Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 10
Актуальность проблемы 10
Цель и задачи исследования 14
Научная новизна 15
Положения, выносимые на защиту 16
Научно-практическая ценность 16
Апробация работы 17
Реализация результатов исследования 18
Структура и объём диссертации 19
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 20
2.1. Опыты на животных 20
2.1.1. Объекты исследования 20
2.1.2. Хирургические вмешательства 20
2.1.2.1. Операции на седалищном нерве 20
2.1.2.2. Овариэктомия 22
2.1.3. Фармакологические воздействия 22
2.1.3.1. Неорганическое железо (FeCl3) и железотранспортирующий белок трансферрин 22
2.1.3.2. 17Р-эстрадиол и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (тамоксифен и аналог ралоксифена LY117018) 22
2.1.3.3. Фармакологические воздействия в экспериментах по изучению ретроградного аксонного транспорта 23
2.1.3.4. Короткая интерферирующая РЬЖ в исследованиях синтеза белка
в аксоне 24
2.1.4. Поведенческий тест 24
2.2. Гистологические методы 26
2.2.1. Полутонкие срезы 26
2.2.2. Выявление активности АТФазы миозина 27
2.2.3. Иммуногистохимические методы 28
2.2.3.1. Скелетные мышцы крыс и морских свинок 30
2.2.3.2. Спинной мозг и седалищный нерв мышей 30
2.2.4. Морфометрический анализ Fluorogold-позитивных мотонейронов 31
2.3. Иммуноблотинг 33
2.4. Методы исследования экспрессии генов 35
2.4.1. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией 35
2.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 37
2.4.3. Матричная гибридизация комплементарной ДНК 37
2.5. Радиоавтографические методы 38
2.5.1. Радиоиммунологический метод определения концентрации 17р-эстрадиола в сыворотке крови 38
2.5.2. Радиоавтографический метод выявления 17Р-эстрадиола в нервной ткани 39
2.6. Статистическая обработка результатов 39
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНОВ НА ПОСТТРАВМАТИЧЕСКУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО НЕРВА 40
3.1. Уоллеровская дегенерация и регенерация периферического нерва 40
3.2. Нейропротекторное действие эстрогенов 43
3.3. Влияние 170-эстрадиола на регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 45
3.3.1. Восстановление функционального индекса седалищного нерва 46
3.3.2. Морфометрический анализ регенерации седалищного нерва 48
3.3.3. Иммуноэкспрессия Hsp25 в поясничном отделе спинного мозга 51
3.4. Влияние селективных модуляторов рецепторов эстрогенов на
регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 52
3.4.1. Селективные модуляторы рецепторов эстрогенов 52
3.4.2. Влияние тамоксифена на восстановление функционального индекса седалищного нерва у овариэктомированных мышей 55
3.4.3. Влияния LY117018 на регенерацию седалищного нерва у овариэктомированных мышей 56
3.5. Заключение 60
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ 17Р-ЭСТРАДИОЛА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ В ПОЯСНИЧНОМ ОТДЕЛЕ СПИННОГО МОЗГА 63
4.1. Эстрогеновый комплекс в регуляции экспрессии генов 63
4.2. Экспрессия рецепторов эстрогенов в мотонейронах 66
4.2.1.ИммуноэкспрессияЕКаиЕК|3 66
4.2.2. Экспрессия мРНК ERa и ERp в поясничном отделе спинного мозга .68
4.3. Модуляция экспрессии генов в поясничном отделе спинного мозга овариэктомированных мышей 74
4.4. Заключение 86
ГЛАВА 5. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА И ЭНДОТЕЛИНОВ В МОТОНЕЙРОНАХ СПИННОГО МОЗГА МЫШИ... 89
5.1. Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста и его рецепторов Flt-І и Flk-І 89
5.1.1. Нейропротекторная роль сосудистого эндотелиального фактора
роста 89
5.1.2. Роль VEGF/Flt-І сигнального каскада в аксотомированных мотонейронах мышей-самцов 91
5.1.3. Влияние эстрогенов на экспрессию VEGF у овариэктомированных мышей 94
5.2. Экспрессия рецепторов эндотелинов ЕТД и ЕТВ 98
5.2.1. Нейропротекторное действие эндотелинов 98
5.2.2. Активация эндотелин/ЕТв системы в мотонейронах спинного мозга у мышей-самцов после одностороннего передавливания седалищного нерва 99
