Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 13
1.1. История изучения атеросклероза 13
1.2. Окислительная модификация ЛНП в патогенезе атеросклероза 14
1.3. Антитела к окисленным ЛНП 20
1.4. 2-гликопротеин I и антитела к нему 22
1.5. Белок теплового шока 60 и антитела к нему 24
1.6. Заключение по обзору литературы 27
Глава II Материалы и методы 29
2.1. Клинический материал 29
2.2. Лабораторные методы 34
2.3. Инструментальные методы 39
2.4. Статистическая обработка 41
Глава III Результаты 43
3.1. Показатели липидного профиля 43
3.2. Маркеры воспаления - мономерный СРБ, высокочувствительный СРБ, интерлейкин 6 48
3.3. Окисленные ЛНП и антитела к ним 53
3.3.5. Влияние терапии статинами на уровень окисленных ЛНП и антител к ним 63
3.3.6. Сопоставление уровней окисленных ЛНП, антител к ним и маркеров воспаления со значениями SYNTAX Score 65
3.4. Аутоантитела к ЛНП человека. ЛНП модифицированные малоновым диальдегидом. ЛНП модифицированные метилглиоксалем з
3.5. IgG человека, модифицированный малоновым диальдегидом. IgG человека, модифицированный метилглиоксалем 72
3.6 Сравнение показателей липидного профиля, окисленных ЛНП, ЛНП и IgG модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем у добровольцев старше 50 лет без клинических признаков ИБС и пациентов трёх основных групп 79
3.7 Антитела к белку теплового шока 60 90
3.8. Антитела к 2-гликопротеину I 94
Глава IV Обсуждение
Выводы 108
Практические рекомендации ПО
Список литературы 111
- Окислительная модификация ЛНП в патогенезе атеросклероза
- Инструментальные методы
- Влияние терапии статинами на уровень окисленных ЛНП и антител к ним
- Сравнение показателей липидного профиля, окисленных ЛНП, ЛНП и IgG модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем у добровольцев старше
Введение к работе
Актуальность проблемы
По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) сердечнососудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире. Ожидается, что к 2020 году острый инфаркт миокарда и мозговой инсульт станут лидирующими причинами смертности в мире, которая составит около 20 млн человек в год, а к 2030 году возрастет до 24 млн человек в год [The World Health Report 2014]. Согласно статистическим данным, в Российской Федерации ССЗ составляют 57% в структуре общей смертности. Среди них ведущее место занимают ишемическая болезнь сердца (ИБС) 50,1% и мозговые инсульты (МИ) 34,5%. В большинстве случаев причиной поражения сердечно-сосудистой системы и главной причиной ИБС является атеросклероз.
Для правильной и своевременной профилактики любых заболеваний
необходимо четкое понимание причин их вызывающих. Благодаря
накопленным в течение последних десятилетий экспериментальным данным
произошел прогресс в понимании механизмов развития атеросклеротического
процесса. В настоящее время атеросклероз рассматривается как
полиэтиологическое заболевание со сложным патогенезом. Количество факторов риска, влияющих на развитие атеросклероза, неуклонно растет. В качестве серьезных кандидатов на роль индукторов иммунного ответа предлагаются различные факторы – окисленные липопротеиды низкой плотности (ОкЛНП), антитела к ним (Ат-окЛНП), 2-гликопротеин I (2ГПI), антитела к 2ГПI (Ат-2ГПI), белки теплового шока (HSP), антитела к HSP (Ат-HSP).
Все больше данных свидетельствуют о том, что ОкЛНП обладают более
атерогенными свойствами, чем нативные липопротеиды низкой плотности
(ЛНП) [Ланкин В.З. и соавт., 2008]. ОкЛНП способствуют активации
макрофагов и внутриклеточному накоплению эфиров холестерина, оказывают
цитотоксическое действие на эндотелиальные клетки, увеличивают
тромбоцитарную активность, стимулируют миграцию и пролиферацию
гладкомышечных клеток, тем самым инициируя развитие атеросклеротического
процесса [Mizuno Y, et al., 2011]. В связи с чем, высказывается предположение,
что содержание ОкЛНП является наиболее важным диагностическим маркером
атеросклероза, чем уровень общего холестерина (ХС) и ЛНП. ОкЛНП
считаются ключевыми факторами локального воспаления и дестабилизации атеросклеротических бляшек. Окислительная модификация индуцирует образование иммуногенных эпитопов в молекулах ЛНП, что приводит к
образованию специфических антител против них. Доказана способность ОкЛНП взаимодействовать с Ат-окЛНП, образуя иммунные комплексы, оказывающие дополнительное повреждающее действие на эндотелий.
