Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Современный взгляд на состав микробиоты кишечника 9
1.2 Состояние сосудистой стенки и микробиота кишечника 10
1.3. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний и микробиота кишечника 14
1.3.1. Возраст и микробиота кишечника 14
1.3.2. Пол и микробиота кишечника 16
1.3.3. Артериальная гипертония и микробиота кишечника 17
1.3.4. Липидный профиль и микробиота кишечника 19
1.3.5. Метаболизм глюкозы и микробиота кишечника 21
1.3.6. Ожирение и микробиота кишечника 23
1.3.7. Курение и микробиота кишечника 25
1.4. Системное вялотекущее воспаление и микробиота кишечника 25
1.4.1. Участие микробиоты кишечника в индукции системного вялотекущего воспаления 26
1.4.2. Участие микробиоты кишечника в подавлении системного вялотекущего воспаления 28
1.5. Питание и микробиота кишечника 30
1.5.1. Участие микробиоты кишечника в переваривании углеводов 32
1.5.2. Участие микробиоты кишечника в переваривании белков 34
1.5.3. Участие микробиоты кишечника в переваривании жиров 38
Глава 2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Предварительное обследование и набор пациентов 40
2.2. Основные методы исследования 44
2.2.1. Ультразвуковое дуплексное сканирование экстракраниального отдела брахиоцефальных артерий 44
2.2.2. Измерение скорости распространения пульсовой волны 45
2.2.3. Оценка выраженности хронического воспаления 45
2.2.4. Оценка характера питания 46
2.2.5. Анализ микробиоты кишечника 46
2.2.6. Статистический анализ. Биоинформатическая обработка 48
Глава 3. Результаты исследования 50
3.1. Общая клиническая характеристика участников исследования 50
3.2 Общая характеристика состава микробиоты кишечника участников исследования 51
3.2.1. Кластерный анализ 53
3.3 Взаимосвязь состава микробиоты кишечника и наличия факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний 56
3.3.1. Артериальная гипертония и микробиота кишечника 57
3.3.2. Ожирение и микробиота кишечника 58
3.3.3. Липидный обмен и микробиота кишечника 59
3.3.4. Углеводный обмен и микробиота кишечника 60
3.3.5. Возрастной риск, пол и микробиота кишечника 62
3.3.6. Курение и микробиота кишечника 62
3.4 Взаимосвязь состояния микробиоты кишечника и питания 63
3.4.1. Общая характеристика питания участников 63
3.4.2. Анализ с разделением образцов на кластеры по питанию доноров 64
3.5 Взаимосвязь состава микробиоты кишечника с хроническим воспалением 69
3.6 Взаимосвязь состава микробиоты кишечника с состоянием сосудистой стенки 71
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 75
Выводы 91
Практические рекомендации 93
Список сокращений и условных обозначений 94
Список литературы 96
- Состояние сосудистой стенки и микробиота кишечника
- Предварительное обследование и набор пациентов
- Анализ с разделением образцов на кластеры по питанию доноров
- Взаимосвязь состава микробиоты кишечника с состоянием сосудистой стенки
Состояние сосудистой стенки и микробиота кишечника
Как показали научные работы, деятельность кишечной микробиоты отражается на организме человека. В свою очередь пищевое поведение, образ жизни, генетические особенности оказывают влияние на состав нашего микробиома. В настоящей работе произведен поиск взаимосвязей микробиоты кишечника с состоянием стенки сосудов, а также с факторами, способствующими развитию возрастных изменений сосудистой стенки.
Как известно, основными изменениями сосудистой стенки являются атеросклероз – локальный воспалительный процесс в интиме сосудов, приводящий к образованию атеросклеротических бляшек, и повышение жесткости сосудистой стенки, или артериосклероз – диффузный процесс в медии, сопровождающийся увеличением продукции коллагена и уменьшением количества эластина. Эти процессы тесно связаны между собой. В зависимости от множества факторов, у кого-то они развиваются быстрее, у кого-то медленнее. Исследования последних лет позволяют предположить, что одним из игроков на этой арене является кишечная микробиота, метаболический потенциал которой по насыщенности не уступает, а возможно, и превосходит потенциал организма человека.
