Свободнорадикальное окисление липидов при атеросклерозе и антиоксидантная коррекция нарушений метаболизма липопероксидов (клинико-экспериментальноеисследование) Тихадзе, Алла Карловна

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время не вызывает сомнений важная роль нарушений липидного обмена в этиологии и патогенезе атеросклероза. Согласно современным представлениям, развитие ГХС способствует проникновению ЛНП, обогащенных ХС, в межэндотелиальное пространство, что приводит к их поглощению моноцитами-макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки, образующие зону липоидоза. Эти процессы сопровождаются миграцией гладкомышечных клеток из медии в интиму с их последующей пролиферацией, что создает клеточную основу формирующейся атеросклеротической бляшки. Таким образом, повышенное содержание ХС в плазме крови рассматривается в качестве одного из главных факторов риска возникновения атеросклероза, а использование гиполипидемических препаратов служит основным способом профилактики и лечения этого заболевания. Литературные данные последних лет указывают на то, что развитие ГХС не является, вероятно, единственным пусковым фактором повреждения стенки сосуда. Действительно, в крови больных атеросклерозом было отмечено (A.Szczeklik et al., 1981) повышенное содержание вторичного продукта свободнорадикального ПОЛ - МДА, который вызывает модификацию частиц ЛНП, причем МДА-модифицированные ЛНП захватываются моноцитами-макрофагами стенки сосуда со значительно большей скоростью, чем нативные неокисленные ЛНП (D.Steinberg, 1995). Исходя из этого мы предположили, что нарушения липидного обмена при атеросклерозе могут проявляться не только в ГХС, но и в развитии гиперлипопероксидемии (увеличении содержания LOOH в плазме крови больных), также играющей роль фактора риска возникновения этого заболевания. Тем не менее, до начала настоящей работы имелись лишь единичные публикации, посвященные исследованию процессов ПОЛ при атеросклерозе, причем в большинстве этих работ использовались не вполне адекватные методы анализа LOOH (J.GIavind et al., 1952; В.И.Калмыкова, 1970; ОН Воскресенский, 1975). Кроме того, не были разработаны научные подходы к использованию антиоксидантсв в качестве дополнительных лекарственных средств при терапии атеросклероза, а в существующих клинических исследованиях по этой проблеме, как правило, не использовались объективные биохимические тесты для оценки антиоксидантного действия применяемых

препаратов. Таким образом, совокупность экспериментальных фактов, накопленных к концу 70-х годов, позволила нам высказать предположение о важной роли процессов свободнорадикального ПОЛ в механизмах атеросклеротического повреждения стенки сосуда и обусловила актуальность проведения экспериментальных и клинических исследований, обосновывающих возможность использования антиоксидантов в комплексной терапии ИБС . Цель исследования: Выяснение роли процессов свободнорадикального ПОЛ в механизмах атеросклеротического повреждения стенки сосуда, а также теоретическое и экспериментальное обоснование необходимости использования антиоксидантов в комплексной терапии больных ИБС с ГХС.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Исследовать действие продуктов ПОЛ на структурно-динамические параметры
липосомальных фосфолипидных мембран в сравнении с действием ХС;

1. Исследовать влияние алиментарной ГХС на скорость NADPH-зависимого генерирования активных форм кислорода, накопление LOOH и активность ключевого фермента катаболизма ХС - 7сх-гидроксилазы в микросомальных мембранах гепатоцитов млекопитающих;

2. Исследовать изменение активности ключевых антиоксидантных ферментов -СОД и GSH-пероксидазы в цитозоле гепатоцитов животных с алиментарной ГХС;

3. С использованием различных физико-химических методов (полярография, УФ-спектрометрия, спектрофлуориметрия) исследовать содержание первичных и вторичных продуктов ПОЛ, а также скорость ферментативной утилизации LOOH в крови больных ИБС с постинфарктным кардиосклерозом в сравнении с практически здоровыми лицами без ИБС и признаков ГЛП;

4. Исследовать содержание, химическую природу и стереоизомерию LOOH, а также скорость их ферментативной утилизации в различных зонах атеросклеротического поражения аорты человека при использовании аутопсийного материала, полученного при быстрых вскрытиях;