Последнее время все чаще обсуждается вопрос о возможности включения
в систему стратификации риска данных об уровне проатерогенных антигенов и
аутоантител к ним с целью усовершенствования современной оценки степени
риска ССЗ. Рассматривается новый подход к лечению и профилактике
атеросклероза – перспектива создания противоатеросклеротической вакцины.
Основная стратегия иммуномодуляции состоит в подавлении проатерогенных и
активации атеропротекторных иммунных факторов. Однако следует признать,
что роль ОкЛНП и Ат-окЛНП в атеросклеротическом процессе до сих пор
четко не выяснена. Сложность состоит в том, что имеющиеся в литературе
данные о роли ОкЛНП и Ат-окЛНП в атеросклеротическом процессе, зачастую,
противоречивы. Согласно различным источникам, аутоантитела к
проатерогенным аутоантигенам могут оказывать прямо противоположные эффекты: проатерогенный и атеропротекторный [Uusitupa MI, et al., 1996, Lehtimki T, et al., 1999]. Поэтому вопрос о роли проатерогенных антигенов и антител к ним в атерогенезе по сей день остается актуальным, как и поиск средств воздействия на данные показатели.
Цель исследования:
Определить содержание и оценить целесообразность использования в клинической практике сывороточных проатерогенных аутоантигенов и антител к ним у больных с различной выраженностью коронарного атеросклероза.
Задачи:
-
Определить и сравнить содержание в сыворотке крови окисленных ЛНП и антител к ним у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и здоровых лиц.
-
Определить корреляционную зависимость между уровнем окисленных ЛНП и уровнем антител к ним у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и здоровых лиц.
-
Сопоставить содержание в сыворотке крови окисленных ЛНП и антител к ним с уровнем общего холестерина, липопротеидов низкой плотности, липопротеидов высокой плотности, высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ), интерлейкина-6 (ИЛ-6) у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и здоровых лиц.
-
Определить и сравнить содержание в сыворотке крови аутоантител к ЛНП человека, ЛНП, модифицированных метилглиоксалем, ЛНП, модифицированных малоновым диальдегидом, IgG, модифицированных метилглиоксалем, IgG, модифицированных малоновым диальдегидом и мономерного СРБ (Моно-СРБ) у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и здоровых лиц.
-
Определить и сравнить содержание в сыворотке крови антител к 2-гликопротеину I и антител к белку теплового шока 60 у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и здоровых лиц.
Научная новизна
Впервые показано отсутствие различий в уровне сывороточных
окисленных ЛНП у больных со стенозирующим и нестенозирующим
коронарным атеросклерозом, добровольцев старше 50 лет без клинических
признаков ИБС и молодых практически здоровых добровольцев.
Продемонстрировано, что уровень антител к окисленным ЛНП у молодых
практически здоровых лиц достоверно выше, чем у больных со стенозирующим
коронарным атеросклерозом. Установлено, что уровень IgG,
модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем, у молодых практически здоровых лиц достоверно выше, чем у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом.
Впервые показано отсутствие взаимосвязи между уровнем окисленных ЛНП и уровнем антител к ним у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и у молодых практически здоровых лиц. Установлено отсутствие связи между уровнем окисленных ЛНП и антител к ним с показателями липидного профиля и маркерами воспаления у больных со стенозирующим и нестенозирующим коронарным атеросклерозом и у молодых практически здоровых лиц. Продемонстрировано, что уровень ОкЛНП у сопоставимых по возрасту больных со стенозирующим и нестенозирующим атеросклерозом КА, находящихся на гиполипидемической терапии статинами, и у добровольцев старше 50 лет, не принимающих статины, достоверно не различается.
Практическая значимость
Результаты работы показали, что уровни окисленных ЛНП, ЛНП модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем у больных
ИБС не могут быть использованы в клинической практике для оценки тяжести коронарного атеросклероза. Тем не менее, следует учитывать, что у больных с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий уровень антител к окисленным ЛНП, IgG модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем достоверно ниже, чем у молодых практически здоровых лиц.
Апробированы методы определения ЛНП, модифицированных
малоновым диальдегидом и метилглиоксалем, и IgG, модифицированных
малоновым диальдегидом и метилглиоксалем, с использованием
моноклональных антител отечественного производства, которые показали
более высокую информативность по сравнению с определением окисленных
ЛНП и антител к ним стандартными наборами реактивов зарубежных
производителей, что позволяет рекомендовать отечественные тест-системы при
проведении научных исследований в дальнейшем. Учитывая более высокую
физико-химическую стабильность и среднюю концентрацию в сыворотке крови
молекул IgG, определение уровней IgG, модифицированных малоновым
диальдегидом и метилглиоксалем можно использовать наряду с определением
уровней ЛНП, модифицированных малоновым диальдегидом и
метилглиоксалем для оценки процессов, связанных с альдегидной
модификацией белков и липопротеинов.
