Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Механизмы неоангиогенеза при ишемической болезни сердца 10
1.2 Эндотелиальные прогениторные клетки: источники и фенотипы 22
1.3 Эндотелиальные прогениторные клетки и васкулогенез 23
1.4 Роль эндотелиальных прогениторных клеток в восстановлении функции эндотелия 24
1.5 Влияние факторов риска сердечно-сосудистых осложнений на эндотелиальные прогениторные клетки 26
1.6 Влияние сопутствующих заболеваний на эндотелиальные прогениторные клетки 31
1.7 Эндотелиальные прогениторные клетки в терапевтическом ангиогенезе 34
1.8 Влияние статинов на факторы ангиогенеза и эндотелиальные прогениторные клетки 38
Глава II. Материал и методы исследования 43
2.1 Материал исследования 43
2.2 Методы исследования 46
2.3 Статистическая обработка 52
Глава III. Результаты исследования 53
3.1 Содержание эпк, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), эндостатина и mcp-1 в крови у больных ибс и здоровых добровольцев 53
3.2 Связь ЭПК, VEGF, эндостатина и mcp-1 с факторами риска у больных ИБС 58
3.3 Сопоставление содержания эпк, показателей липидного профиля и концентрации vegf, эндостатина, MCP-1 и СРБ в крови у больных ИБС 61
3.4 Влияние терапии аторвастатином в дозе 10 мг и 40 мг на уровень эпк, факторов ангиогенеза и показателей липидного профиля. 63
3.5 Сопоставление динамики эпк с динамикой показателей липидного профиля у больных ибс на фоне терапии аторвастатином в различных дозах 67
Глава IV. Обсуждение 69
Выводы 78
Список литературы 79
- Эндотелиальные прогениторные клетки: источники и фенотипы
- Влияние сопутствующих заболеваний на эндотелиальные прогениторные клетки
- Методы исследования
- Сопоставление содержания эпк, показателей липидного профиля и концентрации vegf, эндостатина, MCP-1 и СРБ в крови у больных ИБС
Эндотелиальные прогениторные клетки: источники и фенотипы
В ситуациях, когда естественный неоваскуляризационный ответ достаточен, чтобы предотвратить некроз миокарда, но недостаточен для сохранения нормальной сократимости сердечной мышцы даже в покое, формируется гибернированный миокард, что проявляется локальным снижением сократимости с целью уменьшения потребления кислорода и восстановления баланса между его доставкой и потреблением [38]. Гибернированный миокард жизнеспособен, но через какое-то время могут запуститься процессы, приводящие к апоптозу кардиомиоцитов, ремоделированию миокарда и структурным изменениям, включающим потерю контрактильного субстрата кардиомиоцитов, а также увеличению количества интерстициальной соединительной ткани, ведущее к необратимому миокардиальному фиброзу.
Исследование, проводившиеся на лабораторных мышах, генетически лишенных VEGF164 и VEGF188 изоформ, продемонстрировало формирование прогрессирующей сердечной недостаточности на фоне дефицита факторов роста ангиогенеза [39]. Подобным же образом, недостаток сердечного, специфичного к миоциту HIF-loc приводит к снижению сократимости, васкуляризации, содержания высокоэнергетических фосфатов [40]. Наличие таких лабораторных моделей необходимо для дальнейших исследований все еще не ясной роли факторов роста ангиогенеза в развитии васкуляризации и определения эффективности экзогенных факторов роста в гибернированном миокарде.
Было выявлено большое число ангиогенных факторов, способных стимулировать неоваскуляризацию ишемизированной ткани в миокарде [41]. Ингибирование ангиогенеза достаточно давно и успешно используется для лечения онкологических заболеваний, однако использование обратного процесса в кардиологии пока затруднено. Среди множества факторов роста, участвующих в регуляции ангио- и артериогенеза, наиболее важными стимуляторами этих процессов являются сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), семейство факторов роста фибробластов (FGFs), фактор роста гепатоцитов (HGF), а также трансформирующий фактор роста TGF.
Сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGFs), вероятно, наиболее изученная группа факторов ангиогенеза. Наиболее известным является VEGF-A. В результате альтернативного сплайсинга вырабатывается по крайней мере 4 изоформы VEGF-A, содержащие 121 (VEGF121), 165 (VEGF165), 189 (VEGF189), 206 (VEGF206) аминокислоты [42]. Есть данные и по другим изоформам (VEGF145), но их значение остается неустановленным [43]. Вследствие отличия изоформ VEGF по их способности связываться с гепарином различается и их потенциальная роль в ангиогенезе: VEGF165 имеет гораздо большее значение, чем VEGF121. VEGF121 и VEGF165 секретируются в экстрацеллюлярном пространстве, в то время, как VEGF189 и VEGF206 всегда находятся внутри клетки из-за их большого сродства к гепаринсульфату. Другие представители группы VEGF: VEGF-В (VEGF-3), VEGF-С (VEGF-2), VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (PlGF). VEGF-E является вирусным белком, не имеющим гомологов среди млекопитающих. Все формы VEGF с разной афинностью связываются с одним, двумя либо со всеми тремя рецепторами VEGF группы тирозин киназ: fit-1 (VEGFR-1), KDR/flk-1 (VEGFR-2) и flt-4 (VEGFR-3). Предполагается, что VEGFR-2 наиболее активны в передаче сигналов ангиогенеза, хотя, судя по активности PlGF и VEGF-D, VEGFR-1 также задействованы в передаче этих сигналов. Показано, что VEGF-D сильнее всех других представителей группы VEGF стимулирует ангиогенез и лимфогенез в скелетной мускулатуре [43]. VEGF оказывают множество эффектов на эндотелиальные клетки, которые включают повышенную миграцию, увеличение выживаемости клеток, продукцию активаторов плазминогена и интерстициальных коллагеназ, все это связано с ангиогенезом [18, 19]. VEGF не индуцирует пролиферацию других клеток, таких как гладкомышечные клетки или фибробласты, хотя и усиливает миграцию гладкомышечных клеток [44]. Точная роль VEGFR-3 менее ясна, но установлено, что они участвуют в лимфогенезе [45].
Среди других полипептидов, активирующих рост сосудов, выделен PDGF-BB, способный стимулировать покрытие перицитами формирующихся сосудистых структур, таким образом, стимулируя артериогенез [46]. G-CSF, GM-CSF и MCP-1 повышают приток мононуклеарных клеток, также стимулируя артериогенез.
Следствием инфаркта миокарда является структурное и молекулярное ремоделирование, ведущее к расширению полости ЛЖ, истончению стенки в зоне инфаркта, фиброзу, и, как следствие, к прогрессивному снижению сократительной функции миокарда [47]. В зарубежных публикациях показано, что увеличение количества кардиомиоцитов посредством введения экзогенной популяции стволовых клеток костного мозга может оказаться эффективным в регенерации погибших кардиомиоцитов, а также замедлить, или даже сделать обратимым, процесс ремоделирования [48]. Хотя важность миокардиального ремоделирования после повреждения и регенерации не вызывает сомнений, механизмы, лежащие в основе этих процессов остаются неясными. Биомолекулярная основа повреждения миокарда с развитием функциональных расстройств позволяет говорить о ведущей роли стресс-индуцированных цитокинов в этом процессе, в частности о роли TGF [49].
