленный факт диссоциации формиатдегидрогеназы на субъединицы может дать новую информацию о механизмах функционирования фермента в клетках.
Материалы диссертации используются в лекционных курсах, читаемых на кафедре химической энзимологии Химического факультета МГУ.
1. Аэрозоль ОТ (ЛОТ, натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты).
Апробаиия роботи. Основные результаты работы были представлены на 6 и 7 Международных конференциях молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехине, ЧСФР, 1989; Варна, НРБ, 1990).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (по структурным типам агрегатов ПАВ, свойствам ферментов в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель, краткой характеристике использовавшихся ферментов), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (из І53 наименований). Работа изложена на 10& страницах и включает 2. таблицы и ЗЛ рисунков.