Внедрение в практику полученных результатов
Результаты работы внедрены в научную и практическую работу ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.
Апробация диссертации
Материалы доложены на межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ по апробации кандидатских диссертаций 21.07. 2015г., Протокол №25. Диссертация рекомендована к защите.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Основные положения работы были представлены на 17th triennial congress of the International Atherosclerosis Society, Amsterdam, may 2015 (постер № 828, 830)
и на III Международном образовательном форуме «Российские дни сердца», Москва, апрель 2015 (материалы форума).
Объем и структура диссертации
Окислительная модификация ЛНП в патогенезе атеросклероза
В течение последних лет все большее внимание уделяется аутоиммунной теории патогенеза атеросклероза и роли в атерогенезе иммунных факторов, таких как проатерогенные аутоантигены и аутоантитела к ним. Аутоиммунные факторы играют одну из ключевых ролей в формировании и дальнейшем развитии атеросклеротических бляшек [7]. Есть несколько антигенных стимулов, которые участвуют в патогенезе атеросклероза. Наиболее выраженными атерогенными свойствами обладают ОкЛНП. [8]. Они могут выступать в качестве аутоантигенов за счет взаимодействия с Толл-подобными рецепторами (TLR), активируя Т-лимфоциты, ответственные за индукцию и поддержание локального иммунного ответа в атеросклеротической бляшке.
Достоверно известно, что высокий уровень циркулирующих липидов, таких как ОкЛНП, является одним из пусковых моментов в развитии атеросклеротического процесса [9, 10]. Нарушение баланса между про- и антиоксидантной системами организма приводит к развитию окислительного стресса, что в комплексе с наличием гиперлипидемии создает благоприятные условия для перекисного окисления липидов (ПОЛ). При пероксидации липидов образуются первичные продукты окисления – гидроперекиси или моноциклические эндоперекиси, которые затем метаболизируются во вторичные продукты ПОЛ – различные альдегиды (малоновый диальдегид (МДА), метилглиоксаль (МГ) ), 4-гидрокси-2-ноненаль, ацетальдегид, кротоновый альдегид) и третичные продукты ПОЛ – основания Шиффа. В соответствии с этим, в зависимости от степени окисленности и соотношения первичных и вторичных продуктов окисления следует различать «окисленные» липопротеины низкой плотности, содержащие гидроперикиси и «модифицированные» природными дикарбонилами ЛНП [11]. Токсичные продукты перикисного окисления липидов помимо атерогенной модификации ЛНП приводят к дисфункции эндотелия и другим сосудистым нарушениям, чем способствуют прогрессированию атеросклероза. [12].
Окислительная модификация ЛНП в общей циркуляции выражена слабо. Основной процесс клеточного окисления ЛНП in vivo происходит в субэндотелиальном слое артериальной стенки в условиях высокой концентрации ионов металлов переменной валентности (Cu2+ и Fe2+) и в присутствии активных кислородных метаболитов, секретируемых макрофагами, Т-лимфоцитами и пенистыми клетками (Рис. 1) [13]. Накопление ОкЛНП в интиме стимулирует секрецию воспалительных цитокинов, экспрессию молекул адгезии и индуцирует миграцию моноцитов в субэндотелиальное пространство [14], где они дифференцируются в макрофаги. Макрофаги экспрессируют по меньшей мере шесть структурно различных видов рецепторов клеточной поверхности для модифицированных форм ЛНП, таких как скавенджер-рецепторы класса А (SR-A), класса B (SR-BI), CD36, CD68, лектиноподобные рецепторы и скавенджер-рецепторы, связывающиеся с фосфатидилсерином [15, 16, 17, 18]. Считается, что основными рецепторами, ответственными за поглощение ОкЛНП и приводящими к липидной перегрузке макрофагов, являются SR-А, SR- BI и CD36 [19].
CD36 – гликозилированный белок (53 кДа) с N- и С-концевыми трансмембранными доменами, определяемый как скавенджер-рецептор класса B. Этот белок был первоначально идентифицирован как интегральный гликопротеиновый рецептор мембраны тромбоцитов для связи с тромбоспондином-1. В настоящее время доказана его способность связывать и захватывать ОкЛНП [20]. SR-А является тримерным гликопротеином в 200 кДа, состоящим из мономеров с одним трансмембранным доменом, связывающимся с ацетил-ЛНП и ОкЛНП [21]. SR-BI – N- гликозилированный белок, еще один член семейства скавенджер-рецепторов класса B [22, 23].