5.3. Заключение 102
ГЛАВА 6. РОЛЬ ЭСТРОГЕНОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕХАНИЗМОВ РЕТРОГРАДНОГО АКСОННОГО ТРАНСПОРТА 107
6.1. Альтернативный механизм действия эстрогенов 107
6.2. Методы исследования аксонного транспорта 109
6.2.1. Механизмы регуляции аксонного транспорта 109
6.2.2. Ход эксперимента 110
6.3. Экспрессия, локализация и транспорт рецепторов эстрогенов в периферическом нерве 112
6.3.1. Иммуноэкспрессия ERa и ER(3 в седалищном нерве 112
6.3.2. Аксонный транспорт рецепторов эстрогенов 115
6.4. Влияние 17р-эстрадиола и аналога ралоксифена LY117018 на ретроградный аксонный транспорт 115
6.4.1. Системное и локальное воздействие 17|3-эстрадиола на аксонный транспорт 115
6.4.2. Локальное воздействие аналога ралоксифена LY117018 на аксонный транспорт 119
6.5. Роль эстрогенов в ERK-зависимом механизме регуляции ретроградного аксонного транспорта 120
6.5.1. Исследование роли PI 3-К и МАРК в регуляции аксонного транспорта 120
6.5.2. Влияние аксотомии на активацию ERK 122
6.5.3. Влияние 17р-эстрадиола на иммуноэкспрессию фосфо-ERK в спинном мозге и седалищном нерве 124
6.6. Заключение 127
ГЛАВА 7. ЭСТРОГЕНЫ И ВНУТРИАКСОННЫИ СИНТЕЗ БЕЛКА 130
7.1. Синтез белка в аксоне 130
7.1.1. РНК — компонент аксоплазмы 131
7.1.2. Аксонный транспорт и локальный синтез белка 133
7.1.3. РНК-интерференция в изучении трансляции белка 134
7.2. Влияние локального синтеза Р-тубулина на эффективность ретроградного аксонного транспорта 136
7.2.1. Ход эксперимента 136
7.2.2. Влияние интерферирующей РНК, комплементарной мРНК нейрональной формы р-тубулина, на ретроградный аксонный транспорт 137
7.3. Влияние 17Р-эстрадиола на ретроградный аксонный транспорт в присутствии ингибитора синтеза белка циклогексимида 142
7.4. Заключение 143
ГЛАВА 8. ПЛАСТИЧНОСТЬ ФЕНОТИПА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ В УСЛОВИЯХ ДЕНЕРВАЦИИ 146
8.1. Диагностика типов мышечных волокон 147
8.2. Регуляция фенотипа мышечных волокон 148
8.2.1. Влияние трёхвалентного железа и трансферрина на пластичность камбаловидной мышцы крысы после перерезки седалищного нерва 150
8.2.2. Камбаловидная мышца морской свинки после перерезки седалищного нерва и аппликации на нерв колхицина 152
8.2.3. Влияние трансферрина на иммуногистохимические характеристики камбаловидной мышцы морской свинки после блокады аксонного транспорта 155
8.3. Пластичность скелетных мышц опытной и контралатеральной конечностей после одностороннего повреждения седалищного нерва 156
8.3.1. Камбаловидные мышцы опытной и контралатеральной конечностей при различных способах денервации 156
8.3.2. Червеобразные мышцы опытной и контралатеральной конечностей при различных способах денервации 158
8.4. Заключение 160
ГЛАВА 9. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 162
Выводы 164
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 166
- Актуальность проблемы
- Опыты на животных
- Уоллеровская дегенерация и регенерация периферического нерва
- Эстрогеновый комплекс в регуляции экспрессии генов
- Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста и его рецепторов Flt-І и Flk-І
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из фундаментальных свойств организма является восстановление утраченной или повреждённой структуры. Эффективность регенерации определяется характером популяций клеток (эмбриональная, статическая, растущая, обновляющаяся). В статической популяции особое место занимают нейроны (Leblond 1964). Начиная с работ Сантьяго Рамон-и-Кахаля, приложившего клеточную теорию к нервной ткани (Cajal, 1909-1911), проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литературе резонирует пророческое высказывание Кахаля: ".. .в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, законченное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило" (Cajal, 1928).