Влияние сопутствующих заболеваний на эндотелиальные прогениторные клетки
В настоящее время показано, что количество и функциональная активность циркулирующих ЭПК являются маркерами сосудистого риска для множества заболеваний, в том числе, сердечно-сосудистой системы [133]. Данный биомаркер независим от других традиционных и нетрадиционных факторов риска, среди которых гипертония, гиперхолестеринемия и СРБ. Возраст, мужской пол, артериальная гипертония, сахарный диабет, гиперлипидемия, курение, ожирение и гиподинамия являются факторами риска, способствующими развитию сосудистого повреждения [122, 134-136]. Известно, что сердечно-сосудистые факторы риска влияют на количество и функцию ЭПК. J. Hill et al продемонстрировали наличие обратной связи между количеством ЭПК и суммарным числом факторов риска [12]. Интересно, что они нашли обратную корреляцию между количеством ЭПК и функцией эндотелия. Несколько исследователей подтвердили наличие связи между количеством ЭПК и факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [137, 138]. M. Vasa et al продемонстрировали подавление миграции ЭПК у больных ИБС, усиливающейся на фоне увеличения количества факторов риска [138]. Также известно, что мононуклеарные клетки костного мозга, полученные у больных ИБС, имеют сниженную способность к неоваскуляризации. Очевиден тот факт, что наличие сердечно-сосудистых факторов риска обратно коррелирует с количеством и функциональным состоянием ЭПК. Однако механизм подавления ЭПК у больных ССЗ до конца не ясен. Снижение уровня периферических циркулирующих ЭПК происходит за счет уменьшения их мобилизации из костного мозга и истощения пула стволовых клеток. Как было указано выше, мобилизация ЭПК регулируется различными ангиогенными цитокинами, такими как VEGF, G-CSF и стромальный клеточный фактор 1, а также биодоступностью NO в костном мозге. NO участвует в регуляции функции ЭПК в ответ на различные стимулы через активацию матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9). ММР-9 индуцирует трансформацию Kitлиганды из мембраносвязанного в растворимое состояние, потенцируя последующий выход в кровоток сKit положительных стволовых клеток, включая общие предшественники гематопоэтических прогениторных клеток и ЭПС (например, гемангиобласты). Эти данные согласуются с тем фактом, что у мышей, дефицитных по NO-синтазе (NOS 3-/-), значительно снижена мобилизация ЭПК [139]. Биодоступность NO зависит от сердечно-сосудистых факторов риска, которые снижают мобилизацию ЭПК. Функциональная способность ЭПК мигрировать и встраиваться в тубулоподобные структуры при неоваскуляризации частично определяется эндотелиальным NOS-NO механизмом.
Возраст является важным фактором, ведущим к снижению количества ЭПК и влияющим на их функцию. Многофакторный анализ показал, что возраст является независимым фактором снижения количества ЭПК [140]. Известно, что с возрастом биодоступность NО также снижается, что, вероятно, влияет на уровень ЭПК. Thum et al показали, что прием соматотропного гормона (гормон роста) у здоровых мужчин среднего возраста восстанавливает исходно сниженное количество ЭПК, их колониеобразующую способность, способность к миграции и образованию тубулоподобных структур через IGF-1-опосредованную стимуляцию фосфоинозитид (PI)-3-киназа/Akt/eNOS механизм[141]. VEGF известен своей способностью стимулировать мобилизацию ЭПК из костного мозга. В ишемизированных тканях экспрессия VEGF усилена, что ведет к мобилизации и привлечению ЭПК в область ишемии. Перенос гена VEGF в ишемизированную ткань более чем в два раза повышает уровень циркулирующих ЭПК. Scheubel et al опубликовали данные, что у пожилых пациентов низкий уровень VEGF плазмы ассоциируется со сниженной мобилизацией ЭПК из костного мозга, однако причина пониженного уровня VEGF не известна [142]. С другой стороны, нет четких данных о связи возраста и уровня VEGF. Возникающие с возрастом клеточное повреждение и/или нестабильность генома ведут к старению ЭПК, вероятно, вследствие роста окислительного стресса. ЭПК пожилых пациентов отличаются снижением количества теломераз и более выраженными процессами старения клеток [143].
Хотя эстрогены invivo и invitro ведут к повышению количества ЭПК и активизации таких их функций как адгезия, миграция, пролиферация и подавление апоптоза, нет достоверных данных за более высокий уровень и функциональную активность ЭПК у женщин. Masuda et al показали, что количество CD34+ клеток и CD133+ клеток, включая незрелые ЭПК достигает пика в постовуляторную фазу менструального цикла, следующую за пиком сывороточной концентрации эстрогена в периовуляторную фазу, сделав предположение, что количество ЭПК регулируется менструальным циклом [144].
