Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Состояние сосудистой стенки у лиц с сахарным диабетом 2 типа 9
1.1.1. Состояние сосудистой стенки (скорость распространения пульсовой волны, толщина комплекса интима-медиа, эндотелиальная дисфункция, наличие атеросклеротических бляшек) у лиц с сахарным диабетом 2 типа 9
1.1.1.1. Состояние сосудистой стенки в зависимости от вариабельности гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа 21
1.2. Биология теломер (длина теломер, активность теломеразы) у лиц с сахарным диабетом 2 типа 24
1.3. Роль хронического воспаления и окислительного стресса в изменениях сосудистой стенки и биологии теломер 31
глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Дизайн исследования 41
2.2. Основные методы исследования 44
2.2.1. Лабораторные методы исследования 44
2.2.1.1. Определение длины теломер 45
2.2.1.2. Определение активности теломеразы 46
2.2.1.3. Определение показателей хронического воспаления и окислительного стресса 47
2.2.1.4. Оценка углеводного обмена 47
2.2.1.5. Определение вариабельности гликемии с помощью 3-суточного непрерывного мониторирования глюкозы 48
2.2.2. Инструментальные методы исследования 48
2.2.2.1. Дуплексное сканирование сонных артерий 48
2.2.2.2. Определение скорости распространения пульсовой волны 49
2.2.2.3. Оценка эндотелийзависимой вазодилатации 50
2.2.3. Методы статистического анализа 50
ГЛАВА 3. Результаты исследования 52
3.1. Характеристика лиц, включенных в исследование 52
3.2. Изучение наличия и характера взаимосвязи между состоянием сосудистой стенки и показателями углеводного обмена 53
3.2.1. Изучение скорости распространения пульсовой волны, толщины комплекса интима-медиа, наличия атеросклеротических бляшек, эндотелиальной дисфункции у лиц с сахарным диабетом 2 типа и без сахарного диабета 53
3.2.2. Изучение наличия и характера взаимосвязи между состоянием сосудистой стенки и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа 60
3.3. Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями углеводного обмена, длиной теломер и активностью теломеразы 63
3.3.1. Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями углеводного обмена (гликированным гемоглобином, глюкозой плазмы натощак, постпрандиальной гликемией, индексом HOMA-IR, С-пептидом, инсулином), длиной теломер и активностью теломеразы у лиц с сахарным диабетом 2 типа и без сахарного диабета 63
3.3.2. Изучение наличия и характера взаимосвязи между вариабельностью гликемии и длиной теломер, активностью теломеразы у лиц с сахарным диабетом 2 типа 72
3.4. Изучение состояния сосудистой стенки в зависимости от длины теломер, активности теломеразы у лиц с сахарным диабетом 2 типа и без сахарного диабета
3.5. Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса, биологией теломер ивариабельностью гликемии 86
3.5.1. Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и биологией теломер у лиц с сахарным диабетом 2 типа и без сахарного диабета 86
3.5.2. Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа 97
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 98
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Список сокращений и условных обозначений 126
Список литературы 128
- Состояние сосудистой стенки в зависимости от вариабельности гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
- Определение показателей хронического воспаления и окислительного стресса
- Изучение наличия и характера взаимосвязи между состоянием сосудистой стенки и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
- Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
Введение к работе
Актуальность темы. СД – хроническое заболевание, достигшее масштабов эпидемии на фоне старения населения во всем мире. По данным Международной диабетической федерации от 2015 г. число людей с СД в мире составляет 415 млн., к 2040 г. распространенность СД в мире составит 643 млн. человек. СД 2 сопровождается развитием микрососудистых и макрососудистых осложнений, отягощает прогноз ССЗ и значительно повышает смертность населения (Дедов И.И. и др., 2011).
Результаты экспериментальных работ показывают, что нарушения углеводного обмена вызывают ускоренные изменения сосудов (Scuteri A, et al., 2004). Было установлено, что высокий уровень глюкозы способствует изменениям эндотелиальных клеток, дисфункции эндотелия (Ravikumar R, et al., 2002; Scuteri A, et al., 2004), повышению жесткости сосудистой стенки (Lilitkarntakul P, et al., 2012). ИР является предиктором развития атеросклероза и сердечно-сосудистых событий независимо от других факторов риска, включая уровень липидов (Behrendt D, et al., 2002), и может приводить к повышению жесткости сосудистой стенки (Rajendran P, et al., 2013). Существенную роль в сосудистых изменениях играет не только хроническая гипергликемия, но и вариабельность гликемии. Колебания гликемии в большей степени, чем хроническая гипергликемия, вызывают активацию окислительного стресса, хронического воспаления, усиление гликирования протеинов (Monnier L, et al., 2008), что приводит к развитию ЭД , атеросклероза (Saisho Y, 2014).