Проблема регенерации в нервной ткани имеет не только теоретическое значение. Её актуальность для практической медицины представляется очевидной. При этом особую важность приобретает изучение регенерации периферического нерва. Дегенерация аксонов в периферических нервах может быть вызвана травмами опорно-двигательного аппарата, токсическими воздействиями, дефектами образования миелина, нарушениями аксонного транспорта, гипоксией и многими другими факторами. В реальной клинической ситуации наиболее часто встречаются травматические повреждения периферических нервных стволов, сопутствующие производственному, транспортному, спортивному и бытовому травматизму. Нарушение анатомической целостности нервного ствола приводит к полному выпадению функции нерва. Повреждения отростков двигательных и чувствительных нейронов вызывают паралич иннервируемых мышц и анестезию, а дегенерация аксонов вегетативных нейронов сопровождается сосудодвигательными расстройствами. При значительном расхождении центрального и периферического отрезков повреждённого нерва хаотично растущие нервные волокна на конце центрального отрезка образуют ампутационную неврому, которая препятствует реиннерва-ции органов-мишеней, в результате чего наступают атрофия скелетных мышц, дегенеративные изменения суставов, остеопороз. Необходимость более глубокого и всестороннего изучения механизмов регенерации периферического нерва обусловлена не только медицинскими запросами, но и имеет огромное социальное значение, поскольку реабилитация больных с посттравматическими повреждениями нерва до сих пор остаётся неразрешённой проблемой.
Важным аспектом посттравматической регенерации периферического нерва является изучение механизмов модуляции пластичности фенотипа регенерирующих мотонейронов. Пластичность, с одной стороны, отражает вариабельность генетически детерминированных признаков, а с другой—характер (созидательный или разрушительный) внутриклеточных процессов (Корочкин, 2002). При этом можно надеяться, что выяснение роли конкретных сигнальных каскадов в поддержании регенерации на клеточном уровне позволит разработать механизмы модуляция пластичности нейронов. На самом деле суть проблемы значительно глубже, речь идёт о (1) вызванной активности конкретного спектра генов в аксотомиро-ванных мотонейронах, (2) функциональной значимости активированных генов и (3) факторах, регулирующих активность функционально значимых генов.
Информационные межклеточные взаимодействия в системе "мотонейрон-скелетная мышца" модулируют активность разнообразных генов, контролирующих фенотипические признаки обоих клеточных партнёров. Травма периферического нерва прерывает регуляторные отношения между мотонейронами и скелетной мышцей. В денервированной мышце развивается постденервационный синдром (Полетаев, 1980; Shackelford and Lebherz, 1981; Волков и Полетаев, 1982; Bayline, Khoo et al., 1998). При этом в силу пластичности фенотипа скелетная мышца изменяет чувствительность к гуморальным факторам (Улумбеков и Резвяков, 1980; Резвяков, 1982; Валиуллин, 1996). Поэтому — в рамках проблемы реиннервации скелетной мышцы — особое значение приобретает вопрос о факторах, модулирующих фенотипические признаки мышечных волокон в условиях денервации. Однако восстановление координированных функций в системе "мотонейрон-скелетная мышца" в первую очередь зависит от пластичности мотонейронов. Спектр транскрибируемых генов в аксотомированных мотонейронах во многом повторяет таковой в ходе нейроонтогенеза и характеризуется повышенной активностью генов, контролирующих навигацию и рост аксонов, восстановление нервно-мышечного контакта (Purves and Lichtman, 1983). Вместе с тем пластические изменения фенотипа мотонейронов в условиях аксотомии изучены недостаточно. Не выяснены границы вариабельности генетически детерминированных признаков. Неизвестно, активность каких ещё генов регулирует процессы внутриклеточной регенерации. Не изучены временные характеристики активности генов.