Kondo et al показали, что курение сокращает число ЭПК у здоровых лиц, а отказ от курения восстанавливает их количество [145]. Данные о том, что курение ведет к снижению числа ЭПК, подтверждены и в ряде других исследований [146]. Хотя достоверная связь между курением и пониженным уровнем ЭПК у больных ИБС выявлена не была. По результатам анализа, проведенного Umemura et al, курение не вело к снижению ЭПК у больных ИБС [140]. С другой стороны, здоровые лица без факторов риска ССЗ имели более низкий уровень ЭПК при наличии курения в анамнезе. Причина такого несоответствия не ясна. Определение вклада других факторов риска, а также влияния продолжительности курения и отказа от курения на количество и функциональную активность ЭПК сделало бы возможным более точно установить роль курения как такового на биоактивность ЭПК. Связанная с курением выработка свободных кислородных радикалов (ROS) может быть причиной снижения биодоступности NO, что ведет к подавлению мобилизации ЭПК из костного мозга. Повышение количества свободных кислородных радикалов также меняет функциональное состояние ЭПК. Michaud et al показали, что повышенная выработка свободных радикалов кислорода у курильщиков подавляет такие свойства ЭПК, как адгезия, миграция и тубулообразование [146]. Повышение уровня ЭПК после отказа от курения было более выражено у мало курящих и менее выражено у много курящих, что может говорить о необратимом повреждении биоактивности ЭПК при активном курении.
Методы исследования
Известно, что медикаментозная терапия оказывает влияние на ростовые факторы. Так, Miura с соавторами продемонстрировали, что на процессы ангиогенеза влияет терапия статинами и ингибиторами АПФ [198]. Результаты нашей работы также указывают на то, что терапия аторвастатином ведет к снижению уровня VEGF. На уровень эндостатина, фактора, ингибирующего ангиогенез, значимого влияния терапия аторвастатином не оказала. Подобный эффект отмечался при лечении розувастатином в дозе 5 и 10 мг в сутки. Нами не было выявлено влияние исходного уровня VEGF на степень его снижения на фоне терапии аторвастатином. Возможно, гиперхолестеринемия сама по себе оказывает влияние на уровни факторов ангиогенеза. В нашей работе этот факт не проверялся, так как проведение такого исследования требует сравнения факторов ангиогенеза у здоровых добровольцев и у пациентов с повышенным уровнем холестерина и без ИБС, что должно быть подтверждено ангиографически. Имеются клинические работы, в которых такое сравнение проведено. Так в работе скандинавских кардиологов оценивалась взаимосвязь уровня VEGF с гипоксией, цитокинами и с холестерином ЛНП. Включено 18 пациентов с повышенным уровнем холестерина и 12 здоровых добровольцев. Была найдена корреляция между уровнем VEGF и холестерином, холестерином ЛНП, триглицеридами у пациентов с гиперхолестеринемией и отсутствие такой корреляции в контрольной группе. При лечении правастатином было найдено снижение уровня холестерина, факторов воспаления и VEGF [211]. Статины регулируют синтез VEGF эндотелиальными и гладкомышечными клетками, модулируя таким образом формирование новых коронарных артерий. В нормальных условиях гладкомышечные и эндотелиальные клетки человека синтезируют и секретируют VEGF. Макрососудистые эндотелиальные клетки могут секретировать VEGF короткое время. Статины (аторвастатин, симвастатин, ловастатин) значительно снижают базальную секрецию VEGF, а также секрецию, индуцированную цитокинами, оксидом азота, фосфатидилхолином[212]. Некоторые авторы описывают дозозависимый эффект статинов– в низких концентрациях превалирует проангиогенетический эффект, в высоких концентрациях статины ангиогенез ингибируют [213]. Результаты нашей работы опровергают эту точку зрения, так как терапия статинами приводила к снижению как уровня VEGF вне зависимости от дозы статина.