Остается неизвестным, с чем в большей степени связано изменение сосудистой стенки у пациентов с СД 2: с воздействием основного заболевания или запрограммированными механизмами старения на молекулярном и клеточном уровнях. Возможно, одной из причин разной скорости сосудистых изменений у пациентов с СД 2 является изначально разная «генетическая защищенность» сосудов от воздействия внешних факторов, в т. ч. гипергликемии.
Одними из наиболее обсуждаемых в настоящее время генетических маркеров старения являются ДТ и АТ, объединенные в понятие биологии теломер. Теломеры – концевые участки линейной молекулы ДНК, состоящие из повторяющейся последовательности нуклеотидов TTAGGG и защищающие концы хромосом от деградации и слияния. Теломерная ДНК соматических клеток постепенно укорачивается при каждом делении клеток вследствие неполной репликации концевых участков и при достижении критически низкой длины вызывает старение клетки (Samani NJ, et al., 2001; Qi NW, et al., 2015). Теломераза – это синтезирующий теломерную ДНК на концах хромосом с использованием своего компонента рибонуклеиновой кислоты в качестве матрицы. В большинстве соматических клеток АТ достаточно низкая, что приводит к старению клеток. Активная теломераза помогает
даже очень коротким теломерам функционировать (Blackburn EH, 2002). В клинике определяют относительную ДТ в лейкоцитах периферической крови, которая отражает ДТ в стволовых клетках и соответствует ДТ в эндотелиальных прогениторных клетках, что позволяет рассматривать этот показатель как биомаркер старения сосудов (Sharpless NE, et al., 2007).
ДТ и АТ – генетически детерминированные параметры, но изменение их происходит и под влиянием внешних факторов: хронических заболеваний, состояния окружающей среды, образа жизни (Okuda K, et al., 2000; Aviv A, 2004). Одним из механизмов изменения биологии теломер у больных СД 2, может быть развитие окислительного стресса и хронического воспаления (Inoguchi T, et al., 2000). Высокая активность окислительных реакций при СД 2 коррелирует с выраженностью сосудистых осложнений (Drge W, 2002) и может приводить к укорочению теломер, чувствительных к воздействию активных форм кислорода (Murillo-Ortiz B, et al., 2012; Ma D, et al., 2013).
Таким образом, в настоящее время недостаточно изучен вопрос взаимосвязи структурно-функциональных изменений сосудистой стенки и процессов репликативного клеточного старения у пациентов с СД 2. Недостаточно изучена связь выраженности окислительного стресса, хронического воспаления и нарушений углеводного обмена с биологией теломер. Остается малоизученной связь вариабельности гликемии с изменениями сосудистой стенки и биологией теломер у лиц с СД 2.
Цель исследования. Изучить наличие и характер взаимосвязей между состоянием сосудистой стенки, показателями углеводного обмена, окислительным стрессом, хроническим воспалением и биологией теломер в зависимости от наличия СД 2.
Задачи исследования:
1. Изучить взаимосвязь между параметрами сосудистой стенки (СРПВ, ТКИМ,
количеством АСБ, ЭЗВД) и показателями углеводного обмена (HbA1с, ГПН, ППГ,
HOMA-IR, С-пептидом, инсулином) у лиц с СД 2 и без СД.
2. Установить наличие и характер взаимосвязи между показателями углеводного
обмена (HbA1с, ГПН, ППГ, HOMA-IR, С-пептидом, инсулином), ДТ и АТ у лиц с СД 2
и без СД.
-
Оценить состояние сосудистой стенки в зависимости от ДТ, АТ у лиц с СД 2 и без СД.
-
Определить наличие и характер взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и биологией теломер у лиц с СД 2 и без СД.
-
Изучить наличие и характер взаимосвязи между вариабельностью гликемии и показателями сосудистой стенки, хронического воспаления, окислительного стресса, биологией теломер у лиц с СД 2.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование состояния сосудистой стенки, углеводного обмена, биологии теломер, показателей хронического воспаления и окислительного стресса у пациентов без клинических проявлений ССЗ в зависимости от наличия СД 2. Впервые показано, что сосудистые изменения, степень выраженности хронического воспаления, окислительного стресса минимальны у лиц с СД 2 и «длинными» теломерами и сравнимы с показателями у здоровых людей. Впервые установлена независимая взаимосвязь АТ с СРПВ. В числе первых работ установлена независимая связь ДТ и АТ с параметрами углеводного обмена и показателями хронического воспаления (С-реактивным белком и фибриногеном).
В числе первых работ изучена вариабельность гликемии у лиц с небольшой длительностью СД 2 и исследована взаимосвязь вариабельности гликемии с субклиническими изменениями сосудистой стенки. Впервые изучена взаимосвязь вариабельности гликемии с ДТ и АТ у лиц с СД 2 и показана независимая обратная связь с ДТ.
Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы позволяют
рекомендовать ДТ в качестве биомаркера состояния сосудистой стенки у лиц с СД 2.
Установлена необходимость дальнейшего изучения биологии теломер для
подтверждения влияния «коротких» теломер на развитие сосудистых изменений у лиц с СД 2 и без СД.
Полученные данные позволят на основании ДТ лейкоцитов и показателей вариабельности гликемии выделять лиц, нуждающихся в более агрессивном контроле углеводного обмена для профилактики изменений сосудистой стенки. Работа вносит вклад в определение новых потенциальных мишеней для профилактики сердечнососудистых нарушений у лиц с СД 2.
Внедрение. Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу отдела изучения процессов старения и профилактики возраст-ассоциированных заболеваний ФГБУ «ГНИЦПМ» Минздрава России.
Апробация диссертации. Апробация диссертации состоялась 16 марта 2017 г. на заседании апробационной комиссии ФГБУ «ГНИЦПМ» Минздрава России.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 7 статей – в журналах, включенных в перечень ВАК РФ. Материалы работы представлены в виде устных докладов на II Всероссийском конгрессе с участием стран СНГ «Инновационные технологии в эндокринологии» (Москва, 2014), 50th EASD Annual Meeting (Вена, 2014), ESC Congress 2015 (Лондон, 2015) и в виде стендовых докладов на VI Всероссийском диабетологическом конгрессе (Москва, 2013), Artery 13 (Лондон, 2013), II Всероссийском конгрессе с участием стран СНГ «Инновационные технологии в эндокринологии» (Москва, 2014), научно-практической конференции с международным участием «Профилактика 2014» (Москва, 2014), ACC.14 (Вашингтон,
2014), EuroPrevent 2014 (Амстердам, 2014), 50th EASD Annual Meeting (Вена, 2014), Ageing Summit (Лондон, 2015), ЕСЕ 2015 (Дублин, 2015), AHA 2015 (Орландо, 2015), 52th EASD Annual Meeting (Мюнхен, 2016).
Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 150 страницах компьютерной верстки, состоит из введения, четырех глав, включающих: обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение полученных результатов; выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы, состоящего из 9 отечественных и 329 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 6 рисунками.
Состояние сосудистой стенки в зависимости от вариабельности гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
Для более четкого понимания участия нарушений углеводного обмена в развитии артериосклероза, кратко коснемся вопросов патогенеза жесткости сосудов. Артериальная жесткость зависит от структуры и функции сосудистой стенки. Увеличение жесткости артерий происходит в результате комплексного взаимодействия различных факторов, к которым относятся ЭД, повышение содержания коллагена с образованием поперечных связей между его волокнами, фрагментация и уменьшения содержания эластина, кальцификация сосудов, увеличение концентрации гликотоксинов и, как следствие, накопления КПГ [259, 337]. СД, АГ, возраст приводят к повышению жесткости сосудистой стенки различными, но синэргичными путями [337]. Ранее возраст-ассоциированные изменения в структуре и функции сосудистой стенки считались частью естественного старения, однако эта концепция изменилась, когда появились данные о раннем сосудистом старении [210] и ускоренном изменении сосудистой стенки при ССЗ и СД [16]. Возрастные изменения внеклеточного матрикса, медии и адвентиции лежат в основе формирующейся артериальной жесткости [289]. С возрастом в стенке аорты происходят такие дегенеративные изменения, как истончение и фрагментация волокон эластина под влиянием матриксных металлопротеиназ и высокой активности трансформирующего фактора роста -бета [99, 259], накопление коллагена под влиянием ангиотензина II и свободных радикалов [9], кальцификация медии, приводящие к увеличению ригидности аорты [337]. К кальцификации медии приводит трансформация гладкомышечных и эндотелиальных клеток в клетки, напоминающие остеобласты, остеокласты, хондроциты, нарушения метаболизма кальция, фосфора, витамина D [8].
Аналогично возрасту, АД, являющееся вторым важным фактором артериальной жесткости у лиц как с СД, так и без диабета, приводит посредством длительной пульсации в центральной артерии к структурным изменениям таких важных строительных белков сосудистой стенки, как коллаген и эластин, разрывам мышечных волокон [183]. Еще один важный фактор повышения жесткости сосудистой стенки – нарушения углеводного обмена, как у лиц с СД 2 типа, так и у лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе (НТГ). Гипергликемия приводит к повышению неферментативного гликирования протеинов и образованию КПГ с ковалентным перекрёстным связыванием молекул коллагена, повышением его ригидности и изменяет механические свойства интерстициальной ткани в стенке сосуда [50]. Процессу гликирования может подвергнуться и эластин [148]. Подобные работы по изучению роли нарушений углеводного обмена и КПГ в повышении сосудистой жёсткости проводятся и в группе здоровых без СД [140].