Систематические исследования в этом направлении выявили спектр генов (гомейозисных, факторов транскрипции, рецепторов факторов роста, протеин киназ, антиапоптозных и многих других), ориентированных на внутриклеточную регенерацию (Kaiser and Nisenbaum, 2003; Resnick, Schmitt et al., 2004). При этом функциональная значимость ряда генов, активированных в ходе регенерации мотонейронов, остаётся неизученной. Неизвестно, насколько закономерна активация этих генов в аксотомированных мотонейронах и в каких внутриклеточных каскадах участвуют продукты их экспрессии. В рамках этого вопроса особый интерес представляет исследование экспрессии рецепторов сигнальных молекул, регулирующих ангиогенез, — сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и эндотелинов. Нервы и сосуды формируют ветвящуюся сеть, согласованно продвигаясь единым маршрутом в раннем онтогенезе (Shima and Mailhos, 2000). Известно, что усиление экспрессии VEGF играет важную роль не только в росте сосудов, но и в навигации аксонов (Miao, Soker et al., 1999). Синтез VEGF в гладкомышечных клетках сосудов стимулируют эндотелины (Kozawa, Kawamura et al., 2000). Причём эндотелиновая система per se имеет выраженную нейропротекторную функцию (Yagami, Ueda et al. 2002). Следовательно, в нервной ткани роль ангиогенных факторов заключается не только в обеспечении роста сосудов и доставки к нервным клеткам кислорода и питательных веществ — сигнальные молекулы ангиогенеза дополнительно функционируют как нейротрофические факторы (Ehrenreich, Nau et al., 2000; Oosthuyse, Moons et al., 2001). Вместе с тем, до сих пор неясны механизмы нейропротектор-ной функции этих молекул, поэтому выяснение характера экспрессии рецепторов VEGF и эндотелинов в мотонейронах представляется перспективным для исследования механизмов выживания нейронов в условиях аксотомии.
Другой важный вопрос в понимании механизмов модуляции фенотипа аксотомированных мотонейронов касается возможности направленной стимуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, обеспечивающих регенерацию аксонов. Навигация и рост регенерирующих аксонов на большие расстояния (более 1 м у человека) регулируются разнообразными сигнальными молекулами (Челышев, 1995). Нейротрофические факторы, факторы роста, цитоки-ны, молекулы адгезии и межклеточного матрикса, обеспечивающие элонгацию аксона, продуцируются шванновскими клетками (Zochodne, Cheng et al., 2001; Kubo, Yamashita et al., 2002), скелетными мышечными волокнами
(Sakuma, Watanabe et al. 2001), макрофагами (Shamash, Reichert et al., 2002) и фибробластами (Pu, Zhuang et al., 1999). Однако не существует однозначного, и тем более, исчерпывающего ответа на вопрос, какие из этих факторов могут быть рекомендованы для стимуляции регенерации периферического нерва в практической медицине. Наряду с этим неясно влияние гуморальной системы на аксотомированные мотонейроны. Важность изучения влияния гормонов на регенерацию мотонейронов обусловлена их способностью оказывать регуляторное влияние на уровне как спинного мозга, так и периферического нерва (Jones, Brown et al., 2001; Storer, Houle et al., 2002; Fiore, Inman et al., 2004). На наш взгляд, в этом плане значительный интерес представляют стероидные гормоны — эстрогены.
Биологическое влияние эстрогенов в организме млекопитающих не ограничивается эффектами на клетки-мишени в органах репродуктивной системы. Согласно современным представлениям, функциональное значение эстрогенов выходит за рамки "женских половых гормонов" (Allen and Doisy, 1983). Многочисленные исследования установили высокую значимость эстрогенов для развития и функционирования мозга (Lee and McEwen, 2001). Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферических нервов представляется перспективной по нескольким причинам. Эстрогены — ключевые гормоны при тканевой регенерации в органах женской половой системы. Вместе с тем эффект эстрогенов на регенерацию распространяется и на другие системы, в частности на нервную ткань (McEwen and Alves, 1999). Липофильные гормоны свободно проникают через плазматическую мембрану нейронов, изменяя режим функционирования клетки через классический и/или альтернативный механизм (Watson and Gametchu, 1999). Показано, что эстрогены проявляют нейропротекторные свойства при ишемии и травмах головного мозга (Behl, 2001). Заместительная терапия эстрогенами у женщин постклимактерического периода предупреждает развитие болезни Альцхаймера (Slooter, Bronzova et al., 1999) и способствует частичной коррекции двигательных расстройств при болезни Пар-кинсона (Tsang, Но et al., 2000). В этой связи необходимо отметить, что экспрессия эстрогеновых рецепторов документирована не для всех нейронов ЦНС; в частности, не установлен факт их экспрессии для мотонейронов спинного мозга. Поэтому до сих пор не известны эффекты эстрогенов на регенерацию
периферического нерва. Не исследованы также механизмы нейропротектор-ного действия эстрогенов при аксотомии мотонейронов.