В экспериментальной работе было продемонстрировано, что правастатин положительно влияет на ремоделирование миокарда после перенесенного инфаркта за счет противовоспалительных механизмов, но не за счет усиления ангиогенеза. Инфаркт моделировался пережатием передней межжелудочковой артерии, затем либо давался правастатин либо вводились стволовые клетки. Дисфункция миокарда уменьшалась после назначения правастатина и после введения стволовых клеток. Однако микроваскуляризация инфаркт зависимой зоны возрастала только у крыс, которым вводились стволовые клетки, но не в группе, получавшей правастатин. Было отмечено уменьшение факторов воспаления при лечении правастатином. Следовательно, терапия статином не повлияла на коронарный ангиогенез [214].
Тот факт, что терапия высокими дозами статинов позволяет улучшить состояние при эндотелиальной дисфункции, обусловленной гиперхолестеринемией, подтверждается работой американских исследователей. Дизайн этой экспериментальной работы был аналогичным. Аторвастатин улучшал эндотелиальную дисфункцию и не оказывал влияние на коллатеральную перфузию миокарда. Более того, терапия аторвастатином в высоких дозах приводила к увеличению экспрессии эндостатина и к снижению экспрессии VEGF [215].
В экспериментальных работах на мышах было показано, что питавастатин и аторвастатин уменьшают уровень VEGF, экспрессию генов VEGF, экспрессию лигандахемокинахемоатрактанта СС и хемоатрактантного белка моноцитов, но значимо не влияют на внутриклеточные молекулы адгезии [216, 217].
В экспериментальной работе на морских свинках было изучено влияние высоких доз статинов на коронарный ангиогенез [218]. Сначала животным назначали гиперхолестериновую диету, затем части из них давали аторвастатин. Хроническая ишемия моделировалась путем пережатия огибающей артерии на фоне 3-х недельного введения VEGF. У свинок, которые находились на гиперхолестериновой диете, отмечалось ухудшение микрососудистой релаксации в ответ на введение VEGF по сравнению со свинками, которые получали обычную пищу. Однако у тех свинок, которые получали гиперхолестериновую диету и аторвастатин, микрососудистая релаксация была сохранена. При моделировании ишемии миокарда коллатеральное кровоснабжение менялось по-разному у разных групп свинок. После введения VEGF миокардиальная перфузия (по коллатералям) у свинок с нормальным питанием улучшилась, а у свинок с гиперхолестериновой диетой не менялась. Не менялась она и у свинок с гиперхолестериновой диетой и приемом аторвастатина. В этой же группе была выявлена повышенная экспрессия ингибитора ангиогенезаэндостатина. Был сделан вывод, что терапия аторвастатином приводит к улучшению функции эндотелия, но не оказывает влияния на коллатерально-зависимую перфузию миокарда. Экспериментальные данные [218] подтверждаются и результатами клинических работ
Сопоставление содержания эпк, показателей липидного профиля и концентрации vegf, эндостатина, mcp-1 и срб в крови у больных ибс
Таким образом, повышенный уровень холестерина сам по себе тормозит связывание VEGF с рецепторами. Имеются работы, в которых доказано, что гиперхолестеринемия блокирует индуцирование коронарного ангиогенеза под воздействием повышенного уровня VEGF [219, 222]. То есть при повышении уровня холестерина коронарный ангиогенез не может полноценно реализовываться. Поэтому, назначение статинов хотя и снижает уровень проангиогенных факторов роста, но увеличивает их связь с рецепторами. То есть, ингибирующего влияния на ангиогенезстатины не оказывают. Более того, не исключено, что снижение уровня VEGF обусловлено отрицательной обратной связью – активация рецепторов к VEGF приводит к снижению концентрации VEGF.
Как известно, васкуляризация атеросклеротической бляшки является неблагоприятным процессом [223]. Ее неоваскуляризация играет большую роль в дестабилизации бляшки и увеличивает опасность разрыва, что может привести к тромбозу и инфаркту миокарда. Статины, вероятно, ослабляют процессы фиброза, что оказывает ингибирующее влияние на рост атеросклеротической бляшки и является одним из механизмов ее стабилизации.
