Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1. Свободные радикалы и антиоксиданты в условиях нормальной 9
физиологии
1.1. Оксид анты 10
1.2. Антиоксиданты 18
1.3. Оксидативный стресс 21
2. Оксидативный стресс и заболевания сердечно-сосудистой системы 24
2.1. Оксидативный стресс и атеросклероз 25
2.2. Дисфункция эндотелия и оксидативный стресс 31
3. Маркёры оксидативного стресса 32
3.1. Миелопероксидаза 32
3.2. Продукты окисления липидов 36
3.3. Продукты окисления белков 37
4. Стратификация риска у пациентов с острым коронарным синдромом 40
5. Заключение 45
ГЛАВА II. Материалы и методы 46
1. Материалы исследования 46
1.1. План исследования 46
1.2. Критерии включения 47
1.3. Критерии не включения 48
1.4. Критерии исключения 49
1.5. Общая характеристика исследуемой выборки 49
2. Методы исследования 54
2.1. Методы обследования больных 54
2.2. Методика забора крови и подготовки материала 54
2.3. Определение маркёров оксидативного стресса 55
3. Статистический анализ данных 57
ГЛАВА III. Результаты собственных наблюдений 59
1. Сравнительная характеристика пациентов с различным течением заболевания
2. Оценка показателей оксидативного стресса, их корреляционные взаимосвязи и динамика у пациентов с острым коронарным синдромом
2.1. Миелопероксидаза 61
2.2. Активность миелопероксидазы 62
2.3. ТБК-реактивные продукты – малоновый диальдегид 64
2.3.1. МДА в нативной плазме 64
2.3.2. МДА после медь-индуцированного окисления плазмы 66
2.4. Связывающая способность альбумина 68
2.5. Кобальт-связывающая способность альбумина 70
2.6. Карбонильные группы белков 72
2.7. Карбонильные группы фибриногена 73
3. Сравнение показателей оксидативного стресса у пациентов с различным течением заболевания и тридцатидневный прогноз
3.1. Миелопероксидаза 75
3.2. Активность миелопероксидазы 77
3.3. ТБК-реактивные продукты 80
3.3.1. МДА в нативной плазме 80
3.3.2. МДА после медь-индуцированного окисления плазмы 82
3.4. Связывающая способность альбумина 83
3.5. Кобальт-связывающая способность альбумина 85
3.6. Карбонильные группы белков 86
3.7. Карбонильные группы фибриногена 87
4. Показатели оксидативного стресса и долгосрочный прогноз пациентов 88
после ОКС
ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов 89
1. Миелопероксидаза и её активность у пациентов с ОКС 90
2. Продукты перекисного окисления липидов у пациентов с ОКС 92
3. Продукты окислительного повреждения белков у пациентов с ОКС 93
4. Влияние показателей оксидативного стресса на прогноз у пациентов с 97 ОКС
Выводы 99
Практические рекомендации 100
Список литературы
- Оксидативный стресс и заболевания сердечно-сосудистой системы
- Методика забора крови и подготовки материала
- ТБК-реактивные продукты – малоновый диальдегид
- Продукты перекисного окисления липидов у пациентов с ОКС
Оксидативный стресс и заболевания сердечно-сосудистой системы
Гидроксильный радикал – самый активный из АФК, время его полужизни in vivo составляет около 10-9 сек [12]. Таким образом гидроксильный радикал in vivo может повреждать белки, углеводы и ДНК, а также инициировать реакции перекисного окисления липидов только в месте своего образования.
Таким образом редокс статус клетки зависит от доступности ионов железа/меди в цитозоле. Ранее считалось, что механизмы регуляции обмена железа, исключают возможность наличия свободного железа в клетке. Однако in vivo выявилось, что в состоянии оксидативного стресса избыток супероксид аниона повреждает железосодержащие белки, освобождая при этом в цитозоль железо и делая его доступным для реакций Фентона и Хербера-Вейса. Что с свою очередь приводит к образованию крайне активного гидроксильного радикала [39, 69, 83, 133].