6. Провести сравнительное исследование антиокислительной активности
природных (а-токоферол) и синтетических (ВНТ, пробукол и его структурные
аналоги) фенольных антиоксидантов при окислении липосом, биомембран и
ЛНП;

7. Исследовать изменение основных параметров ПОЛ (уровень LOOH и МДА, окисляемость ЛНП, активность антиоксидантных ферментов) в крови больных ИБС при длительных курсах терапии с включением различных дозировок синтетического антиоксиданта пробукола;

8. Исследовать изменение основных параметров ПОЛ (уровень LOOH и МДА, окисляемость ЛНП, активность антиоксидантных ферментов) в крови больных ИБС при длительном курсе терапии ингибитором ГМГ-КоА-редуктазы правастатином, а также при комбинированном лечении правастатином и природным антиоксидантом убихиноном Qt₀;

9. Подвергнуть экспериментальной проверке высказанную нами гипотезу о существовании концентрационной инверсии антиоксидантного действия р-каротина в миокарде крыс in vivo в норме и при коронароокклюзии.

Научная новизна работы: Впервые установлено, что неселеновая GSH-трансфераза, в отличие от Se-содержащей GSH-пероксидазы цитозопя клеток способна восстанавливать гидроперокси-ацилы мембранных ФХ без их предварительного гидролиза фосфолипазой А₂ (обнаруженный феномен послужил основой создания оригинального ферментативного метода определения LOOH в биологических системах, который был признан изобретением в 1987 г. (Лет. свидет. СССР № 1322153). С использованием ферментных систем, включающих С-15 ЛОК ретикулоцитов и GSH-трансферазу печени, впервые обнаружено, что накопление LOOH и продуктов их восстановления (окси-жирных кислот) в бислойных фосфолипидных мембранах по своему эффекту на структурно-динамические параметры противоположно мембранному действию ХС. Впервые показано, что накопление ХС в мембранах эндоплазматического ретикулума гепатоцитов крысы вызывает усиление генерирования активных форм кислорода NADPH-зависимой микросомальной оксигеназой и сопровождается накоплением продуктов ПОЛ в микросомальных мембранах клеток печени. Впервые обнаружено значительное снижение активности ключевых антиоксидантных ферментов (СОД, GSH-пероксидаза) в цитозоле гепатоцитов млекопитающих (крыса, кролик, мини-свинья) с алиментарной ГХС. С использованием различных адекватных методов исследования (включая УФ-спектрометрию и полярографию с ртутно-капельным электродом) впервые обнаружено увеличение содержания LOOH в крови больных

атеросклерозом при одновременном снижении скорости их ферментативной утилизации. В зонах атеросклеротического поражения аорты человека впервые обнаружено резкое снижение активности СОД и GSH-пероксидазы, сопровождающееся прогрессирующим накоплением LOOH (преимущественно в ацилах холестериллинолеата) в зонах липидного пятна и липофиброзной бляшки. При исследовании ингибирующей способности природных (витамин Е) и синтетических (ВНТ, пробукол и его структурные аналоги) фенольных антиоксидантов в процессе свободнорадикального окисления природных (микросомы печени) и искусственных (липосомы из ФХ) мембран выявлены высокие антирадикальные потенции пробукола (но не а-токоферола) и, особенно, некоторых вновь синтезированных аналогов пробукола. В соответствии с этим показано, что природный антиоксидант витамин Е, даже при использовании в высоких дозах (400 мг/сут), не вызывает достоверного изменения параметров окисляемости ЛНП больных ИБС, тогда как синтетический антиоксидант пробукол в суточных дозах 1000 мг и 250 мг существенно подавляет окисление ЛНП. С использованием ЭПР-спектроскопии доказано, что пробукол, включенный в ЛНП больных в процессе их лечения активно взаимодействует с LO'-радикалами, генерируемыми непосредственно в ЛНП, с образованием феноксильного радикала пробукола, т.е. пробукол может функционировать в ЛНП in vivo в качестве ловушки радикалов. Впервые обнаружено, что при терапии больных ИБС пробуколом в их крови весьма значительно возрастает активность антиоксидантных ферментов, т.е. пробукол способен не только непосредственно взаимодействовать с липидными радикалами, но и опосредованно влиять на интенсивность свободнорадикальных процессов in vivo, при этом активность СОД и GSH-пероксидазы увеличивалась в равной степени при использовании пробукола как в дозе 1000 мг/сут, так и в дозе 250 мг/сут. В соответствии с этим показано, что содержание первичных (LOOH) и вторичных (вещества, реагирующие с ТБК) продуктов ПОЛ в ЛНП больных ИБС, длительное время (до 6 мес) получавших пробукол в дозах 1000 мг/сут или 250 мг/сут снижалось весьма существенно, но амплитуда этого снижения не зависела от использованной дозы препарата. Впервые обнаружено, что 6-й месячная терапия больных ИБС с ГХС ингибитором биосинтеза ХС и Qto (ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы) -правастатином сопровождалась значительным накоплением LOOH в ЛНП

