Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Эволюция представлений о патогенезе атеросклероза 11
1.2. Маркеры воспалительной реакции как факторы неблагоприятного прогноза при ИБС 14
1.3. Роль клеточных субпопуляций и хемокинов в атерогенезе 19
1.4. Системное проявление реакции сосудистой стенки на эндоваскулярное лечение коронарных артерий 25
1.5. Эффекты статинов при лечении ИБС. Аторвастатин 28
1.6. Опыт применения высоких доз аторвастатина при ИБС. Результаты крупных рандомизированных клинических исследований 39
1.6.1. Терапия высокими дозами аторвастатина при стабильной cтенокардии 39
1.6.2. Терапия высокими дозами аторвастатина и баллонная ангиопластика коронарных артерий 45
Заключение обзора литературы 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Критерии включения в исследование 52
2.2. Критерии исключения из исследования 52
2.3. Характеристика пациентов, включенных в исследование 53
2.4. Клинико-инструментальное обследование пациентов, включенных в исследование 57
2.5. Получение образцов крови 58
2.6. Исследование содержания маркеров воспалительной реакции в периферической крови больных 59
2.7. Иммунофенотипирование клеток 59
2.8. Коронароангиография 60
2.9. Статистический анализ данных 62
Глава 3. Результаты исследования 65
3.1. Оценка содержания «растворимых» маркеров воспалительной реакции в крови пациентов на фоне терапии аторвастатином в дозе 80 мг/сут 65
3.2. Влияние терапии высокими дозами аторвастатина на показатели липидного профиля 69
3.3. Оценка безопасности терапии аторвастатином в дозе 80 мг/сут 71
3.4. Результаты контрольной коронароангиографии через 12 месяцев после коронарного стентирования 73
3.5. Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов и моноцитов в периферической крови пациентов на фоне терапии высокими дозами аторвастатина 85
4. Обсуждение результатов исследования 93
Заключение 109
Выводы 110
Практические рекомендации 111
Список цитируемой литературы 112
- Роль клеточных субпопуляций и хемокинов в атерогенезе
- Характеристика пациентов, включенных в исследование
- Оценка содержания «растворимых» маркеров воспалительной реакции в крови пациентов на фоне терапии аторвастатином в дозе 80 мг/сут
- Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов и моноцитов в периферической крови пациентов на фоне терапии высокими дозами аторвастатина
Роль клеточных субпопуляций и хемокинов в атерогенезе
На всех этапах формирования АСБ в ней обнаруживаются различные субпопуляции лимфоцитов: CD4+ Т-хелперные лимфоциты, CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты, естественные киллеры (NK), NKT-клетки, В лимфоциты, а также минорные субпопуляции, в том числе Т-рег. Среди всех Т клеток, присутствующих в АСБ человека, около 70% составляют СD4+ клетки, оставшуюся часть – СD8+ клетки и минорные субпопуляции [146]. Лимфоциты вносят существенный вклад в регуляцию воспалительного процесса. Так, субпопуляции Т-хелперов 1 типа, цитотоксических Т лимфоцитов, NK-, NKT-клеток оказывают проатерогенный эффект [93], в то время как Т-рег способны оказывать противовоспалительное и антиатерогенное действие, что было продемонстрировано в экспериментальных моделях у животных [192, 305]. Показана взаимосвязь иммунного дисбаланса, протекающего с подавлением регуляторного звена лимфоцитов, с прогрессирующим и нестабильным течением ИБС [243, 350].
В периферической крови человека естественные T-рег составляют 5-10% от CD4+ лимфоцитов и характеризуются высокой мембранной плотностью рецептора ИЛ-2 (идентифицируемого по -субъединице CD25) и низкой экспрессией рецептора ИЛ-7 (идентифицируемого по -субъединице CD127). Специфическим маркером Т-рег является наличие фактора транскрипции FOXP3 [24, 122]. Фенотипирование данной субпопуляции Т-лимфоцитов на основании анализа поверхностных маркеров (СD25highCd127low) с 96% специфичностью соответствует фенотипированию по FOXP3 [42, 120, 182].