Ферменты гранулоцитов, такие как эозинофильная пероксидаза и миелопероксидаза, увеличивают активность пероксида водорода. В активированных нейтрофилах H2O2 накапливается с помощью МПО. В присутствие ионов хлора, H2O2 превращается в гипохлорную кислоту (HOCl). Гипохлорная кислота – сильный окислитель, и играет большую роль в устранении патогенов в воздухоносных путях [62]. Кроме того, HOCl реагирует с ДНК и индуцирует реакции между ДНК и белками, а также присоединять хлорид к основаниям ДНК [136].
Эозинофильная пероксидаза и миелопероксидаза способствуют усилению оксидативного стресса с помощью модификации белков посредством галогенации, нитрирования и образования межбелковых сшивок через тирозольные радикалы [22, 65, 70].
Остальные кислород-содержащие свободные радикалы являются пероксилами (ROO). Самый простейший из них – гидропероксил (HOO). Свободные радикалы запускают цепные реакции перекисного окисления липидов. В дальнейшем липидные радикалы реагируют с кислородом и образуют пероксильные радикалы. Пероксильные радикалы запускают цепную реакцию, в ходе которой полиненасыщенные жирные кислоты превращаются в липидные гидропероксилы. Эти молекулы крайне нестабильны и быстро распадаются на вторичные продукты, такие как альдегиды (4-гидрокси-2,3-ноненаль) и малоновый диальдегид (МДА). Изопростаноиды – другая группа продуктов окисления липидов, они образуются в ходе перекисного окисления арахидоновой кислоты. Уровень изопростаноидов повышен в крови и в выдохе у больных бронхиальной астмой [71]. Окисление липидов нарушает целостность клеточной мембраны и приводит к нарушению её структуры.
Биомедицинский интерес представляют лишь три оксида азота: закись азота (N2O), диоксид азота (NO2) и монооксид азота (NO). NO2 в окружающем воздухе является поллютантом, однако может образовываться in vivo из NO. NO2 запускает перекисное окисление липидов. NO – это маленькая молекула с 1 неспаренным электроном во внешней электронной оболочке. NO образуется с помощью фермента NO синтазы, которая переводит аргинин в цитруллин с образованием монооксида азота [44]. Влияние NO на жизнедеятельность клетки можно свести к его прямым и непрямым эффектам. К прямым воздействиям относят те реакции, в которых NO непосредственно взаимодействует с молекулами-мишенями. В свою очередь опосредованные эффекты NO, осуществляются через продукты его метаболизма – активные формы монооксида азота (RNOS). Свои прямые эффекты NO оказывает в низких концентрация ( 1ммоль/л). Это очень быстрые реакции, как правило с гем-содержащими белками (гуанилатциклаза, цитохром P450, гемоглобин). В этих реакциях NO ведет себя как сигнальная молекула, в различных физиологических процессах (передача нервного импульса, регуляцию АД, расслабление гладкомышечных волокон, регуляция иммунной системы) [27, 63].
Для осуществления непрямых эффектов необходимо взаимодействие NO c супероксид анионом или кислородом с формированием активных форм NO, которые вступают в реакции с биологическими целями. RNOS высоко реактогенны и могут вступать в реакции с белками, липидами и ДНК, что впоследствии может привести к NO-опосредованной гибели клетки. Однако эти реакции возможны только при высокой локальной концентрации NO ( 1ммоль/л) в течение длительного времени. Такие условия создаются вокруг активированных лейкоцитов или других клеток, чувствительных к стимуляции цитокинами [138]. Активированные клетки иммунной системы продуцируют и супероксид анион, и монооксид азота во время реакций респираторного взрыва. В это время может происходить реакция образования пероксинитрита (рис. 3). Одновременно с этим NO стимулирует образование O2 и H2O2 в митохондриях [92]. Причина этого лежит, вероятно, в ингибировании цитохрома С, что приводит к утечке электронов из дыхательной цепи. H2O2 в свою очередь участвует в up-регуляции экспрессии NO-синтазы через активацию ядерного фактора В (NF-В).