Окислительная модификация преобразует ЛНП в форму, захватываемую макрофагами в десятки раз быстрее, чем нативные ЛНП. [12] Такое активное поглощение ОкЛНП макрофагами приводит к образованию нагруженных липидами пенистых клеткок [24, 25], которые в дальнейшем подвергаются апоптозу, в результате чего кристаллы холестерина попадают в экстрацеллюлярное пространство и провоцируют процесс воспаления сосудистой стенки вследствие своей высокой цитотоксичности. В то же время, активированные макрофаги продуцируют ряд провоспалительных молекул, включая хемокины, которые стимулируют трансформацию и миграцию гладкомышечных клеток (ГМК) из медии в интиму сосуда [26, 27]. ГМК приобретают способность продуцировать элементы соединительной ткани (коллаген, эластин и гликозамингликаны), которые в дальнейшем используются для построения фиброзного каркаса атеросклеротической бляшки, который отделяет липидное ядро от просвета сосуда. Одновременно происходит васкуляризация очага атеросклеротического поражения. Формируется типичная атероматозная бляшка, которая, с течением времени, увеличиваясь в объеме, может вести к снижению кровотока в сосуде или же к разрыву с развитием последующих осложнений (инфаркт миокарда (ИМ), мозговой инсульт).
В развитии и поддержании воспалительного процесса при атеросклерозе следует отметить и особо важную роль СРБ, который под влиянием ИЛ-6 синтезируется гепатоцитами, однако может также продуцироваться присутствующими в атеросклеротической бляшке макрофагами и лимфоцитами. СРБ является высокочувствительным маркёром воспаления и тканевой деструкции. Доказана его способность связываться с ОкЛНП и, накапливаясь в местах атеросклеротического поражения артерий, поддерживать системное и локальное хроническое воспаление, в связи с чем, СРБ считается вторичным триггером обострения воспалительного процесса в бляшке. [29, 30]. В 1983 г была обнаружена новая форма СРБ, состоявшая, в отличие от нативной формы, не из пентамеров а из свободных мономеров СРБ. В настоящее время изучение роли мономерного СРБ в воспалительном ответе вызывает большой интерес, так как существующие данные свидетельствуют о том, что именно переход пентамерной формы СРБ в мономерную вызывает повышение концентрации компонентов воспалительного ответа, ускоряет агрегацию тромбоцитов и секрецию серотонина, стимулирует высвобождение интерлейкина [31, 32, 33].
Связь уровня ОкЛНП с развитием атеросклероза изучалась в ряде работ. Помимо атеросклеротических бляшек различной локализации, ОкЛНП обнаруживаются и в атеросклеротически измененных аортальных клапанах [34]. Известно также, что накопление ОкЛНП в плазме крови больных атеросклерозом ингибирует синтез простациклина в артериальной стенке, что может существенно повышать опасность возникновения инфаркта миокарда вследствие тромбоза коронарных сосудов [35]. Интересные данные получены российскими авторами. При сравнении пациентов с ишемической болезнью сердца и артериальной гипертонией с группой здоровых добровольцев, не страдающих сахарным диабетом, ожирением, с нормальным артериальным давлением, без сосудистых и эндокринных заболеваний в анамнезе, у больных с ишемической болезнью сердца отмечалось увеличение уровня ОкЛНП [36]. Однако, в похожей работе при исследовании уровня ОкЛНП у здоровых лиц различных возрастных категорий и у пациентов с ССЗ, наиболее высокий уровень ОкЛНП регистрировался у молодых здоровых пациентов. Что, по мнению авторов, может быть обусловлено более высокой интенсивностью метаболических процессов, свойственных для молодого возраста. Хотя, в этом же исследовании в группе пациентов, страдавших ИБС, наблюдалось возрастание концентрации ОкЛНП с усилением тяжести заболевания [37]. В то же время имеются данные о том, что наличие ОкЛНП не имеет достоверной связи с такими главными факторами риска ИБС, как гиперлипидемия, гипертензия, курение и диабет, в связи с чем, элиминация этих факторов риска, возможно, не повлияет на уровни ОкЛНП. Поэтому остается актуальным поиск средств воздействия на эти крайне атерогенные частицы.
Следует отметить, что окисление ЛНП может приводить к образованию минимально измененных ЛНП, которые распознаются ЛНП-рецепторами макрофагов, но не распознаются скавенджер-рецепторами [38]. Эти свойства отличают минимально модифицированные ЛНП от более глубоко модифицированных окисленных ЛНП, которые не распознаются ЛНП-рецепторами, но усиленно поглощаются скавенджер-рецепторами макрофагов, такими как CD36 и SR-BI [39]. Тем не менее, минимально измененные ЛНП обладают многими проатерогенными свойствами, такими как индукция адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам, производство колониестимулирующего фактора, хемотаксического протеина-1 моноцитов и тканевого фактора [38, 40, 41]. Кроме того, минимально измененные ЛНП (также как и окисленные ЛНП) индуцируют полимеризацию актина и распространение макрофагов, что приводит к таким проатерогенным последствиям как ингибирование фагоцитоза клеток, подвергшихся апоптозу, и повышение поглощения ОкЛНП [42].