В настоящее время различные исследования подтверждают, что у лиц с СД 2 типа жесткость аорты и периферических артерий выше, чем у лиц без СД [64, 143, 152, 327] независимо от уровня САД [69, 250], и сравнима с показаниями сосудистой жесткости в аорте и периферических артериях у лиц без диабета, но на 15 лет старше [47]. Основной показатель сосудистой жесткости - СРПВ -может быть важным связующим звеном между СД и увеличенным риском ССЗ [276]. Повышенная артериальная жесткость позволяет предсказывать развитие преждевременной смертности, в том числе у пациентов с СД 2 типа [69]. Важно подчеркнуть, что независимая связь сосудистой жесткости и СД была установлена не во всех исследованиях. Как было отмечено Cecelja M. et al., СД был независимо связан с жесткостью сосудистой стенки только на 52% в различных исследованиях по сравнению с 90%-ой связью АД и возраста, более того СД определял только 5% изменений жесткости сосудистой стенки [54]. Вероятно, у пожилых пациентов с АГ СД - не основной фактор сосудистой жесткости. Независимые эффекты СД на жесткость сосудов маскируются ассоциацией СД с АГ [75]. В исследовании Webb D.R. et al., напротив, в общей группе с СД 2 типа и без диабета была установлена независимая связь показателей гликемии, ИР с артериальной жесткостью [319].
Артериальная жесткость может быть измерена различными путями, включая растяжимость аорты, СРПВ, индекс аугментации. Определение СРПВ в каротидно-феморальном (сонно-бедренном) сегменте, отражающая аортальную СРПВ, считается в настоящее время золотым стандартом в оценке артериальной жесткости [222] и является субклиническим маркером сердечно-сосудистого риска [162, 309]. В исследовании E. Kimoto в 2006 г. было установлено, что влияние СД 2 типа было более выражено именно на жесткость больших эластичных артерий (в сердечно-сонном и сердечно-бедренном сегментах), чем на жесткость мышечных артерий среднего размера (в сердечно-плечевом и бедренно-лодыжечном сегментах) [143]. Так же в исследовании Chirinos J.A. в 2013 г. на большой популяции лиц среднего возраста была показана связь СД 2 типа именно с аортальной жесткостью [64]. Необходимо отметить, что СРПВ, измеренная в бедренно-лодыжечном сегменте, коррелирует с СРПВ больших эластичных артерий [136].
Есть данные об увеличении жесткости отдельных артерий у пациентов с высоким риском СД 2 типа, имеющих избыточный вес, НТГ [256]. Изучение артериальной жесткости у пациентов с непродолжительным, неосложненным СД 2 типа и преддиабетом требует более подробного изучения. Учитывая множество метаболических изменений, сопутствующих СД, важно определить независимые факторы повышения жесткости сосудов, характерные для СД.
Существенное влияние на сосудистую жесткость оказывают различные параметры углеводного обмена, как у лиц с СД 2 типа [50, 144], так и у лиц без диабета [35]. Так, в исследовании Tedesco М. et al. у лиц с СД 2 типа была выявлена связь между тощаковой гликемией, ППГ, HbA1с и увеличенным СРПВ [290]. В исследовании Webb D.R. et al. в объединенной группе лиц с СД 2 типа и без диабета также было установлено, что гликемия натощак, ППГ через 2 часа и показатель ИР – индекс HOMA-IR, были независимо связаны с артериальной жесткостью после поправки на возраст, пол, среднее АД, частоту сердечных сокращений (ЧСС), ИМТ, функцию почек и лечение антигипертензивными препаратами [319]. В исследовании Kinouchi M. et al. напротив, в группе СД 2 типа была получена независимая связь HbA1 и плече-лодыжечной СРПВ в отличие от группы без диабета [145].
Роль ППГ в повышении сосудистой жесткости играет важную роль, как у лиц с СД 2 типа [240, 319], так и у лиц без СД [79, 121]. Значимость ППГ, измеренной на 30-й минуте орального глюкозотолерантного теста у лиц с нарушенной гликемией натощак (НГН) и СД 2 типа, в изменениях плече-лодыжечной СРПВ независимо от других факторов была подтверждена в исследовании Choi E.S. et al. [65]. Согласно результатам некоторых исследований ППГ играет большую роль в повышении сосудистой жесткости, чем тощаковая гликемия [114]. Li C.H. et al. обнаружили в своем исследовании, что плече-лодыжечная СРПВ увеличивается у лиц с НТГ или ранним СД в отличие от лиц с изолированной НГН [157]. Острая ППГ подавляет ЭЗВД, увеличивает окислительный стресс и воспалительный ответ в стенке сосуда, что приводит к атерогенезу, пролиферации гладкомышечных клеток и, в результате, к повышению сосудистой жесткости [214].