Методика забора крови и подготовки материала
Известно, что альбумин, кроме транспорта широкого класса органических веществ, участвует в поддержании и регуляции осмотического давления, обмене оксида азота, обладает антиоксидантными свойствами [61]. Связывая СР альбумин выполняет функцию внеклеточного антиоксиданта за счет окисления своей свободной SH-группы. Перехватывая свободные радикалы, альбумин подвергается окислительной модификацией и теряет свои транспортные свойства. Изменение транспортных свойств альбумина можно определить по изменению его способности связывать ряд флуоресцирующих соединений зондов, в том числе и зонда К-35 [6]. В ряде работ показано, что связывающая способность зонда К-35 существенно меняется при сердечно-сосудистых заболеваниях. Одной из причин таких изменений может быть свободнорадикальная модификация альбумина.
Интенсивность флуоресценции, зависящая от общего количества альбумина в плазме, называется «общая концентрация альбумина» (ОКА). Количество полноценного альбумина, обладающего нормальными свойствами, в том числе нормальной связывающей способностью, определяемой наличием свободных участков связывания в молекуле альбумина, называется «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) [60]. При оксидативном стрессе ЭКА снижается даже при сохранении ОКА. Соотношение ЭКА/ОКА является одним из параметров, отражающих антиоксидантную резистентность плазмы. В норме ЭКА/ОКА=1. При оксидативном стрессе ЭКА/ОКА снижается.
Кобальт-связывающая способность альбумина Большое количество оксидантов и СР, высвобождаемых в системный кровоток при разрыве атеросклеротической бляшки, повреждают как непосредственно компоненты крови, так и альбумин, в результате этого образуется так называемый ишемически-модифицированный альбумин (ИМА). Впервые об этом маркёре окислительного стресса заговорили в 1990-х [26]. Во время ишемии происходит повреждение N-терминального участка молекулы альбумина (в норме этот участок является местом связывания тяжелых металлов – кобальта, меди и никеля) [60]. Наиболее вероятными причинами повреждения альбумина считают гипоксию, ацидоз и СР [118]. В результате образования ИМА уменьшается число мест для связывая кобальта, вследствие чего концентрация этого металла в крови повышается. Несвязанный кобальт может реагировать с хромогеном (дитиотреитол), полученный в результате этой реакции комплекс может быть измерен хроматографически. Данный факт лежит в основе большинства методов определения ИМА с помощью кобальт-связывающей способности альбумина (КССА).
КССА является чувствительным маркёром для ишемии миокарда: КССА снижается в первые минуты после начала ишемии, сохраняется сниженной в течение 6 часов и приходит к нормальным значениям к 12 часу от начала ишемии [21]. Многие исследования показали высокую чувствительность КССА в диагностике ОКС [28, 36, 55, 59, 139], однако учитывая низкую специфичность, этот показатель имеет огромную отрицательную прогностическую ценность в те сроки, когда тест на тропонин не информативен.
Так в исследование Sina et al. [117] было включено 208 пациентов, поступивших в отделение неотложной помощи с диагнозом ишемия миокарда в течение 3-х часов от начала болевого синдрома. В этом исследовании окончательный диагноз устанавливался на основании данных физикального осмотра, анамнеза, серийного измерения тропонина Т и данных медицинских записей. Чувствительность КССА в отношении ишемической природы боли в груди составила 82%, специфичность 46%, отрицательная прогностическая ценность 59%, положительная прогностическая ценность 72%. Показатель был более чувствителен при комбинации с уровнем тропонина Т и данными 12 канальной ЭКГ, выявляя 95% пациентов с болью в груди ишемического генеза. Проведенный мета-анализ [82] показал, что КССА имеет 91% отрицательную прогностическую ценность для исключения у пациента диагноза ОКС. Этот показатель возрастает до 97% при отрицательном тропонине Т и отсутствии или недиагностических изменениях на ЭКГ.
В настоящее время на основании клинических исследований твердо установлено, что фибриноген сам по себе является независимым фактором риска атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [23, 34, 107]. Фибриноген является одним из белков острой фазы: повышенный уровень этих белков отражает интенсивность системного и локального воспаления. Так, уровень фибриногена плазмы крови резко возрастает у больных с острым коронарным синдромом [110]. Повышенный уровень фибриногена в плазме крови способствует усилению процессов тромбообразования (риск развития тромбозов), изменению реологических свойств крови (возрастание вязкости, нарушения микроциркуляции), повышению адгезивных свойств сосудистого эндотелия, формированию и росту атеросклеротической бляшки. В значительно меньшей степени клинически обоснована, но тем не мене широко представленная в литературе точка зрения о патогенетической значимости так называемого «окисленного» фибриногена - фибриногена, модифицированного в условиях интенсификации процессов свободно радикального окисления белков, которое имеет место при ряде патологических состояний [115]. Существует ряд работ на эту тему, в которых фибриноген подвергают плохо контролируемому окислению в модельных системах, получают продукт, который теряет свойства исходного белка и приобретает свойства, у фибриногена отсутствующие [8].