По мнению сторонников «аутоиммунной» теории атеросклероза, окисленные фосфолипиды и эфиры холестерина, входящие в состав ЛНП, распознаются TLR-ассоциированными механизмами врожденного иммунитета как «маркеры повреждения». Кроме того, уровни проатерогенных аутоантигенов и аутоантител к ним могут обладать прогностическим значением в отношении риска сердечно-сосудистых осложнений.
Инструментальные методы
В биохимическом анализе крови определяли уровень глюкозы, креатинина, аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), билирубина.
Концентрацию ХС, ЛНП, ЛВП, триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови определяли ферментативным способом на многоканальном биохимическом анализаторе «Architect С–800» фирмы «Abbott» (США). Результаты выражали в ммоль/л.
Для определения уровня сывороточных проатерогенных аутоантигенов, аутоантител к ним, высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ), мономерного С-реактивного белка (Моно-СРБ) и ИЛ-6 однократно утром натощак проводился забор 20 мл крови из локтевой вены в пробирки без консерванта. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 1500 G в течение 15 минут. Полученную сыворотку раскапывали в микропробирки типа эппендорф, которые немедленно замораживали и хранили при температуре -70 градусов по Цельсию.
Определение уровня высокочувствительного С-реактивного белка (вчСРБ) в сыворотке крови проводили нефелометрическим методом на анализаторе белков крови «BN ProSpec» фирмы «Dade-Behring» (Германия) с использованием набора реактивов CardioPhase hsCRP фирмы «Siemens» (США). Диапазон измерения: 0.175-500 мг/л. Чувствительность: 0.175 мг/л. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови определяли методом твердофазного хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (ИФА), на анализаторе «IMMULITE 1000» фирмы «Siemens Diagnostics» (США) с использованием набора реактивов IL-6 фирмы «Siemens Diagnostics» (США). Диапазон измерения: 2-300 пг/мл. Чувствительность: 2 пг/мл.
Для количественного определения сывороточных антител классов Ig G/A/M суммарно к 2ГПI применялся метод ИФА. Определение проводилось на спектрофотометре «Sunrise» фирмы «Tecan» (Австрия) при длине волны 450нм с использованием набора реактивов Anti-2-Glycoprotein I Screen фирмы «ORGENTEC» (Германия). Диапазон измерения 0.5-90 Е/мл. Чувствительность: 0.5 Е/мл.
Количественное определение Ат-HSP60 в сыворотке крови также проводилось методом ИФА на спектрофотометре «Sunrise» фирмы «Tecan» (Австрия) при длине волны 450нм. Для определения в сыворотке крови антител классов Ig G/A/M суммарно к человеческому HSP60 использовался набор реактивов Anti-HSP60 IgG/A/M (human) фирмы EnzoLifeSciences Inc (США). Диапазон измерения: 7.81-250 нг/мл Чувствительность: 2.88 нг/мл.
Основным этапом работы было определение уровня окисленных липопротеидов низкой плотности и антител к ним.