Роль тощаковой гипергликемии в повышении сосудистой жесткости, вероятно, связана в первую очередь с гликированием структурных белков (коллагена и эластина) с образованием КПГ, приводящими к снижению эластичности сосудистой стенки [8] и повышению в первую очередь жесткости периферических артерий (в плечевом и бедренном сегментах) [225]. Возможно, по этой причине в исследовании Smith A. связь между гликемией натощак и аортальной СРПВ у лиц с СД 2 типа выявлена слабая, что подтверждалось в многофакторном анализе [269]. В исследовании Chirinos J.A. et al. в 2013 г. также не было получено связи аортальной СРПВ с НГН [64]. Однако, в более позднем исследовании Blicher M. et al. в 2015 г. в популяции здоровых была установлена независимая связь между глюкозой плазмы натощак (ГПН) и аортальной СРПВ [35].
Определение показателей хронического воспаления и окислительного стресса
Относительная ДТ измерялась на геномной ДНК из периферических лимфоцитов. Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовавшаяся в работе более облегченная и быстрая по сравнению с методом блот-гибридизации по Саузерну и методом Fish [90].
Выделение ДНК: ДНК выделялась из 300 мкл замороженной крови с этилендиаминтетраацетатом при помощи набора Qiagen DNA blood mini kit согласно инструкции. Метод электрофореза с применением 0.8% агарозного геля позволил оценить качество выделенной ДНК. Концентрацию ДНК определяли при помощи прибора Nanodrop ND-1000.
Определение ДТ: с помощью ПЦР в реальном времени оценивали количество ДНК, имеющей теломерную последовательность в геноме, и ПЦР к однокопийному участку геномной ДНК. Принималась пропорциональность соотношений количеств теломерной матрицы и однокопийной матрицы ДТ [5]. Для контрольной ПЦР использовалась пара праймеров 36B4u CAGCA AGTGGGAAGGTGTAATCC и 36B4d CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA. Смеси аликвотились в 96-луночных планшетах по 16 мкл и к ним приливалось 4 мкл раствора анализируемой геномной ДНК с концентрацией 10 нг/мкл. Образцы смешивались, центрифугировались и амплифицировались в амплификаторе CFX96. Схема амплификации для теломерного ПЦР 95C 5 минут, затем 35 циклов 95С 20 сек, 54С 2 мин, затем плавление. Схема амплификации для контрольной ПЦР 95C 5 минут, затем 35 циклов 95С 20 сек, 58С 1 мин, затем плавление. При амплификации соответствующие теломерные и контрольные смеси занимают одни ячейки прибора. В каждом образце проводилось по три теломерные реакции и три контрольные реакции. Рассчитывалось различие пороговых циклов образования копий теломер и однокопийного гена и далее на основе этого -относительное значение ДТ. В качестве реперной точки использовалась геномная ДНК из клеточной линии HEK. Единица измерения – условные единицы (усл.ед.) [53].
АТ определялась по методике, описанной в работе NW. Kim с небольшими модификациями [142]. Теломеразная активность анализировалась на чисто выделенной моноцитарной фракции клеток крови (10000 клеток на анализ), на приборе CFX-96. Буфер с мягким детергентом применялся для лизирования моноцитарных клеток с последующим отделение экстракта. Клетки, полученные из моноцитарного кольца на градиенте плотности Ficoll и промытые буфером PBS ресуспендировались в следующем лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl или 10мМ HEPES-KOH, рН 7.5, 1.0 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 5 мМ -меркаптоэтанол, 5% глицерин, 0.5% CHAPS, 0.1 мМ PMSF), количество буфера (1 мл на 0,1-10 млн клеток) определялось требуемой концентрацией. Выдерживали во льду 30 минут, далее подвергали центрифугированию в течение 10 минут при 4 градусах на 15000 оборотах в минуту и выделяли раствор, образовавшийся над осадком. Экстракт разделяли на аликвоты с последующим криоконсервацией в жидком азоте. Полученный экстракт участвовал в проведении теломеразной полимеразной реакции. Готовилось 28 мкл смеси 1: 1х TRAP-буфер (1х TRAP-буфер: 20 мM HEPES-KOH pH 8.3, 1,5 мM MgCl2, 63 мM KCl, 1мM EGTA, 0,1 мг/мл BSA, 0,005% v/v Tween-20), по 20 мкM dNTP, 10 пмоль олигонуклеотида TS (AATCCGTCGAGCAGAGTT) и экстракт моноцитов, составлявших контрольную линию клеток. Смесь для полимеразной реакции выдерживали 30 минут при 25 градусах. Полученные продукты амплифицировались с применением полимеразной реакции в реальном времени. Количество продуктов, полученных в теломеразной реакции, было пропорционально АТ. К смеси добавляли 1,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“Хеликон”), 10 пмоль олигонуклеотида ACX (GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC) и Sybr Green I до 0.2x концентрации в финальной смеси и проводилась ПЦР-рв на приборе CFX-96: 35 c 94C, 35 с 50C 90 с 72C (30 циклов, амплификатор Mastercycler (“Eppendorf”, Германия)). Единицы измерения – условные единицы (усл.ед.).