Таким образом, в настоящее время представления об особом участии окислительно-модифицированного ФБ в патогенетических процессах, ведущих к развитию таких заболеваний, как атеросклероз, существуют лишь на уровне гипотезы. Это связанно, прежде всего, с отсутствием реальных методов селективного определения степени окислительной модификации индивидуальных белков в клинических образцах плазмы – методов, практически пригодных для проведения клинических исследований.
Как было сказано ранее, ИБС и её осложнения являются одними из ведущих причин смертности населения Российской Федерации. При этом смертность среди пациентов с различными клиническими формами ОКС значительно варьирует. Так, риск смерти у больных с инфарктом миокарда с подъёмом сегмента ST значительно выше, чем у пациентов с нестабильной стенокардией или с ИМ без подъёма сегмента ST.
За последние десятилетия предложено несколько шкал для стратификации риска ранних (в течение 30 дней) и поздних неблагоприятных сердечнососудистых событий при ОКС. Для оценки риска у пациентов с ИМ с подъёмом сегмента ST можно использовать шкалу TIMI [131], индекс TIMI [14], шкалу GRACE [111], индекс риска, предложенный Zwolle и соавт. для пациентов после первичного ЧКВ [112], шкалу CADILLAC [109]. Пациентов с нестабильной стенокардией и ИМ без подъёма сегмента ST, учитывая сходный патогенез и одинаковую тактику лечения в настоящее время объединяют под термином ОКС без подъёма сегмента ST [17, 38]. У этих больных можно использовать шкалу GRACE и TIMI для пациентов с нестабильной стенокардией/ИМ без подъёма сегмента ST [20].
ТБК-реактивные продукты – малоновый диальдегид
Различий в содержании МДА после медь-индуцированного окисления плазмы между пациентами с различными формами ОКС при поступлении и через 7 дней выявлено не было (109±36,5 нмоль/мл у пациентов с ИМспST и 95,7±25 нмоль/мл при ОКСбпST; р=0,271).
Нами выявлена положительная корреляция между уровнем МДА после медь-индуцированного окисления плазмы в первые 24 часа после поступления с этим же показателем на 7 сутки. Мы выявили значимые корреляционные связи между МДА после медь-индуцированного окисления плазмы и показателями липидного обмена: положительная связь с общим холестерином и триглицеридами (r=0,324; p=0,002 и r=0,498; p 0,001 соответственно), а также с другими показателями оксидативного стресса, определенными в первые 24 часа после поступления пациентов – общей и эффективной концентрацией альбумина, табл. 20.
Общая концентрация альбумина (ОКА) в первые сутки и через 7 дней после поступления составила 35,3±2,5 г/л и 35,7±3,7 г/л соответственно. Достоверной динамики показателя в течение 7 дней не отмечено (рисунок 19). Различий в содержании ОКА между пациентами с различными формами ОКС при поступлении и через 7 дней выявлено не было (35,5±2,3 г/л у пациентов с ИМспST и 34,6±3 г/л при ОКСбпST; р=0,133). Рисунок 19. Динамика ОКА у пациентов с ОКС В первые сутки после поступления эффективная концентрация альбумина составила 30,6±3,7 г/л, к 7 суткам заболевания отмечалось достоверное снижение ЭКА на 15% (р 0,001), соответственно – 25,8±4,2 г/л (рисунок 20). Различий в содержании ЭКА между пациентами с различными формами ОКС при поступлении выявлено не было (30,8±3,5 г/л у пациентов с ИМспST и 29,9±4,5 г/л при ОКСбпST; р=0,332). К 7 дню болезни эффективная 29,9±4,5 концентрация альбумина у больных с HMcnST была достоверно ниже (25±4,2 г/л против 28,2±3,3 г/л при OKC6nST; р=0,022).