Количественное определение ОкЛНП и АТ-ОкЛНП в сыворотке крови проводилось методом ИФА на спектрофотометре «Sunrise» фирмы «Tecan» (Австрия) при длине волны 450нм. Для определения ОкЛНП использовался коммерческий набор реактивов MDA-oxLDL фирмы «Biomedica» (Австрия). Диапазон измерения: 0.8-10 мкг/мл. Чувствительность: 0.8 мкг/мл. При определении АТ-ОкЛНП использовался набор реактивов OLAB IgG фирмы «Biomedica» (Австрия). Диапазон измерения: 48-1200 мЕ/мл. Чувствительность: 48 мЕ/мл. В лаборатории иммунохимии ИЭК (руководитель – к.б.н. Е.Е. Ефремов) разработаны и апробированы методические подходы для определения следующих показателей: - Аутоантитела к ЛНП человека (ААТ-ЛНП); -ЛНП человека, модифицированные малоновым диальдегидом (МДА-ЛНП); - ЛНП человека, модифицированные метилглиоксалем (МГ-ЛНП); - IgG человека, модифицированные малоновым диальдегидом (МДА-IgG); - IgG человека, модифицированные метилглиоксалем (МГ- IgG). В вышеуказанной лаборатории проводилось качественное определение ААТ-ЛНП, МГ-ЛНП, МДА-ЛНП, МГ- IgG и МДА-IgG методом твердофазного ИФА с использованием моноклональных антител, предоставленных лабораторией клеточной инженерии ИЭК (руководитель – к.б.н. Т.Н. Власик). Результаты были представлены в относительных единицах ( R) как отношение сигнала исследуемой пробы (А450) к величине cut-off. R= A450 образца/cut-off
Определение концентрации МГ-ЛНП и МДА-ЛНП «сэндвич»-методом твердофазного ИФА: 1. В качестве твердой фазы используется иммуносорбент, представляющий собой 96-луночный пластиковый планшет, на поверхности лунок которого сорбированы мышиные моноклональные антитела 5F8 к ЛНП. 2. В лунки вносятся исследуемые сыворотки или плазмы в растворе для разведения образцов и происходит связывание ЛНП с иммобилизованными на поверхности пластика антителами. 3. После инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов, добавляются вторые моноклональные антитела 6D8, специфичные к МГ-ЛНП или моноклональные антитела 12Е7, специфичные к МДА-ЛНП, меченые биотином, которые соединяются только со связавшимся МГ-ЛНП / МДА-ЛНП и не реагируют с нативными ЛНП. 4. В итоге вносится конъюгат стрептавидина с пероксидазой, который связывается с комплексом антитело-МГ-ЛНП/МДА-ЛНП-антитело-биотин. Образовавшийся в итоге сложный комплекс выявляется с помощью реакции пероксидазы с хромогенным субстратом, при которой происходит окрашивание тетраметилбензидина. 5. После остановки реакции раствором серной кислоты, интенсивность окрашивания в лунках иммуносорбента определяется спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Определение концентрации МГ-IgG и МДА-IgG «сэндвич»-методом твердофазного ИФА: 1. Используется 96-луночный пластиковый планшет, на поверхности лунок которого сорбированы мышиные моноклональные антитела 5F5 к IgG. 2. В лунки вносятся исследуемые сыворотки или плазмы в растворе для разведения образцов и происходит связывание IgG с иммобилизованными на поверхности пластика антителами. 3. После инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов, добавляются вторые моноклональные антитела 6D8 специфичные к МГ- IgG или моноклональные антитела 12Е7 , специфичные к МДА- IgG, меченые биотином, которые соединяются со связавшимся МГ- IgG / МДА- IgG.
Влияние терапии статинами на уровень окисленных ЛНП и антител к ним
Группа больных со стенозирующим атеросклерозом КА и группа молодых практически здоровых добровольцев не различались по уровню Моно-СРБ, однако, уровень вчСРБ и ИЛ-6 был достоверно выше у больных со стенозирующим атеросклерозом КА (Таб. 10, Рис. 9).
Уровень Моно-СРБ, вчСРБ и ИЛ-6 у больных со стенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев. Показатель Стенозирующий атеросклероз КА (n=50) Молодые добровольцы (n=10) Р Моно-СРБ, нг/мл 25,83 (11,50-40,65) 15,68 (2,00-25,00) 0,14 вчСРБ мг/л 2,15 (1,08-4,55) 0,83 (0,44-1,50) 0,02 ИЛ-6 пг/мл 3,00(2,00-4,00) 1,00 (1,00-1,00) 0,001 Рисунок 9. Сравнение уровня Моно-СРБ, вчСРБ и ИЛ-6 у больных со стенозирующим атеросклерозом КА (группа 1) и молодых практически здоровых добровольцев (группа 3). Сравнение уровня мономерного СРБ, высокочувствительного СРБ и интерлейкина 6 у больных с нестенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев
При сравнении больных с нестенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев статистически значимых различий уровня Моно-СРБ и вчСРБ выявлено не было. При этом уровень ИЛ-6 был достоверно выше у больных с нестенозирующим атеросклерозом КА (Таб. 11, Рис. 10).
Таблица 11. Уровень Моно-СРБ, вчСРБ и ИЛ-6 у больных с нестенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев. Показатель Нестенозирующий атеросклероз КА (n=20) Молодые добровольцы (n=10) Р Моно-СРБ, нг/мл 24,75 (16,43-38,25) 15,68 (2,00-25,00) 0,09 вчСРБ мг/л 1,74 (0,63-5,12) 0,83 (0,44-1,50) 0,11 ИЛ-6 пг/мл 3,00(2,00-4,00) 1,00 (1,00-1,00) 0,001 Рисунок 10. Сравнение уровня Моно-СРБ, вчСРБ и ИЛ-6 у больных с нестенозирующим атеросклерозом КА (группа 2) и молодых практически здоровых добровольцев (группа 3).