Повышение уровня ЭПК различных фенотипов на фоне терапии статинами – известный факт, продемонстрированный в ряде работ [24, 25, 138, 224]. Однако оставалось неясным, является ли это стимулирующее влияние статинов на прогениторные клетки дозозависимым. Этот вопрос имеет важное научное и практическое значение. Результаты нашего исследования демонстрируют, что количество ЭПК у здоровых лиц достоверно выше, чем у пациентов с ИБС. Подобные различия отражены и в недавно опубликованном обзоре, показавшем, что у больных с заболеваниями, обусловленными атеросклерозом коронарных артерий, уровень ЭПК снижается [225]. Из полученных результатов можно сделать вывод, что уровень ЭПК оказывает положительное влияние на функцию эндотелия, что подтверждается работами, описывающими влияние статинов на потокзависимую вазодилатацию [226]. Вполне вероятно, что в основе нормализации потокзависимой вазодилатации лежит репарация эндотелиальными прогениторными клетками сосудистого эндотелия.
Однако, несмотря на то, что статинотерапия приводит к увеличению уровня ЭПК [227-229], механизмы, лежащие в основе этого эффекта, до конца не выяснены. Их изучению и была посвящена наша работа.
В клинических исследованиях предпринимаются попытки использовать тот факт, что статинотерапия ведет к повышению уровня ЭПК. Так, в исследование ARMIDA продемонстрирован положительный эффект от интенсивной статинотерапии перед чрескожным коронарным вмешательством (ЧКВ) [230]. В новом исследовании HIPOCRATES (2015 г.) изучается влияние терапии статинами в высоких доза на эндотелизацию стента [202]. Авторы подчеркивают, что положительные плейотропные эффекты статинов, улучшающие исходы реваскуляризации миокарда и не связанные с гиполипидемическим их действием, до конца не изучены. Авторы предположили, что повышение ЭПК может нивелировать повреждение эндотелия, происходящее в процессе имплантации стента. В работу включали статин-наивных пациентов, или же больных, нерегулярно принимающих малые дозы статинов. Это были пациенты средней возрастной группы со стабильной или нестабильной стенокардией, направленные на эндоваскулярное лечение (n=23). Пациенты были рандомизированы на 2 группы – высоких доз статинов (80 мг за день до ЧКВ, 40 мг аторвастатина за 2-4 часа до ЧКВ) и низких доз статина. Уровень ЭПК был измерен непосредственно перед ЧКВ и через 24 часа после. Измерение проводили методом цитофлуорометрии за счет экспрессии VEGFR-2+/CD133+ и VEGFR-74 2+/CD34+. Количественный анализ проводили после 7 дневного культивирования клеток, составляющих колониеобразующий пул – colonyformingunits (CFUs). Уровень ЭПК-CFUs перед ЧКВ был выше у пациентов группы высоких доз аторвастатина - 165.8±58.8 против 111.7±38.2 CFUs, p 0,001. Однако через 24 часа уровень ЭПК между группами значимо не отличался – 188.0±85.3 и 192.9±66.5 CFUs соответственно, p=0,15. Авторы затрудняются объяснить полученные результаты и планируют дальнейшие исследования. Результаты нашего исследования подтверждают вторую часть вышеописанной работы – при длительной терапии статинами отсутствует разница в приросте количества ЭПК на фоне интенсивной терапии и терапии статинами в низких дозах. Малое количество пациентов в работе HIPOCRATES (обусловленное, вероятно, трудоемкостью измерения ЭПК) не позволяет достоверно говорить, действительно ли повышение ЭПК носит двухфазный характер – сначала на высоких дозах статинов происходит более выраженное повышение их количества, чем на низких, но затем идет спад прироста, или же это ошибка малой выборки. Не получен ответ на вопрос, за счет каких механизмов происходит снижение количества осложнений при ЧКВ на фоне интенсивной статинотерапии [202]. Результаты нашего исследования также не отвечают на данный вопрос. Это в какой-то мере соответствует и результатам клинических исследований (TNT, IDEAL), в которых клиническое преимущество высоких доз статинов перед умеренными находилось на гране достоверности [231, 232].