Так, хроническое воспаление и окислительный стресс – пусковые механизмы изменений сосудистой стенки – фактически напрямую могут стимулироваться продуктами жизнедеятельности бактерий кишечника. Таким образом, микробиота опосредованно влияет на состояние стенки сосудов, однако суть взаимодействий работы микробиоты и сосудистой стенки изучена слабо.
К настоящему моменту работ по изучению взаимосвязи жесткости сосудистой стенки и состава микробиоты практически нет, возможно, это связано с тем, что жесткости сосудов придается меньшее значение, нежели атеросклеротическим изменениям, связь с микробиотой которых все чаще обсуждается в научных публикациях. И, говоря о механизмах связи состояния микробиоты с патологией сосудов, нельзя не выделить ТМАО - триметиламин-N оксид. Триметиламин (ТМА) ферментируется бактериями кишечника из таких веществ, как холин (витамин В4), фосфатидилхолин (ФХ), бетаин и L-карнитин, в дальнейшем ТМА всасывается в кровь, транспортируется в печень и окисляется 3 флавин-содержащей монооксигеназой (FMO3) до ТМАО. Продукты метаболизма ТМАО в основном выводятся с мочой. Часть ТМАО преобразуется в диметиламин (ДМА) и триметиламин микроорганизмами кишечника (в основном в толстой кишке). ДМА также реабсорбируется из кишечника и выводится из организма через мочевыводящие пути [18].
Связь потребления фосфатидилхолина и образования ТМАО, а также прямую корреляцию этих соединений с повышенным риском атерогенеза, на мышах показали в своей работе Wang и соавт. Было описано, что преобразование фосфатидилхолина в ТМАО происходит по схеме: ФХ холин TMA TMAO [19]. Прием антибиотиков, как было показано в последующем эксперименте тех же авторов, снижает уровни ТМАО в крови и моче, что подтверждается и другими исследователями [20].
Несколько масштабных работ показали, что уровень холина в плазме повышен у пациентов с ССЗ, и находится в прямой корреляционной зависимости с риском острого коронарного синдрома [21]. С атеросклерозом сонных артерий связывают регулярное потребление большого количества яичного желтка [22]. А в недавнем исследовании повышение ТМАО в сочетании с высокими уровнями холина и бетаина в плазме оказалось ассоциировано с 1,9 и 1,4-кратным повышением риска наступления острых кардиоваскулярных событий соответственно [23]. Повышение ТМАО оказалось предиктором развития кардиоваскулярных событий, причем как в группах высокого кардиоваскулярного риска, так и с меньшим числом факторов риска [24]. С другой стороны, есть и работы, опровергающие данную теорию и связь ТМАО с атерогенезом или острым коронарным синдромом и даже доказывающие обратное [25, 26].
Потребление L-карнитина (в составе продуктов питания) также ведет к образованию ТМАО посредством ферментации микробиотой кишечника, высокий уровень карнитина ассоциирован с развитием ССЗ и наступлением кардиоваскулярных событий [18]. На животных было показано, что питание богатое карнитином ведет к развитию атеросклероза, а назначение антибиотиков улучшает состояние сосудов. Однако результаты на животных нужно интерпретировать с осторожностью, т.к. дозы карнитина слишком высоки в пересчете на человека, человек не смог бы потребить столько карнитина с пищей, и к тому же мясо является и источником холина, и сложно судить о том, что в большей степени влияет на результат. И, например, по данным мета-анализа 2013 года [27] применение L-карнитина снижает на 27% смертность от всех причин, на 65% предсердные аритмии, на 40% симптомы стенокардии после перенесенного инфаркта миокарда. Также и более ранние исследования говорят о прямом и непрямом кардиопротективном действии L-карнитина и у животных [28, 29]. Таким образом, данная теория все еще остается вопросом для дискуссии.