Моноциты, участвуя в формировании врожденного и приобретенного иммунного ответа, играют одну из ключевых ролей в инициации и развитии АС [1]. Моноциты мигрируют из крови в обогащенные липопротеинами области интимы артерий и, под влиянием факторов (M-CSF и др.), продуцируемых активированным эндотелием, дифференцируются в макрофаги. Этот процесс контролируется хемотаксическими цитокинами (хемокинами), которые продуцируются клетками сосудистой стенки в месте ее повреждения [12]. Наиболее изученными из них являются МСР-1 (по номенклатуре хемокинов – ССL2), взаимодействующий с рецептором ССR2, и хемокин RANTES (от «regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted», CCL5), который вырабатывается активированными Т-лимфоцитами и связывается с рецепторами CCR1 и CCR5. Примечательно, что интенсивная терапия аторвастатином у пациентов с нестабильной стенокардией и ЧКВ способствовала подавлению экспрессии CCR2 на клеточной поверхности CD14+ моноцитов и ингибированию опосредованного МСР-1 хемотаксиса, по сравнению с контрольной группой [357].
Также известно, что в процессах формирования и дестабилизации АСБ важную роль играет единственный представитель семейства хемокинов CX3C – фракталкин (CX3CL1), рецептором которого является CX3CR1 [1, 134]. Так, в исследованиях у мышей было продемонстрировано существенное замедление атерогенеза при мутации гена фракталкина или делеции гена, кодирующего его рецептор [66, 311]. У CX3CL1-/- и CX3CR1-/- мышей, скрещенных с АроЕ-/моделью АС, отмечалось сниженное содержание макрофагов в стенке сосудов и замедление процесса образования АСБ, по сравнению с нормальными животными [174, 310]. На фоне терапии аторвастатином у мышей отмечалось снижение экспрессии МСР-1, CX3CL1 и их рецепторов CCR2 и CX3CR1, и MMPs, инфильтрации макрофагами и липидами субэндотелиального пространства, а также снижение активности коллагеназы и содержания коллагена в интиме. Число уязвимых АСБ в группе терапии было значительно меньше, по сравнению с животными группы контроля [221]. Моноциты поглощают окисленные липопротеины и другие проатерогенные молекулы и превращаются в характерные для АСБ пенистые клетки [300]. В крови человека присутствуют несколько популяций моноцитов, различающихся функционально и фенотипически. Гетерогенность моноцитов у человека впервые была описана Passlick c соавт. в соответствии с экспрессией кластера дифференцировки рецепторов клеточной поверхности CD14 (рецептор липополисахарида (ЛПС)) и CD16 (рецептор FCyIII) [232]. Моноциты принято подразделять на классическую (CD14++CD16-) и неклассическую субпопуляции (CD14+CD16+), однако, несколько лет назад Международным союзом иммунологов и ВОЗ была выделена также промежуточная (CD14++CD16+) субпопуляция [126, 366]. Разделение моноцитов на данные подмножества определяется их фенотипически различной экспрессией хемокиновых рецепторов и, соответственно, чувствительностью к различным хемокинам, что, в свою очередь, определяет их различные функциональные свойства и роль в контексте атерогенеза [118]. Классические CD14++CD16-моноциты (соответствуют Ly6C++CD43+ моноцитам у мышей) составляют около 85% всех циркулирующих в крови человека моноцитов и характеризуются высокой экспрессией CCR1, CCR2, CXCR2, FCyRI, CD62L, IL-6R, SR-A и CD36 и низкой экспрессией CX3CR1, HLA-DR, CD80 и CD86. Моноциты с данным фенотипом считаются провоспалительнымия: в ответ на различные сигналы от поврежденных и/или инфицированных тканей они мигрируют из костного мозга и резервуаров в селезенке в область повреждения и продуцируют воспалительные цитокины (например, ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО), трансформируясь в дальнейшем в воспалительные макрофаги [90]. Промежуточные CD14++CD16+ моноциты (Ly6C++CD43++ у