Сравнение уровня мономерного СРБ, высокочувствительного СРБ и интерлейкина 6 у всех больных с коронарным атеросклерозом и молодых практически здоровых добровольцев При объединении в одну группу всех больных с коронарным атеросклерозом и сравнении с группой молодых практически здоровых добровольцев статистически значимых различий уровня Моно-СРБ не отмечалось. Уровень вчСРБ и ИЛ-6 был достоверно выше у больных с коронарным атеросклерозом, чем у молодых практически здоровых лиц (Таб. 12, Рис. 11). Таблица 12. Уровень Моно-СРБ, вчСРБ и ИЛ-6 у всех больных с коронарным атеросклерозом и молодых практически здоровых добровольцев. Показатель Атеросклероз КА (n=70) Молодые добровольцы (n=10) Р Моно-СРБ, нг/мл 25,58 (13,05-40,60) 15,68 (2,00-25,00) 0,10 вчСРБ мг/л 1,99 (0,75-4,60) 0,83 (0,44-1,50) 0,02 ИЛ-6 пг/мл 3,00 (2,00-4,00) 1,00 (1,00-1,00) 0,001 Рисунок 11. Сравнение уровня Моно-СРБ , вчСРБ и ИЛ-6 у всех больных с коронарным атеросклерозом (группа 1+2) и молодых практически здоровых добровольцев (группа 3).
Исходя из полученных данных, видно, что статистически значимых различий уровня вчСРБ и ИЛ-6 у больных с различной степенью поражения КА не было. Но значения данных показателей были достоверно выше у больных с коронарным атеросклерозом, чем у молодых практически здоровых лиц. Значения Моно-СРБ во всех группах статистически значимых различий не имели. Что вызывает интерес, т.к. была выявлена тесная корреляционная связь между уровнем Моно-СРБ и вчСРБ (r=0,75, p=0,0000) (Рис. 12) и умеренная корреляционная связь между уровнем Моно-СРБ и ИЛ-6 (r=0,45 , p=0,00003) (Рис. 13).
Основным этапом работы было определение и сравнение уровней сывороточных ОкЛНП и АТ-ОкЛНП у пациентов с различной степенью атеросклеротического поражения коронарного русла и практически здоровых лиц. Значения медианы этих показателей у пациентов первых трёх групп (n=80) (Таб. 13) оказались несколько ниже, чем данные предоставленные производителем наборов реактивов, согласно которым медиана ОкЛНП=1,0 мкг/мл, медиана АТ-ОкЛНП=263 мЕ/мл. В ряде проб уровень ОкЛНП оказался ниже чувствительности набора реактивов (0.8 мкг/мл) и был условно принят за 0.01 мкг/мл.
Сравнение уровня окисленных ЛНП и антител к ним у больных со стенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев При сравнении уровней ОкЛНП больных со стенозирующим атеросклерозом КА и молодых практически здоровых добровольцев статистически значимых различий также выявлено не было (Таб. 15). Однако, при сравнении уровней АТ-ОкЛНП у тех же групп пациентов, значения были достоверно выше в группе молодых практически здоровых добровольцев (Таб. 15, Рис. 17).
При объединении всех больных с коронарным атеросклерозом в одну группу и сравнении с группой молодых практически здоровых добровольцев статистически значимых различий в уровнях ОкЛНП выявлено не было, однако, у пациентов из группы здоровых добровольцев сохранялись более высокие значения АТ-ОкЛНП (Таб. 17, Рис. 19).
Сравнение показателей липидного профиля, окисленных ЛНП, ЛНП и IgG модифицированных малоновым диальдегидом и метилглиоксалем у добровольцев старше
Для исключения влияния возраста на данный показатель была набрана дополнительная группа пациентов старше 50 лет без клинических признаков ИБС, не принимающих гиполипидемической терапии. В итоге, уровень сывороточных ОкЛНП у больных с различной степенью атеросклеротического поражения коронарного русла, находящихся на терапии статинами, достоверно не отличался от уровня сывороточных ОкЛНП у пациентов той же возрастной группы без клинических признаков ИБС, не принимающих статины. Что в свою очередь может говорить и об отсутствии влияния терапии статинами на уровень ОкЛНП, хотя в литературе имеются данные, свидетельствующие об обратном [102]. В нашем исследовании также проводилась оценка дозозависимого эффекта статинов на уровень ОкЛНП. При сравнении данных показателей между больными, разделеными на группы в зависимости от принимаемой дозы аторвастатина (10 мг, 20 мг, 30 мг, более 40 мг), статистически значимых различий уровня ОкЛНП выявлено не было.