Разработка гипотезы о стимулирующем влиянии эстрогенов на регенерацию периферического нерва имеет важное значение не только для выяснения механизмов действия эстрогенов на внутриклеточные восстановительные процессы, но и для клинического применения гормонов. Однако, вследствие того, что эстрогены активируют пролиферацию эпителиальных клеток молочных желёз и матки, применение эстрогенов может быть крайне ограничено. В то же время работами последних лет было показано, что синтетические фармакологические вещества, селективно ингибирующие рецепторы эстрогенов в тканях репродуктивных органов, обладают нейропротекторными свойствами эстрогенов (Grandbois, Morissette et al., 2000; Callier, Morissette et al., 2001). При этом влияние этих препаратов на регенерацию периферического нерва не изучено.
Анализ состояния проблемы регенерации периферического нерва на сегодняшний день свидетельствует об актуальности исследования посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов. Выяснение механизмов регуляции активности конкретного спектра генов в денервированной скелетной мышце и регенерирующих мотонейронах является основой в исследованиях направленной стимуляции регенерации периферических нервов и восстановления функции скелетных мышц у человека.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является анализ механизмов регуляции посттравматической пластичности фенотипа мотонейронов спинного мозга и скелетных мышц в условиях повреждения периферического нерва и фармакологических воздействий на его регенерацию. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. В аксотомированных мотонейронах спинного мозга мышей изучить экс
прессию:
а) рецепторов эстрогенов а и (3,
б) VEGF и его рецепторов Flk-І и Fit-1;
в) рецепторов эндотелинов ЕТА и ЕТВ.
2. Исследовать влияние 17Р-эстрадиола и селективного модулятора эстроге новых рецепторов аналога ралоксифена LY117018 на регенерацию седалищного
нерва у мышей.
3. Выяснить механизмы действия агонистов рецепторов эстрогенов на внутриклеточную регенерацию мотонейронов спинного мозга у мышей после повреждения седалищного нерва.
4. Изучить экспрессию генов в поясничном отделе спинного мозга мышей после повреждения седалищного нерва на фоне воздействия 17(3-эстрадиола.
5. Исследовать влияние 17Р-эстрадиола на ретроградный аксонныи транспорт и внутриаксонный синтез белка в мотонейронах спинного мозга у мышей.
6. Исследовать влияние железотранспортирующего белка трансферрина и ионов трёхвалентного железа на фенотипические признаки медленной камбаловидной мышцы крысы и морской свинки в условиях денервации и блокады аксонного транспорта.
7. Исследовать влияние одностороннего повреждения седалищного нерва на пластичность фенотипов медленной камбаловидной и быстрой червеобразной мышц в опытной и контралатеральной конечностях у крыс.
Научная новизна
В работе охарактеризована активность генов в спинном мозге мышей после передавливания седалищного нерва и выявлена роль эстрогенов в регенерации периферических нервов. Все приведённые в этом разделе основные научные результаты получены впервые. После передавливания седалищного нерва у мышей 17(3-эстрадиол и аналог ралоксифена LY117018 ускоряют рост и созревание нервных волокон, что приводит к более ранней реиннервации скелетных мышц. Методами иммуногистохимии, иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции получены доказательства экспрессии рецепторов эстрогенов а и Р в мотонейронах спинного мозга. Аксотомия существенно увеличивает продукцию обеих изоформ рецепторов эстрогенов в спинном мозге. При этом рецепторы эстрогенов перемещаются в составе антероградного аксонного транспорта и аккумулируются в регенерирующих нервных волокнах. Выявлены геномный и негеномный механизмы действия эстрогенов на аксотомиро-ванные мотонейроны. Через геномный механизм 17Р-эстрадиол активирует транскрипцию генов-регуляторов клеточной пролиферации, роста, дифферен-цировки, апоптоза. По альтернативному негеномному механизму эстрогены путём активации протеин киназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK), усиливают ретроградный аксонныи транспорт и поддерживают синтез белка в аксоплазме.