мышей) составляют около 5% всех моноцитов. Эти клетки обладают высокой фагоцитирующей способностью и провоспалительными свойствами. Их профиль экспрессии частично пересекается с классическими и неклассическими моноцитами, для них характерна высокая экспрессия CCR5, CX3CR1, TLR4, CD163, Tie2, VEGFR1/2, CD80, CD86, CD105 и HLA-DR, а также продукция большого количества активных форм кислорода и воспалительных медиаторов (ФНО, ИЛ-1) [90, 125]. Однако имеются данные, согласно которым при стимуляции ЛПС in vitro увеличивается продукция противовоспалительного цитокина ИЛ-10 промежуточной субпопуляцией моноцитов человека [293]. Неклассические CD14+CD16+ моноциты (около 10%), соответствуют Ly6C+CD43++ моноцитам у мышей и экспрессируют наиболее высокие уровни CX3CR1, CD49d, SLAN и сиалофорина по сравнению с подмножествами классических и промежуточных моноцитов [58, 125, 133, 345]. Эти моноциты также называют репаративными или патрулирующими; они обладают уникальной способностью контролировать состояние сосудистой стенки за счет высокого уровня экспрессии рецептора CX3CR1 и экспрессировать высокие уровни про- и противовоспалительных факторов [90, 313]. У пациентов с АС и СД наблюдалось более высокое содержание CD14+CD16+ моноцитов по сравнению со здоровыми добровольцами, что позволяет предположить преимущественную роль этой субпопуляции в воспалительном ответе у данной категории пациентов [234]. В исследованиях, проведенных как у людей, так и на животных моделях, показано, что при аутоиммунных и воспалительных заболеваниях, в том числе и при АС, появление трех субпопуляций моноцитов является постепенным процессом, в котором классические моноциты покидают костный мозг и селезенку, способствуют дифференцировке моноцитов с фенотипом промежуточных, которые, в свою очередь, могут быть переходной стадией дифференцировки в неклассические моноциты. Эти результаты были подтверждены в генетическом исследовании у человека, в котором показано, что неклассические моноциты имеют более короткую длину теломер и считаются более зрелой субпопуляцией [202].
Характеристика пациентов, включенных в исследование
Согласно представленным выше критериям в исследование был включен 91 пациент: 69 мужчин (76%) и 22 женщины (24%). Средний возраст пациентов составил 60,5 ± 8,7 лет (от 34 до 79 лет). Постинфарктный кардиосклероз был в анамнезе у 58 пациентов (62%), артериальная гипертония отмечалась у 72 больных (78%), сахарным диабетом 2 типа страдали 13 пациентов (14%). На момент включения в исследование каждый пациент получал аспирин 100 мг/сут, клопидогрел 75 мг/сут, аторвастатин в дозе 20-40 мг/сут. Пациенты случайным образом были разделены на две группы, исходя из соотношения размеров групп 1:2.
Группу I составили 36 пациентов, у которых доза аторвастатина при включении в исследование была увеличена до максимальной (80 мг/сут). Больные данной группы получали аторвастатин в указанной дозе в течение недели до проведения коронарного стентирования и далее в течение 3 месяцев после вмешательства. Далее доза аторвастатина уменьшалась до исходной (20-40 мг/сут) и в последующем корректировалась в зависимости от уровня показателей липидного профиля в крови пациентов на основании действующих рекомендаций по диагностике и лечению хронической ИБС [10]. Группу II составили 55 пациентов, у которых коррекция исходной дозы аторвастатина (20-40 мг/сут) осуществлялась постепенно, исходя из содержания холестерина в крови согласно действующим рекомендациям [10].
Как показано в таблице 2, по основным клиническим характеристикам, данным анамнеза и факторам риска группы пациентов были сопоставимы, за исключением артериальной гипертонии, которая имелась у 34 пациентов (94%) из первой группы и у 38 пациентов (69%) из второй группы (р=0,003).