Уровень высокочувствительного СРБ в крови определялся на анализаторе «Sapphire 400» (Niigata Mechatronics, Япония) с помощью набора реагентов «DiaSys» (Германия) методом кинетики фиксированного времени путем фотометрического измерения реакции антиген–антитело между антителами к человеческому CРБ, иммобилизованными на полистироловых частицах, и присутствующим в образце CРБ. Единицы измерения – мг/л. Референсные значения – 0,3–5,0 мг/л.
Уровень ФБГ в плазме определялся на автоматическом коагулометре ACL Elite фирмы «Instrumentation Laboratory» с помощью набора реактивов «HemosIL» методом Клауса. Единицы измерения – г/л. Референсные значения – 2–4 г/л.
Количественная оценка уровня ИЛ6 проводилась на анализаторе «Cobas 6000 e 601» (Roche Diagnostics GmbH) электрохемилюминисцентным методом, основанном на детекции эмиссии света, возникшей под воздействием электрического поля. Единицы измерения – пг/мл. Референсные значения – 10 пг/мл. Уровень МДА определялся фотометрическим методом. Единицы измерения – мкмоль/л. Референсные значения – 2,2–4,8 мкмоль/л.
Изучение наличия и характера взаимосвязи между состоянием сосудистой стенки и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
У лиц без СД была выявлена независимая положительная связь АТ с ТКИМ (р=0,035) (в уравнении с поправкой также на возраст, САД, НbА1с). В группе с СД 2 типа связи АТ с показателями сосудистой стенки не получено.
Был проведен многофакторный логистический регрессионный анализ, где в качестве предикторов использованы бинарные или ранговые показатели, продемонстрировавшие связь с показателями сосудистой стенки в результате многофакторного линейного регрессионного анализа. По данным логистического регрессионного анализа «короткие» теломеры ( 9,75 усл.ед.) в общей группе были связаны с увеличением шанса выявления повреждений сосудистой стенки – повышения СРПВ 10 м/с в 3 раза (2=9,43, p=0,002; ОШ=2,66; 95% ДИ 1,42-4,96), образования АСБ в 2,5 раза (2=7,55, p=0,006; ОШ=2,57; 95% ДИ 1,31-5,05), а «самые короткие» теломеры (QI ДТ) – с повышением ТКИМ 0,9 мм в 3 раза (2=7,51, p=0,006; ОШ=3,10; 95% ДИ 1,38-6,97). У лиц без СД «самые короткие» теломеры (QI ДТ) увеличивали шанс повышения СРПВ 10 м/с в 2,7 раз (2=4,18, p=0,041; ОШ=2,71; 95% ДИ 1,04-7,02). У лиц с СД 2 типа «короткие» теломеры были связаны с увеличением шанса снижения ЭЗВД, повышения СРПВ и ТКИМ (таблица 31).
Взаимосвязь показателей сосудистой стенки с длиной теломер в условиях вариабельности гликемии в группе лиц с СД 2 типа. В группе СД 2 типа был выполнен многофакторный линейный регрессионный анализ, в котором зависимыми переменными выступали изучаемые параметры сосудистой стенки, а в качестве независимых переменных были взяты ДТ, ГПН, НbА1с, традиционные факторы риска ССЗ и показатели ВГ (MAGE, SD, CONGA, MODD, MPPGE). Проведенный анализ подтвердил наличие независимой от показателей углеводного обмена, ВГ и традиционных факторов риска ССЗ, связи ДТ с СРПВ (р=0,014) (в уравнении с поправкой также на возраст, пол, САД, ГПН, MAGE) и ДТ с ЭЗВД (р=0,004) (в уравнении с поправкой также на возраст, пол, ДАД, ГПН, CONGA). Напротив, в анализе с зависимой переменной ТКИМ не было продемонстрировано независимой от ВГ связи ДТ с ТКИМ. Результаты многофакторного линейного регрессионного анализа представлены в таблице 32.
Примечание: SE- стандартная ошибка регрессии; р - коэффициент регрессии Достоверной связи ТКИМ и «самых коротких» теломер – QI ДТ при включении в многофакторный анализ показателя MAGE (в уравнении с поправкой также на возраст, пол, наличие АГ, НbА1с) не было получено (р=0,089).