Установлено облигатное участие рецепторов VEGF и эндотелинов в регенерации мотонейронов. В мотонейронах спинного мозга выявлена ядерная локализация рецептора VEGF (Flt-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ). В аксотомирован-ных мотонейронах показано усиление экспрессии VEGF, его рецептора Flt-1 и рецептора эндотелинов ЕТВ как на уровне гена, так и белка. Обнаружено, что 17Р-эстрадиол потенцирует экспрессию VEGF в аксотомированных мотонейронах. Исследование внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции показало, что короткая интерферирующая РНК, апплицированная на центральный отрезок периферического нерва, может быть трансфецирована в аксоплазму мотонейронов. Интерферирующая РНК, комплементарная мРНК нейрональной формы р-тубулина, локально ингибирует трансляцию белка в аксоплазме, что приводит к структурным повреждениям микротрубочек и нарушению аксонного транспорта в мотонейронах спинного мозга.
В условиях повреждения седалищного нерва показано, что влияние гуморальных факторов на фенотип мышцы обусловлено характером повреждения нерва. В медленной камбаловидной мышце железотранспортирующий белок трансферрин при перерезке нерва (блокада проведения импульсов и аксонного транспорта) увеличивает экспрессию медленного миозина, а при аппликации колхицина на нерв (блокада аксонного транспорта) — быстрого. Одностороннее повреждение седалищного нерва вызывает изменение фенотипа скелетных мышц не только в опытной конечности, но и в контралатеральной. В быстрой червеобразной и медленной камбаловидной мышцах контралатеральной конечности увеличивается относительное содержание медленных мышечных волокон.
Положения, выносимые на защиту
1. Усиление экспрессии генов эстрогеновых рецепторов (а и р), рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста (Flt-1) и рецептора эндотелинов (ЕТВ) в мотонейронах спинного мозга поддерживает регенерацию двигательных нервных волокон и восстановление функций в системе "мотонейрон-скелетная мышца".
2. Агонисты эстрогеновых рецепторов стимулируют регенерацию мотонейронов через геномный и негеномный сигнальные пути. Альтернативный негеномный путь реализуется за счёт активации ERK-зависимого внутриклеточного сигнального каскада.
Научно-практическая ценность
Теоретическое значение результатов проведённых исследований определяется раскрытыми закономерностями пластичности фенотипов клеточных партнёров в системе "мотонейрон-скелетная мышца" в условиях повреждения периферического нерва. Анализ экспрессии 1176 генов в поясничном отделе спинного мозга после передавливания седалищного нерва представляет интерес для понимания патогенеза нейродегенеративных процессов в спинном мозге. Выявленный спектр активированных генов в аксотомированных мотонейронах дополняет существующее представление о механизмах внутриклеточной регенерации. Данные о пластичности фенотипа скелетных мышц в денервированной и контралатеральной конечностях следует учитывать при выяснении компенсаторных механизмов, способствующих выживанию скелетной мышцы до восстановления иннервации, и могут быть использованы для разработки методов коррекции фенотипических изменений в денервированных скелетных мышцах в практической медицине.
В работе сформулировано представление о механизме стимулирующего влияния эстрогенов на регенерацию нервной ткани. Выявленный положительный эффект 17Р-эстрадиола и селективного модулятора рецепторов эстрогенов аналога ралоксифена LY117018 на регенерацию периферического нерва и восстановление функции денервированных скелетных мышц имеет прикладное значение в клинике нервных болезней. Выяснение механизмов действия агонистов эстрогеновых рецепторов на аксотомированные мотонейроны позволяет расширить существующие представления о нейропротекторной функции эстрогенов при ишемии, травмах и возрастных изменениях ЦНС. Выяснение механизмов перекрёстного взаимодействия эстрогенов с сигнальными каскадами сосудистого эндотелиального фактора роста и эндотелинов открывает новые перспективы для направленной стимуляции регенерации периферического нерва.
Результаты исследования внутриаксонного синтеза белка методом РНК-интерференции имеют общебиологическое значение. Полученные доказательства высокоселективной посттранскрипционной блокады трансляции белка в аксонах мотонейронов спинного мозга с помощью короткой интерферирующей РНК in vivo могут найти применение в генной терапии.
Актуальность проблемы
Одним из фундаментальных свойств организма является восстановление утраченной или повреждённой структуры. Эффективность регенерации определяется характером популяций клеток (эмбриональная, статическая, растущая, обновляющаяся). В статической популяции особое место занимают нейроны (Leblond 1964). Начиная с работ Сантьяго Рамон-и-Кахаля, приложившего клеточную теорию к нервной ткани (Cajal, 1909-1911), проблема регенерации нейронов остаётся одной из важнейших в нейробиологии. До сих пор в научной литературе резонирует пророческое высказывание Кахаля: ".. .в конце развития родники роста и регенерации аксонов и дендритов высыхают безвозвратно. Посередине взрослости нервные пути — нечто фиксированное, законченное и неизменное. Всё может погибнуть, ничто не может регенерировать. Науке будущего предписано изменить, если возможно, это суровое правило" (Cajal, 1928).