Все используемые на настоящий момент методики определения кобальт-связывающей способности альбумина (КССА), в том числе и та, которую использовали мы, основываются на определении свободного кобальта. Этот показатель обратно пропорционален КССА. Уровень свободного кобальта в первые сутки и через 7 дней после поступления составил 0,38±0,06 ед. опт. пл./мл и 0,38±0,07 ед. опт. пл./мл соответственно. Достоверной динамики показателя не отмечено (рисунок 22). Рисунок 22. Динамика уровня свободного кобальта у пациентов с ОКС
Были выявлено множество достоверных корреляционных связей между КССА и маркёрами поражения миокарда (изменениями ЭКГ, кардиоспецифическими ферментами и другими клинико-инструментальными показателями), а также с другими показателями оксидативного стресса, определенными в первые 24 часа после поступления (табл. 22).
Учитывая столь значительное количество обратных корреляционных связей с показателями объёма поражения миокарда, было предположено, что КССА различна у больных с разными типами ОКС. При сравнении содержания свободного кобальта у пациентов с различными формами ОКС, выявлено, что у пациентов с ОКС без подъёма сегмента ST этот показатель достоверно выше (0,41±0,07 ед. опт. пл./мл против 0,38±0,05 ед. опт. пл./мл при ИМспST; р=0,038). Таким образом КССА у пациентов с ОКСбпST ниже чем у пациентов с ИМспST, рисунок 23.
Содержание карбонильных групп белков в первые сутки и через 7 дней после поступления составило 0,78±0,29 нмоль/мг и 0,7±0,2 нмоль/мг соответственно. Достоверной динамики показателя не отмечено (рисунок 24).
Различий в содержании карбонильных групп белков между пациентами с различными формами ОКС при поступлении и через 7 дней выявлено не было (0,77±0,26 нмоль/мг у пациентов с ИМспST и 0,8±0,36 нмоль/мг при ОКСбпST; р=0,765). Нами была выявлена положительная корреляция между уровнем карбонильных групп в первые 24 после поступления и этим же показателем на 7 сутки, r=0,276, p=0,094. Более никаких значимых корреляционных связей с клинико-лабораторными показателями выявлено не было.
Согласно исследованиям, проведенным сотрудниками лаборатории биофизических основ патологии НИИ ФХМ, среднее содержание окислительной модификации фибриногена у здоровых добровольцев составило 0,89±0,08 нмоль/нг фибриногена.
Содержание карбонильных групп фибриногена (окисленная модификация фибриногена) составило 1,1±0,29 нмоль/мг в первые 24 часа после поступления и 1,12±0,28 нмоль/мг на 7 сутки. Значимой динамики показателя выявлено не было (рисунок 25).
Различий в содержании карбонильных групп фибриногена между пациентами с различными формами ОКС при поступлении и через 7 дней выявлено не было (1,1±0,3 нмоль/мг у пациентов с ИМспST и 1,06±0,21 нмоль/мг при ОКСбпST; р=0,641).
Продукты перекисного окисления липидов у пациентов с ОКС
Все эти факты позволяют предположить, что окислительный стресс влияет не только на процесс атерогенеза, но и на эффективность лечения пациентов с ОКС. Несомненно, что необходимо более подробное изучение влияния окислительной модификации фибриногена на течение, прогноз и эффективность лечения пациентов с ОКС.
Помимо таких относительно неспецифических показателей как содержание карбонильных групп белков в работе исследовалась окислительная модификация основного белка плазмы крови – альбумина. На настоящий момент существует несколько методик для оценки степени окисленности альбумина: определение кобальт-связывающей способности альбумина и расчет эффективной концентрации альбумина.
Хорошо известно, что под действием СР альбумин изменяет свою конформацию, что в частности отражается на участке молекулы, ответственном за связывание тяжелых металлов. Под действием окислительного стресса, число мест для связывания в этом участке (кобальт-связывающая способность альбумина) уменьшается. Традиционным методом оценки этого показателя является инкубирование сывороточного альбумина с кобальтом и последующая спектрофотометрическая оценка количества свободного кобальта в исследуемой смеси. Таким образом, чем выше содержание свободного кобальта в образце, тем ниже кобальт-связывающая способность альбумина.