Применение антибиотиков, пробиотиков, изменение диеты и уменьшение потребления холина и фосфатидилхолина – все это влияет на продукцию ТМАО [24, 30]. Brugere и соавт. показали, что некоторые представители Archaea, например, Methanomassiliicoccus luminyensis, могут препятствовать развитию атеросклероза, блокируя синтез ТМАО. Бактерии ферментируют ТМА до метана в кишечнике, тем самым препятствуют образованию ТМАО в печени. Терапевтическое назначение ферментов, вырабатываемых этими Археями снижает уровень ТМАО [18].
Еще один способ блокировать продукцию ТМАО в печени - воздействие на флавин-содержащую монооксигеназу 3 (FMO3) – фермент, отвечающий за преобразование ТМА в ТМАО. Например, индолы, содержащиеся в брокколи, брюссельской капусте, сельдерее, редисе и других продуктах, ингибируют FMO3. Противовирусные препараты ациклические нуклеозидные фосфонаты также обладают ингибирующим воздействием на активность FMO3 [31]. Гены, ответственные за экспрессию FMO3 обладают полиморфизмом, который обуславливает разные уровни активности этого фермента и, таким образом, различные уровни ТМАО [32]. Хотя есть данные о том, что диета имеет большее влияние на продукцию FMO3, нежели генетический аппарат, что показали Hartiala и соавт. в своем недавнем исследовании [33].
Kuka и соавт. изучали эффекты мельдония – синтетического аналога Y-бутиробетаина, предшественника карнитина, было доказано, что он снижает продукцию ТМАО из ТМА из L-карнитина, но не из холина [34]. Однако и эти данные были поставлены под сомнение недавним исследованием, в котором показано, что Y-бутиробетаин – это один из основных метаболитов, продуцируемый микробиотой из L-карнитина у мышей, и в кишечнике бактериями преобразуется в ТМА и в ТМАО, и повышает риск развития атеросклероза, причем несмотря на структурное сходство Y-бутиробетаина и L-карнитина, употребление в пищу продуктов, богатых этими соединениями стимулирует рост функционально отличных микроорганизмов, способных метаболизировать Y-бутиробетаин или L-карнитин [35].
Помимо широко обсуждаемого влияния ТМАО и роли микробиоты в его образовании, можно выделить множество других факторов, посредством которых состав микробиоты кишечника оказывает влияние на развитие изменений сосудистой стенки, к ним можно отнести взаимосвязи с факторами риска ССЗ, некоторые недавно обнаруженные механизмы, например, активация специфических обонятельных рецепторов Olfr78, и конечно, влияние микробиоты на работу иммунной системы. Современное понимание этих взаимодействий изложено далее.
Предварительное обследование и набор пациентов
В соответствии с поставленными задачами было проведено неинтервенционное одномоментное исследование. Протокол исследования был рассмотрен одобрен местным этическим комитетом. Выборка была сформирована из практически здоровых мужчин и женщин в возрасте 25 лет и старше, не имеющих жалоб и клинических проявлений хронических неинфекционных заболеваний, которые обращались в «ГНИЦПМ» Минздрава России для прохождения профилактического консультирования, проживающие на территории Москвы и Московской области не менее четырех лет. Работа проведена в ФБГУ «ГНИЦПМ» Минздрава России, в Отделе изучения процессов старения и профилактики возраст-ассоциированных заболеваний в соответствии с фрагментом научно-исследовательской работы по теме «Комплексное изучение процессов старения с оценкой сосудистых, генетических, клеточных и метаболических маркеров». Пациентам была предоставлена исчерпывающая информация об исследовании, каждым участником подписано письменное согласие на участие в исследовании. Оригинал подписанного согласия на участие хранится в индивидуальной папке каждого пациента. Конфиденциальность персональных данных пациентов обеспечена с использованием идентификационных кодовых номеров для идентификации пациентов в компьютерной базе данных и компьютерных файлах. Участник выбывал из исследования на любом этапе при обнаружении критериев исключения.