Каждому пациенту, включенному в исследование, выполнялось стентирование коронарных артерий с имплантацией от 1 до 3 стентов. В таблице 3 представлена ангиографическая характеристика пациентов, включенных в исследование. По числу гемодинамически значимо стенозированных коронарных артерий исходно группы больных были сопоставимы. Также обе группы были сопоставимы по количеству, диаметру и длине имплантированных стентов. Всем пациентам были имплантированы стенты с лекарственным покрытием (эверолимус).
Пациенты обеих групп получали на момент включения в исследование стандартную для больных ИБС терапию [10, 87]: аспирин, клопидогрел, статины, бета-блокаторы, при наличии показаний также назначались ингибиторы ангеотензин-превращающего фермента (иАПФ), антагонисты кальция, нитровазодилататоры, антикоагулянты. Как представлено в таблице 4, группы больных были сопоставимы по лекарственной терапии, за исключением приема иАПФ, которые получали 92% пациентов из группы I и 69% пациентов из группы II (р=0,01). Межгрупповое различие по приему иАПФ соответствовало таковому по наличию артериальной гипертонии у пациентов. Показания к назначению всех вышеописанных препаратов и их дозы определялись врачами амбулаторной практики до госпитализации больных; после поступления в стационар и дообследования пациентов медикаментозная терапия могла быть скорректирована.
Для исследования влияния приема максимальной дозы аторвастатина на субпопуляционный состав лимфоцитов и моноцитов, а также на экспрессию моноцитами хемокиновых рецепторов была дополнительно сформирована группа из 16 пациентов c хронической ИБС, ранее принимавших аторвастатин в дозе 20 мг/сут, которым в течение 7 суток доза аторвастатина была увеличена до 80 мг/сут.
Оценка содержания «растворимых» маркеров воспалительной реакции в крови пациентов на фоне терапии аторвастатином в дозе 80 мг/сут
Как представлено в таблице 5, исходное содержание вчСРБ в крови больных в обеих группах не имела статистически значимых различий. Медиана исходной концентрации вчСРБ в группе I составила 2,0 [1,0; 3,9] мг/л, а в группе II – 1,9 [1,2; 3,6] мг/л (р 0,05). В группе I при увеличении дозы аторвастатина с 20-40 мг/сут до 80 мг/сут в течение 7 суток произошло значимое снижение исходной концентрации вчСРБ в крови до 1,0 [0,7; 1,4] мг/л перед КС (р=0,01). В группе пациентов, продолжавших прием аторвастатина в дозе 20-40 мг/сут, в течение 7 суток перед КС концентрация вчСРБ в крови существенно не изменилась.
В таблице 5 и на рисунке 4 представлена динамика содержания вчСРБ в крови больных на фоне различных доз аторвастатина: высокой (80 мг/сут) и стандартной (20-40 мг/сут) в различные сроки после КС.
После выполнения КС на фоне продолжающейся терапии высокой дозой аторвастатина на протяжении 3 месяцев концентрация вчСРБ в крови существенно не менялась. После уменьшения дозы аторвастатина с 80 мг/сут до исходной (20-40 мг/сут) дозы у пациентов данной группы в течение 3 месяцев отмечалось статистически значимое увеличение концентрации вчСРБ в крови с 1,1 [0,7;1,8] мг/л до 1,8 [1,2;2,7] мг/л (р=0,04). В дальнейшем в этой группе пациентов содержание вчСРБ в крови существенно не изменилось: медиана концентрации вчСРБ в точке наблюдения 12 месяцев после КС составила 1,6 [1,2; 2,4] мг/л.
У пациентов из группы II на фоне приема аторвастатина в дозе 20-40 мг/сут значимое снижение исходной концентрации вчСРБ в крови было отмечено к 1 месяцу наблюдения: с 1,9 [1,2; 3,6] мг/л до 1,4 [0,7; 2,4] мг/л соответственно (р=0,04). При дальнейшем наблюдении в данной группе пациентов существенных различий в содержании вчСРБ в крови не отмечалось (см. табл.5).