Таким образом, показатели жесткости сосудистой стенки и признаки субклинического атеросклероза максимально выражены у пациентов с СД 2 типа и «короткими» теломерами, в свою очередь у пациентов с СД 2 типа и «длинными» теломерами состояние сосудистой стенки достоверно не отличается от лиц без СД, а эндотелиальная функция оказалась даже лучше в группе СД 2 типа. У пациентов с СД 2 типа «короткие» теломеры независимо от углеводного обмена, факторов риска ССЗ, связаны с жесткими сосудами, ЭД и субклиническим атеросклерозом (ТКИМ). Связь СРПВ и ЭЗВД с ДТ была независима также и от ВГ в отличие от связи ТКИМ и ДТ у лиц с СД 2 типа. В свою очередь у лиц без СД самые «короткие» теломеры (QI ДТ) связаны с повышением сосудистой жесткости, а в общей группе «короткие» теломеры оказались независимо связанными со всеми изучаемыми показателями сосудистой стенки, в том числе с количеством АСБ. АТ положительно связана с ТКИМ в группе лиц без СД и отрицательно с СРПВ в общей группе. У лиц с СД 2 типа не выявлено связи АТ с сосудистыми изменениями.
Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и биологией теломер у лиц с сахарным диабетом 2 типа и без сахарного диабета
Для оценки хронического воспаления в изучаемых группах применяли такие параметры, как СРБ, ФБГ, ИЛ6, для оценки окислительного стресса использовали МДА. Сравнительная характеристика показателей хронического воспаления и окислительного стресса представлена в таблице 33. Таблица 33. Характеристика показателей хронического воспаления и окислительного стресса в исследуемых группах
В группе СД 2 типа выявлено, что у пациентов с «короткими» теломерами в сравнении с пациентами с «длинными» теломерами выше уровни СРБ (p=0,021), МДА и ФБГ (р 0,05). В группе с «длинными» теломерами у лиц с СД 2 типа показатели воспаления и окислительного стресса не отличались от лиц без СД (таблица 34).
Сравнительный анализ лиц с СД 2 типа и без СД по состоянию хронического воспаления и окислительного стресса в группе «длинных» теломер и в группе «коротких» теломер выявил большую выраженность хронического воспаления в группе с СД 2 типа и «короткими» теломерами по сравнению с лицами без СД и «короткими» теломерами по уровню СРБ (р=0,046) и наличию гиперфибриногенемии (р=0,022). Напротив, в группе с «длинными» теломерами показатели хронического воспаления не различались между пациентами с СД 2 типа и без СД. Достоверных различий по уровню МДА ни в одной из групп не было выявлено (таблица 35).
В зависимости от АТ всем пациентам проводилось сравнение показателей хронического воспаления и окислительного стресса. Было выявлено, что в группе СД 2 типа активность маркеров хронического воспаления, окислительного стресса достоверно не различались между лицами с «высокой» и «низкой» АТ. У лиц без СД более высокие показатели ФБГ выявлены в группе с «высокой» АТ (р=0,034) (таблица 36).
Изучение наличия и характера взаимосвязи между показателями хронического воспаления, окислительного стресса и вариабельностью гликемии у лиц с сахарным диабетом 2 типа
Выявлено, что у пациентов с СД 2 типа ДТ в среднем короче, чем у лиц без СД (р=0,031), что согласуется с данными литературы [119, 170, 272, 326, 331]. При этом обе группы были сопоставимы по возрасту, но среди пациентов с СД 2 типа преобладал мужской пол (p=0,013), что могло быть одной из причин наличия более короткой ДТ у лиц с СД. В исследовании Sampson M. et al., напротив, не установлено связи между укорочением лимфоцитарной ДТ и показателями углеводного обмена – возможно, по причине малого количества пациентов в исследовании [253]. Выявлены не только достоверные различия по НbА1с, ГПН (р=0,007 и р 0,001, соответственно) и близкие к достоверным по ППГ (р=0,050) у пациентов с СД 2 типа в группах с «длинными» ( 9,75 усл.ед.) и «короткими» ( 9,75 усл.ед.) теломерами, но и отрицательная связь ДТ с ГПН в группе СД 2 типа и общей группе и с НbА1с - в общей группе. В группе без СД установлена также корреляционная связь ДТ с ППГ. По результатам многофакторного логистического регрессионного анализа в общей группе ГПН 6,1 ммоль/л увеличивала вероятность наличия «коротких» теломер ( 9,75 усл. ед.) в 4 раза (2=8,31, p=0,004; ОШ=3,92; 95% ДИ 1,55-9,94), НbА1с 6,5 % – в 3,4 раза (2=9,699, p=0,002; ОШ=3,41, 95% ДИ 1,58-7,37). Данные результаты могут указывать на повреждающее действие гипергликемии на показатель репликативного старения ДТ. Изменения гликемии в пределах референсных значений в постпрандиальный период у лиц без СД могут оказывать влияние на ДТ, однако данный факт требует уточнения на больших выборках.