пациентов, а также приводила к существенному подавлению активности GSH-пероксидазы в крови. Впервые показано, что природный антиоксидант Q₁₀ не только полностью защищает ЛНП больных ИБС от спровоцированного правастатином накопления LO0H, но также, в значительной степени, предотвращает вызванное правастатином ингибирование активности GSH-пероксидазы. Получено экспериментальное подтверждение высказанной нами гипотезы о возможности концентрационной инверсии антиокислительного и фармакологического эффекта р-каротина в интактном и инфарцированном миокарде крыс (обращении антиоксидантного эффекта в прооксидантный при увеличении концентрации) в экспериментах по исследованию in vivo. Практическая ценность работы: Совокупность полученных результатов подтверждает важную роль процессов ПОЛ в атеросклеротическом поражении стенки сосуда человека и обосновывает необходимость использования антиоксидантов для коррекции гиперлипопероксидемии при атеросклерозе. Установлено, что наиболее информативными биохимическими тестами, которые могут быть использованы в клинических условиях для оценки исходного уровня ПОЛ, а также эффективности антиоксидантной терапии, являются специфичный, не требующий экстракции колориметрический способ определения содержания LOOH в ЛНП и плазме крови с ксиленолоранжем (в присутствии специфичного восстановителя LOOH - трифенилфосфина), а также метод определения активности GSH-пероксидазы в плазме и форменных элементах крови с использованием гидропероксида трет-бутила и LOOH в качестве субстратов. Показано, что наиболее выраженным защитным эффектом, препятствующим возникновению атерогенной окислительной модификации ЛНП у больных ИБС с ГХС, обладает не природный антиоксидант а-токоферол, а синтетический антиоксидант пробукол, способный функционировать в организме не только как ловушка радикалов, но и опосредованно, увеличивая активность антиоксидантных ферментов. Обнаружено, что антиоксидантное действие пробукола при терапии больных ИБС с ГХС в полной мере реализуется не только при обычной терапевтической дозе препарата 1000 мг/сут, но и при снижении суточной дозы до 250 мг, что позволяет нивелировать негативные побочные эффекты, проявляющиеся при его использовании в дозе 1000 мг/сут и открывает новые возможности для антиоксидантной терапии ИБС. Установлено, что Ою

может применяться при терапии больных ИБС с ГХС в комплексе с правастатином для подавления окисления ЛНП, провоцируемого этим ингибитором ГМГ-КоА-редуктазы. Экспериментальное подтверждение сформулированной нами гипотезы о возможности концентрационной инверсии действия антиоксидантов in vivo позволяет объяснить причины неудач при включении антиоксидантов в терапию больных ИБС и наметить пути для научного обоснования стратегии антиоксидантной терапии.

Апробация работы состоялась 27 апреля 1999 года на заседании Ученого Совета НИИ кардиологии им.А.Л.Мясникова РКНПК МЗ РФ.