Кобальт-связывающая способность альбумина не изменялось у пациентов с ОКС в течение первых 7 дней болезни. Было обнаружено множество достоверных корреляционных связей между КССА и маркёрами некроза миокарда, ни одна из этих корреляций не достигала даже средней степени силы.
Также отмечено, что КССА достоверно ниже у пациентов с ОКСбпST (р=0,038). Это вероятно связано с тем, что ОКСбпST наиболее часто ассоциировано с многососудистым поражением коронарного русла и, возможно, большим выходом свободных радикалов в плазму крови.
Различий в относительном риске наступления первичной конечной точки в зависимости от КССА не выявлено. При анализе отдельных компонентов ПКТ выявлено, что у пациентов с высоким содержанием свободного кобальта (т.е. низкой КССА) относительный риск перенести нефатальный инфаркт миокарда составляет 2,45 (95% ДИ 0,1 – 4,8; р=0,048) по сравнению с остальными пациентами.
Данные мировой литературы в основном посвящены возможностям использования КССА для дифференциальной диагностики боли в грудной клетке [28, 36, 55, 59, 139]. Для оценки прогноза у пациентов с ОКС этот показатель не исследовался. В работе показано, что КССА не влияет на вероятность наступления ПКТ, при этом относительный риск нефатального инфаркта миокарда у пациентов с низкой КССА возрастает. Отметим, что среди пациентов, включенных в исследование, не было ни одного тромбоза стента. Таким образом, все нефатальные ИМ обусловлены коронарным атеросклерозом и, следовательно, снижение КССА у этих пациентов патогенетически обосновано.
В связи с этим КССА для оценки риска развития рецидива ИМ у пациентов с ОКС может быть использована в сроки, когда этот показатель уже неинформативен для дифференциальной диагностики ОКС (более 6 часов от начала симптомов).
Помимо КССА, оценивалась общая концентрация альбумина, а также функциональная активность этого белка (методом связывания его с флуоресцентным зондом К-35 – эффективная концентрация альбумина) и отношение ЭКА к ОКА.
Средние цифры ОКА у пациентов с ОКС довольно низкие и находятся в диапазоне нижней границы нормы для этого показателя. ОКА не изменялась в течение 7 дней. По сравнению с пациентами со стабильной стенокардией напряжения ОКА у пациентов с ОКС значительно ниже [4]. Сильных корреляционных связей этого показателя с клинико-лабораторными данными не обнаружено.
Показатель функциональной активности альбумина – ЭКА также ниже у пациентов с ОКС по сравнению с больными со стабильной стенокардией [4]. ЭКА достоверно снижается на 15% к 7 дню госпитализации (р 0,001). Сильных корреляционных связей этого показателя обнаружено не было.
Отношение ЭКА к ОКА снижено у пациентов с ОКС в течение всего срока наблюдения. ЭКА/ОКА претерпевает ту же динамику, что и ЭКА, и снижается на 16% к 7 дню наблюдения (р 0,001). При этом по сравнению с исследованием у больных со стабильной ИБС [4] отношение ЭКА к ОКА не отличается. Вероятно, это связано с тем, что общая концентрация альбумина у пациентов с ОКС по сравнению с больными со стабильной ИБС снижена значительно, в то время как ЭКА различается не столь разительно.
При анализе ПКТ различий в ЭКА и ЭКА/ОКА выявлено не было. При анализе относительного риска наступления конечной точки у пациентов с низкой ОКА (ниже 34 г/л) с помощью регрессионной модели Кокса, получено значение ОР 2,7 (95% ДИ 1,38 – 5,3, р=0,004). При этом у пациентов с низким риском согласно традиционным шкалам (TIMI) ОР наступления первичной конечной точки у пациентов с низкой ОКА возрастает до 6,29 (95% ДИ 2,1 – 18,9; р=0,001). Необходимо отметить, что столь значительное увеличение ОР ПКТ обусловлено преимущественно развитием ранней постинфарктной стенокардии (ОР 6,3; 95% ДИ 1,6 – 23,6; р-0,006).