Что касается АТ-ОкЛНП, то их титры были достоверно выше в группе молодых практически здоровых добровольцев по сравнению с группой больных с тяжелым стенозированием КА (p=0,03). Обращает на себя внимание то, что у последних при оценке степени поражения коронарного русла по шкале SYNTAX Score корреляционной связи между уровнями ОкЛНП, АТ-ОкЛНП и значениями SYNTAX Score не отмечалось, однако, выявлена умеренная корреляция между значениями SYNTAX Score и уровнями вчСРБ и Моно-СРБ.
Как и в случае с ОкЛНП, взаимосвязи между титрами АТ-ОкЛНП и возрастом пациентов выявлено не было. Аналогично, титры АТ-ОкЛНП не продемонстрировали корреляции с показателями липидограммы и маркерами воспаления. Вызывает интерес и то, что между уровнем ОкЛНП и АТ-ОкЛНП также отсутствовала корреляционная связь. При оценке влияния различных доз статинов на содержание АТ-ОкЛНП достоверных различий данного показателя в группах больных, находящихся на терапии статинами в дозе 10 мг, 20 мг, 30 мг и более 40 мг, также не отмечалось.
При оценке содержания ЛНП, модифицированных малоновым диальдегидом (МДА-ЛНП) и метилглиоксалем (МГ-ЛНП) у молодых практически здоровых добровольцев отмечался достоверно более высокий уровень МГ-ЛНП чем у больных со значимым стенозированием КА (p=0,01). При оценке содержания этих же показателей в дополнительно набранной группе уровень МДА-ЛНП и МГ-ЛНП был достоверно выше у добровольцев старшего возраста без клинических признаков ИБС, чем у больных со значимым стенозированием КА.
Также, у молодых практически здоровых добровольцев отмечался достоверно более высокий уровень МДА-IgG (p=0,02) и МГ-IgG (p=0,01), чем у больных со значимым стенозированием КА и больных с начальными атеросклеротическими изменениями КА. Статистически значимой разницы уровня аутоантител к ЛНП (ААТ-ЛНП) в обследованных группах выявлено не было, однако имелась умеренная корреляция между уровнем ААТ-ЛНП и уровнем АТ-ОкЛНП (r=0,35, p=0,003).
Анализ литературы продемонстрировал, что большинство авторов сходится во мнении, что высокий уровень циркулирующих ОкЛНП является одним из пусковых моментов в развитии атеросклероза. Однако, вопрос о роли АТ-ОкЛНП в атерогенезе остаётся спорным. Некоторыми авторами высказывается мнение, что уровни АТ-ОкЛНП повышаются у пациентов с коронарным атеросклерозом [103], острым инфарктом миокарда [56, 60], атеросклерозом церебральных и периферических сосудов [57], могут являться предикторами прогрессирования атеросклеротического поражения сонных артерий [53]. В тоже время в ряде исследований было продемонстрировано отсутствие связи между титрами АТ-ОкЛНП и высоким риском сердечно сосудистой заболеваемости и смертности у пациентов с сахарным диабетом[104], а также преходящее снижение титров АТ-ОкЛНП у пациентов с острым инфарктом миокарда [105] и отсутствие связи между титрами АТ-ОкЛНП и степенью стенозирования коронарных артерий [61]. К сожалению, несмотря на большое количество публикаций по данному вопросу, единого мнения об истинной про- или антиатерогенной роли АТ-ОкЛНП в атерогенезе до сих пор нет.
Отдельно стоит отметить отечественные исследования, данные которых частично согласуются с результатами нашей работы. Е.В. Фефелова и соавторы определяли содержание сывороточных ОкЛНП и антител к ним у 50 практически здоровых лиц в возрасте 18-75 лет, разделенных на 3 возрастные группы у 15 пациентов, страдающих АГ, у 15 больных ИБС со стабильной стенокардией напряжения, 15 больных ИБС с нестабильной стенокардией напряжения и у 15 больных ИБС с острой стадией ИМ. В результате, наиболее высокий уровень ОкЛНП был зарегистрирован у молодых здоровых лиц, хотя, у больных ИБС с усилением тяжести заболевания наблюдалось повышение концентрации ОкЛНП. Содержание АТ-ОкЛНП также оказалось выше у молодых здоровых лиц, чем у больных АГ и ИБС [37].
В ещё одном российском исследовании оценивалось влияние аторвастатина на уровень ОкЛНП и АТ-ОкЛНП у больных ИБС. В работу был включен 21 больной ИБС и 14 здоровых добровольцев. В итоге, у больных ИБС отмечалось повышенное содержание ОкЛНП по сравнению с группой здоровых добровольцев. При этом уровень антител к ОкЛНП у больных ИБС был значительно сниженным по сравнению с группой здоровых лиц. На фоне трехи шестимесячной терапии аторвастатином в дозе 10 мг у больных ИБС наблюдалось достоверное снижение уровня ОкЛНП, однако, уровень антител к ОкЛНП остался неизменным [36].