Материалы диссертации опубликованы в 138 работах и представлены на: Всесоюзн. симп. «Физико-химич. основы функционир. надмолекулярн. структур клетки» (Москва, 1974); XXVгодичн. сессии НИИ кардиол. АМН СССР (Москва, 1975); II, III и IV Всесоюзн. симп. «Структура, биосинтез и прееращ. липидое» (Москва, 1975; Ленинград, 1978, Киев, 1983); Межреспубликанск. конф. «Акт. вопр. кардиол.» (Каунас, 1975); Симп. МОИП «Свободнорадикальн. окисление липидое в норме и патологии» (Москва, 1976); II Всероссийск. съезде кардиол. (Саратов, 1977); VII Всесоюзн. конф. по химии органич. пероксидов (Волгоград, 1980); Всесоюзн. симп. «Липиды биомембран» (Ташкент, 1980); VI, VII и VIII Объед. симп. биохимич. обществ СССР и ГДР (Таллин, 1981; Лейпциг,1983; Рига,1985); IV Всесоюзн. съезде геронтологов и гериатров (Киев, 1982); Симп. «Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшеств. коферментов» (Иркутск, 1983); II Симп. секции молекулярн. кардиол. Всесоюзн. научн. о-ва кардиологов «Метаболизм, структура и функции сердечной клетки» (Ташкент, 1983); I - V Всесоюзн. и международн. конф. «Биоантиоксидант» (Черноголовка, 1983, 1992; Москва 1986, 1989, 1998); XVI Конф. FEBS (Москва, 1984); Международн. конф. по профилактич. кардиол. (Москва, 1985); VI Всесоюзн. научн. конф. по окислению органич. coed, в жидкой фазе (Львов, 1986); Симп. советск. секции международн. о-ва по изучению сердца (Баку, 1986); II Республиканок, конф. «Механизмы старения и долголетия» (Тбилиси,1986); Всесоюзн. симп. «Синтез и исследование простагландинов» (Таллин,1986); IV Всесоюзн. съезде кардиологов (Москва, 1988); Международн. конф. по регуляции свободнорадикальн. реакций (Варна, Болгария, 1989); 62, 66, 67 и 70 Конгр. Вер. о-ва по изучению атеросклероза (Иерусалим, Израиль, 1993; Флоренция, Италия, 1996; Мюнхен, Германия, 1997; Женева, Швейцария, 1998); Ассамбл. кардиол. СНГ «Вторичн. профилактика и восстановит, терапия в кардиол.»

(Томск, 1993); VII и VIII Биенальн. научн. конф. международн. о-ва свободнорадикальн. исслед. (Сидней, Австралия, 1994; Барселона, Испания, 1996); Международн. конф. «Природные антиоксидаиты и липопероксидация при атеросклерозе и раке» (Хельсинки, Финляндия, 1995); Международн. конгр. «Свободные радикалы в норме и при патологии» (Стамбул, Турция, 1995); XII Международн. симп. по лекарствам, влияющим на метаболизм липидов (Хьюстон, США, 1995); Международн. симп. по молекулярн. механизмам и лечебным эффектам природных антиоксидантов (Пекин, Китай, 1995); Симп. «Липопротвиды и атеросклероз» (Санкт-Петербург, 1995); Международн. конф. «Окислит, стресс и регуляция окислит.-восстановит, процессов» (Париж, Франция, 1996); VII Конгр. международн. о-ва биохимии животных (Глазго, Шотландия, 1996); XVI Международ, конгр. по клинич. химии (Лондон, Великобритания, 1996); Международн. конгр. по клинич. энзимопогии (Кембридж, Великобритания, 1996); 37 Международн. конф. по биохимии липидов (Антверпен, Бельгия, 1996); I Российск. конгр. по патофизиол. (Москва, 1996); VI Международн. симп. по ортомолекулярн. медицине «Антиоксиданты и профилактика болезней» (Сан-Пауло, Бразилия, 1997); XI Международн. симп. по атеросклерозу (Париж, Франция, 1997); I Конгр. ассоциации кардиологов стран СНГ (Москва, 1997); Международн. симп. «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень, 1997); II Съезде биохимич. о-ва РАН (Москва, 1997); V Российск. национальн. конгр. «Человек и лекарство» (Москва, 1998); X Международн. конф. по химии органич. и элементоорганич. пероксидов (Москва, 1998); I Региональн. конф. по медицине «Роль свободных радикалов в норме и при патологиях» (Иерусалим, Израиль - Амман, Иордания, 1998); Международн. конф. «Регуляция биологических процессов свободными радикалами» (Ярославль, 1998); Научн. конф. «Акт. вопр. сердечно-сосуд. патологии» (Москва, 1998); I Всероссийск. конф. по проблемам атеросклероза (Москва, 1999), Еер. конф. «Антиоксиданты, адаптация и старение» (Дрезден, Германия, 1999), Всероссийск. конф. «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999). Объем и структура работы: Диссертация изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована 52 рисунками и 17 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, краткого описания использованных методов, выводов и списка литературы.