Вывод о связи ДТ с отдельными показателями углеводного обмена был сделан и в ряде других исследований. Сходные результаты получены в исследовании Zee RY. et al., в котором на примере выборки из популяции Бостона была установлена связь ДТ с ГПН, НbА1с и наличием СД 2 типа [326]. В работе Adaikalakoteswari A. et al. также была установлена корреляционная связь ДТ с НbА1с в группе лиц с НТГ [11]. В исследовании Ma D. et al. в группе СД 2 типа 106 было получено значимое увеличение ДТ после лечения ситаглиптином, снижающим как ГПН, так и ППГ [170]. В недавнем исследовании, проведенном Zhou M. et al., аналогично нашим результатам, была подтверждена связь ДТ с НbА1с (r=-0,14, р=0,002) и ППГ на 120 минуте в ходе ОГТТ (r=-0,155, р=0,001), однако достоверной связи с ГПН не было установлено (r=-0,08, р=0,077) [335].
Наличие «короткой» ДТ согласно результатам исследования связано не только с нарушением секреции инсулина и последующей гипергликемией, но и с нарушением чувствительности к инсулину и развитием ИР как у лиц с СД 2 типа, так и у лиц, еще не имеющих СД. Получены достоверные различия по индексу HOMA-IR (p=0,008) у пациентов с СД 2 типа и по наличию повышенного индекса HOMA-IR (p=0,045) у лиц без СД в группах с «длинными» и «короткими» теломерами, а также независимая достоверная обратная связь ДТ с индексом HOMA-IR во всех изучаемых группах, с ИРИ и С-пептидом в общей группе. Наличие индекса HOMA-IR 2,5 в общей группе повышало шанс выявления «коротких» теломер ( 9,75 усл.ед.) в 3 раза (2=5,39, p=0,02; ОШ=2,84; 95% ДИ 1,18-6,86).
Сходные результаты были получены и в других исследованиях [4]. Исследование Gardner JP. в 2005 г. было одним из первых, в котором была установлена независимая связь индекса HOMA-IR c ДТ в молодой здоровой популяции [97]. В исследовании Valdes AM. et al. была доказана отрицательная связь между ДТ с ИР, лептином и ИМТ [303]. Во Фрамингемском исследовании установлено, что уменьшение ДТ у пациентов с АГ преимущественно связано с ИР, ассоциированной с хроническим воспалением и окислительным стрессом, вызывающими укорочение теломер [77]. Al-Attas et al. (2010 г.) также была показана достоверная связь между ИР, висцеральным ожирением и ДТ у арабов среднего возраста без гипергликемии [14]. Связь ДТ с уровнем ИРИ была продемонстрирована в работе Zee RY. Et al. [326]. Согласно результатам исследований, дефицит RAP1 – белка «шелтеринового» комплекса, обеспечивающего стабильность теломер, может возникнуть в условиях ИР [83]. И, напротив, в исследовании Zhou M. et al. (2016 г.) не получено у лиц с различной степенью нарушения углеводного обмена связи ДТ с HOMA-IR, ИРИ и С-пептидом [335].
В исследовании выявлено, что АТ у пациентов с СД 2 типа ниже, чем у лиц без СД, что согласуется с имеющимся немногочисленным данными на животных моделях [153]. В исследовании Ma D. et al., напротив, не было получено значимой разницы по уровню АТ между пациентами c СД 2 типа и без СД [170]. У лиц с СД 2 типа в группе с «низкой» АТ ( 0,46 усл.ед.) по сравнению с группой с «высокой» АТ ( 0,46 усл.ед.) выявлены больше значения ППГ (p 0,0001) и на грани статистической значимости значения ГПН (p=0,089). Установлена независимая отрицательная связь АТ с ГПН с (p=0,003) и НbА1с (p=0,035) в общей группе. ГПН 6,1ммоль/л увеличивала в общей группе вероятность наличия «низкой» АТ ( 0,46 усл. ед.) в 2,5 раз (2=4,51, p=0,034; ОШ=2,51; 95% ДИ 1,07-5,89). Полученные данные могут свидетельствовать о повреждающем действии гипергликемии на показатель репликативного старения АТ. Наличие более высокой ППГ в группе с СД 2 типа и «низкой» АТ может указывать как на снижение АТ в условиях высокой ППГ, так и на ухудшение углеводного обмена у лиц с «низкой» АТ, что требует дальнейшего изучения в проспективных исследованиях на больших выборках. Отсутствие в группе СД 2 типа независимой связи АТ с параметрами углеводного обмена и наличие связи только с повышенным уровнем ХС-ЛПНП свидетельствует о существовании иных факторов, воздействующих на АТ у лиц с СД 2 типа, возможно на более глубоком клеточном уровне и связанных с хроническим воспалением, что требует дальнейших исследований.