Как уже упоминалось в предыдушей главе, исследование концентрации других маркеров воспалительной реакции (ММР-2, ММР-9 и TIMP-2) в крови было выполнено произвольно выбранным 15 больным (n=6 в контрольной группе и n=9 в группе приема аторвастатина 80 мг/сут) перед КС и в различные сроки после вмешательства. Определение концентрации фибриногена в крови производили в аналогичные сроки всем пациентам, включенным в исследование.
Как представлено в таблице 6, по исходным значениям концентрации в крови этих воспалительных маркеров обе группы значимо не различались между собой. Концентрация в крови фибриногена, ММР-9 и TIMP-2 в обеих группах значимо не изменялась на протяжении всего периода наблюдения.
В группе I при увеличении дозы аторвастатина с 20-40 мг/сут до 80 мг/сут в течение 7 суток отмечалось значимое снижение содержания ММР-2 в крови пациентов с 269 [234; 274] нг/мл до 223 [213; 242] нг/мл (р=0,04), сохранявшееся и в течение первого месяца после КС (230 [210; 248] нг/мл). К 3 месяцу наблюдения после КС концентрация ММР-2 в крови восстанавливалась до исходных значений (241 [228; 256] нг/мл) и в дальнейшем существенно не менялась даже при уменьшении максимальной суточной дозы аторвастатина до 20-40 мг/сут. В группе II на фоне постоянного приема аторвастатина 20-40 мг/сут статистически значимых различий в концентрации ММР-2 в крови пациентов за все время наблюдения не отмечено.
Изменения концентрации ММР-2 в крови пациентов обеих групп на протяжении года после стентирования представлены на рисунке 5.
Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов и моноцитов в периферической крови пациентов на фоне терапии высокими дозами аторвастатина
Отдельным этапом нашей работы явилось изучение субпопуляционного состава лимфоцитов и моноцитов в периферической крови пациентов на фоне кратковременной терапии аторвастатином в максимальной суточной дозе. В исследование было включено 16 пациентов со стабильной стенокардией напряжения II-III ФК в возрасте 62,9±7,6 лет, принимавших аторвастатин 20 мг/сут, и которым ранее не проводилась эндоваскулярная реваскуляризация миокарда. Доза аторвастатина была увеличена до 80 мг/сут на 7 суток. В течение этого срока было выявлено статистически значимое повышение содержания в периферической крови Т-рег как в абсолютном значении 83,6 [56,2; 89,7] до 109,5 [86,7; 127,6] х 1000/мл (р=0,07), так и в процентном отношении от общего количества лимфоцитов с 3,6 [2,4; 4,7] до 4,7 [3,0; 6,9] %, р=0,01 (рисунок 12).
Как представлено в таблице 15, при этом размер других популяций лимфоцитов не изменился. Значимых различий в размерах популяций классических и неклассических моноцитов также не обнаружено.
Медианы экспрессии моноцитами молекул CX3CR1 и CCR2 в течение недели снижались, но эти различия не отвечали критериям статистической значимости, р 0,05 (таблица 15). Оценка уровня экспрессии рецепторов хемокинов показала снижение количества ССR5 на поверхности моноцитов с 13,4 [10,0; 22,0] до 10,0 [6,5; 12,4] MFI (средняя интенсивность флуоресценции клеток), р=0,03 (рисунок 13).
На рисунке 14 представлен пример типирования Т-рег в периферической крови одного из пациентов при увеличении дозы аторвастатина с 20 мг/сут до 80 мг/сут в течение недели.
На рисунке 15 в качестве наглядного примера продемонстрирована динамика экспрессии ССR5 моноцитами у одного из пациентов в течение недели после увеличения дозы аторвастатина с 20 мг/сут до 80 мг/сут.