Критериями исключения считались: признаки наличия атеросклеротического поражения сосудов (цереброваскулярные заболевания, все формы ишемической болезни сердца и другие клинические сердечно-сосудистые нарушения); артериальная гипертония 2 и 3 степени (и/или прием антигипертензивной терапии, за исключением впервые выявленной гипертонии 1 степени, не требующей назначения гипотензивной терапии и носившей транзиторный характер); кардиомиопатии, наличие гипертрофии миокарда левого желудочка (индекс массы миокарда левого желудочка 131 г/м2 у мужчин и 113 г/м2 у женщин); нарушения ритма и проводимости сердца (пароксизмальные нарушения ритма сердца, мерцательная аритмия, синдром слабости синусового узла, атриовентрикулярная блокада II и III степеней); клапанные патологии сердца; сахарный диабет I типа и другие эндокринные заболевания (за исключением впервые выявленного сахарного диабета 2 типа); сахарный диабет с микрососудистыми, макрососудистыми и другими осложнениями, прием противодиабетической терапии, заболевания щитовидной железы в анамнезе; хроническая почечная, сердечная, печеночная недостаточность; онкологические заболевания в анамнезе; аутоиммунные заболевания; морбидное ожирение (ИМТ 40 кг/м2); наличие в анамнезе воспалительных заболеваний кишечника, наличие диспепсических явлений, включая констипацию или диарею, регулярный прием любых лекарственных препаратов, а также антибактериальных в течение 3 предшествующих месяцев, беременность и период лактации; отказ от участия в исследовании.
Предварительное обследование пациентов для определения соответствия критериям включения состояло из двух этапов.
Первый этап. Проводился в «ГНИЦПМ», включал анализ историй болезни пациентов, сбор анамнестических данных, физикальный осмотр с измерением частоты сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), уровня артериального давления (мм рт. ст.), а также взвешивание, измерение роста пациента, расчет индекса массы тела (ИМТ), определение окружности талии, бедер. Масса тела измерялась c точностью до 0,1 кг с использованием медицинских весов, а рост пациентов – с точностью до 0,5 см с использованием ростомера. По стандартной формуле Кеттле определялся ИМТ: [ИМТ = масса тела(кг) / рост(м2)]. АД измерялось с использованием тонометра HEM-7200 М3, Omron Healthcare (Япония), в соответствии с нормами – по методу Короткова не менее двух раз в положении сидя с промежутком не менее чем в 1 минуту (в случае, если различия АД были 5 мм рт. ст., АД измерялось повторно). В случае повышения АД 140/90 участнику назначался повторный визит через один месяц, в ходе которого вновь измерялось АД. При значениях АД 140/90 мм рт. ст. на обоих визитах с интервалом в месяц согласно клиническим рекомендациям Российского медицинского общества по артериальной гипертонии и Всероссийского научного общества кардиологов 2010 г диагностировалось наличие гипертонии. При выявлении каких-либо симптомов, анамнестических данных о наличии ССЗ и других тяжелых хронических или острых заболеваний, пациент не включался в исследование.
На втором этапе предварительного обследования был осуществлен забор венозной крови для проведения анализов крови (общего клинического и биохимического с определением уровней глюкозы, ОХС, триглицеридов (ТГ), ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП, натрия, калия, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, билирубина, мочевой кислоты, уровня тиреотропного гормона, креатинина, мочевины. Значения ОХС, ТГ и ХС-ЛПВП измерялись с использованием наборов «Diasys» (Германия) ферментативным колориметрическим методом. Концентрация ХС-ЛПНП определялась с ипользованием формулы Фридвальда: [ХС-ЛПНП = ОХС – (ТГ/2,2 + ХС-ЛПВП)].
Всем участникам старше 45 лет, при наличии абдоминального ожирения, повышении АД, наличии анамнестических данных о семейном СД-2 или гестационном СД-2, а также с уровнем глюкозы натощак 6,1-6,9 ммоль/л проводился пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ). Были строго исключены на время проведения ПГТТ прием пищи и воды, курение, физические нагрузки. Забор крови происходил с 8:00 до 9:00 часов утра после 12 часов голодания, после чего пациенты принимали внутрь растворенную в воде глюкозу (75 г), и далее спустя 2 часа кровь забиралась повторно. В соответствии с требованиями «Федеральной системы внешней оценки качества» осуществлялись стандартизация и контроль качества измерения биохимических параметров.
Для оценки анатомического и функционального состояния сердца, сократимости миокарда, состояния клапанного аппарата осуществлялась электрокардиография (ЭКГ) в 12 отведениях с использованием электрокардиографа Schiller Cardioovit AT-10 (Швейцария) и трансторакальная эхокардиография (ЭХО-КГ), проводившаяся по стандартной методике на приборе Philips iE-33 (Нидерланды) с измерением параметров структурных и функциональных параметров сердца (с применением допплеровского исследования трансмитрального потока и миокардиальной тканевой допплерографии). Также проводился тредмил-тест (проба с физической нагрузкой) на приборе Bruce Intertrack, Schiller (Швейцария) для исключения наличия ишемии миокарда.
В ходе предварительного обследования осуществлялась оценка факторов кардиоваскулярного риска, которыми считались:
1) Наличие АГ 1 степени (только впервые выявленной, носящей транзиторный характер, не требующей назначения гипотензивной терапии, в соответствии с критериями включения), уровень АД 140/90-159/99 мм рт. ст.;
2) Нарушения метаболизма глюкозы, включая впервые выявленный сахарный диабет 2 типа, диагностировавшийся при уровне в венозной плазме тощаковой глюкозы 7,0 ммоль/л или 11,1 ммоль/л через 2 часа после ПГТТ или нарушение толерантности к глюкозе (НТГ): уровень глюкозы 7,0 ммоль/л и спустя 2 часа после ПГТТ 7,8 и 11,1 ммоль/л, а также гипергликемию натощак: при уровне глюкозы натощак 6,1 и 7,0 ммоль/л в венозной плазме [187];
3) Дислипидемия, диагностировалась при наличии хотя бы одного из следующих изменений: ОХС 5,0 ммоль/л и/или ТГ 1,7 ммоль/л и/или ХС-ЛПВП 1,0 ммоль/л у мужчин и 1,2 ммоль/л у женщин и/или ХС-ЛПНП 3,0 ммоль/л;
4) Наличие ожирения, диагностировалось при значении ИМТ 30 кг/м2 или избыточной массы тела при ИМТ 25-29 кг/м2 или абдоминального ожирения, которое диагностировалось при значении окружности талии 94 см для мужчин и 80 см для женщин [188];
5) Курение, вне зависимости от стажа курения и количества сигарет. После предварительного обследования испытуемым, включенным в исследование, были проведены основные методы исследования – анализ состояния сосудистой стенки, анализ состава микробиоты кишечника, оценка уровней маркеров вялотекущего воспаления и анализ характера питания.
Анализ с разделением образцов на кластеры по питанию доноров
С целью анализа конкретных типов диет и их ассоциации с составом микробиоты кишечника, 86 образцов, для которых были данные и по диете и по таксономическому составу микробиоты, были разбиты на кластеры двумя методами. При анализе клинических данных доноров в этом кластере были также определены различия в наличии нарушений углеводного обмена.
В первую очередь образцы были поделены на 2 кластера методом k-медоид по матрице расстояний Брэй-Кертиса, построенной по процентному составу белков, жиров и углеводов в рационе доноров.
Эти 2 кластера диеты имеют достоверные различия по процентному соотношению белков, жиров и углеводов (p 0,001 для всех нутриентов). В первом кластере 64 образца, во втором – 22. Первый кластер характеризуется большей долей углеводов в рационе, во втором – больше потребление жиров и белков (Рисунок 12).
Во втором диетическом кластере оказалась почти в 2 раза больше доля образцов от доноров с впервые выявленным СД-2 (15,6% в первом кластере и 32% во втором кластере) (Рисунок 13).
Образцы из этих кластеров не различаются по возрасту, полу и ИМТ (p = 0,5, 0,25, 0,4 соответственно). Образцы из этих 2 кластеров по питанию различаются по двум бактериальным родам: у доноров, придерживающихся белково-жировой диеты больше представленность рода Bacteroides (р = 0,0001) и меньше рода Prevotella (р = 0,0004).
Ни обобщенный линейный анализ, ни тест Манна-Уитни не выявил различий в таксономическом составе образцов с изучаемыми факторами риска или изменениями сосудистой стенки в первом диетическом кластере.
Во втором диетическом кластере было найдено различие между образцами от здоровых доноров и доноров с СД-2 по представленности рода Prevotella (растет в группе СД-2, р 00,1) (Рисунок 14).
Однако тренд неочевиден, что может быть связано с довольно широким разбросом по составу нутриентов рациона (так, доноры с нарушениями углеводного обмена, чьи образцы попали во второй диетический кластер, потребляют больше кальция по сравнению с другими донорами из того же кластера (p = 0,03)). Поэтому был использован аналогичный метод поиска оптимальных диетических кластеров, но количество кластеров определялось по индексу Калинского-Гарабача, с целью выявить образцы с максимально схожим питанием: так было найдено 10 кластеров (Рисунок 15).
Обращает на себя внимание группа образцов цианового цвета – доноры этих образцов питаются примерно одинаково, потребляя много жиров относительно других нутриентов, однако половина пребывает в норме, а другая – на ранней стадии диабета.
По возрасту, полу и количеству потребляемых калорий между этими двумя группами образцов различий нет (p = 0,8, 0,5 и 0,3 соответственно), так же как и по всем исследуемым элементам питания.
Был проведен регрессионный анализ для образцов из этого кластера и обнаружено, что в образцах от доноров с СД-2 из этого кластера по питанию выше представленность рода Blautia (р = 0,0001), что согласуется с выводами из предыдущих анализов настоящей работы (Рисунок 16).
Взаимосвязь состава микробиоты кишечника с состоянием сосудистой стенки
Среднее значение толщины КИМ среди участников составило 0,76 ± 0,2 мм (наибольшее из двух). Среди всех испытуемых у 20 человек толщина КИМ была 0,9 мм. Характеристика групп пациентов с и без утолщения КИМ представлена в Таблице 11.
Толщина КИМ была существенно больше у лиц с большей представленностью в микробиоте кишечника родов Blautia (р = 0,004) и Serratia (р = 0,009) (Рисунок 18).
Среднее количество бляшек (справа и слева) составило 1 ± 1,6, всего у 48 человек бляшки были хотя бы с одной стороны. Медианное значение степени стеноза составило 20% (межквартильный размах 35). Уровень стеноза сосудов был прямо взаимосвязан с большей представленностью бактерий рода Serratia (Таблица 12).
Среднее значение СРПВ составило 10,9 ± 2,6 м/с. СРПВ более 10 м/с была определена у 55 человек. Ниже представлена характеристика лиц с различной СРПВ (Таблица 13).
При первом рассмотрении всей выборки не было достоверных различий в составе микробиоты кишечника у пациентов с разной СРПВ. После разделения пациентов и изучения взаимосвязи СРПВ с составом микробиоты у испытуемых без СД-2, было обнаружено, что представленность грамотрицательных оппортунистических патогенов рода Bacteroides была достоверно выше у лиц с СРПВ = 10 м/с и более (Таблица 12). Таким образом, были обнаружены взаимосвязи состава микробиоты кишечника, в частности высокой представленности оппортунистических патогенов, способных инициировать воспаление, как с субклиническим атеросклерозом, так и с повышением жесткости сосудистой стенки.