Проблема регенерации в нервной ткани имеет не только теоретическое значение. Её актуальность для практической медицины представляется очевидной. При этом особую важность приобретает изучение регенерации периферического нерва. Дегенерация аксонов в периферических нервах может быть вызвана травмами опорно-двигательного аппарата, токсическими воздействиями, дефектами образования миелина, нарушениями аксонного транспорта, гипоксией и многими другими факторами. В реальной клинической ситуации наиболее часто встречаются травматические повреждения периферических нервных стволов, сопутствующие производственному, транспортному, спортивному и бытовому травматизму. Нарушение анатомической целостности нервного ствола приводит к полному выпадению функции нерва. Повреждения отростков двигательных и чувствительных нейронов вызывают паралич иннервируемых мышц и анестезию, а дегенерация аксонов вегетативных нейронов сопровождается сосудодвигательными расстройствами. При значительном расхождении центрального и периферического отрезков повреждённого нерва хаотично растущие нервные волокна на конце центрального отрезка образуют ампутационную неврому, которая препятствует реиннерва-ции органов-мишеней, в результате чего наступают атрофия скелетных мышц, дегенеративные изменения суставов, остеопороз. Необходимость более глубокого и всестороннего изучения механизмов регенерации периферического нерва обусловлена не только медицинскими запросами, но и имеет огромное социальное значение, поскольку реабилитация больных с посттравматическими повреждениями нерва до сих пор остаётся неразрешённой проблемой.
Важным аспектом посттравматической регенерации периферического нерва является изучение механизмов модуляции пластичности фенотипа регенерирующих мотонейронов. Пластичность, с одной стороны, отражает вариабельность генетически детерминированных признаков, а с другой—характер (созидательный или разрушительный) внутриклеточных процессов (Корочкин, 2002). При этом можно надеяться, что выяснение роли конкретных сигнальных каскадов в поддержании регенерации на клеточном уровне позволит разработать механизмы модуляция пластичности нейронов. На самом деле суть проблемы значительно глубже, речь идёт о (1) вызванной активности конкретного спектра генов в аксотомиро-ванных мотонейронах, (2) функциональной значимости активированных генов и (3) факторах, регулирующих активность функционально значимых генов.
Информационные межклеточные взаимодействия в системе "мотонейрон-скелетная мышца" модулируют активность разнообразных генов, контролирующих фенотипические признаки обоих клеточных партнёров. Травма периферического нерва прерывает регуляторные отношения между мотонейронами и скелетной мышцей. В денервированной мышце развивается постденервационный синдром (Полетаев, 1980; Shackelford and Lebherz, 1981; Волков и Полетаев, 1982; Bayline, Khoo et al., 1998). При этом в силу пластичности фенотипа скелетная мышца изменяет чувствительность к гуморальным факторам (Улумбеков и Резвяков, 1980; Резвяков, 1982; Валиуллин, 1996). Поэтому — в рамках проблемы реиннервации скелетной мышцы — особое значение приобретает вопрос о факторах, модулирующих фенотипические признаки мышечных волокон в условиях денервации.
Опыты на животных
Эксперименты выполнены на половозрелых лабораторных животных: белых беспородных крысах-самцах, п=68 (Институт органической химии им. А.Е.Арбузова Казанского филиала РАН); морских свинках-самцах, п=27 (КНИИЭМ); белых ICR мышах обоего пола, n=308 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Камбаловидную, подошвенную и червеобразную мышцы крыс и морских свинок изучали после повреждения седалищного нерва путём перерезки, передавливания или аппликации на нерв раствора колхицина. У мышей изучены седалищный нерв и поясничный отдел спинного мозга после перерезки или передавливания седалищного нерва. У мышей-самок в конце эксперимента собирали кровь для радиоиммунологического анализа. Опыты на животных, выполненные в Казанском государственном медицинском университете, соответствуют приказу Министерства Здравоохранения СССР (12 августа 1977 г. № 755) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Протоколы опытов на мышах в Университете Восточной Каролины (США) утверждены Комитетом по охране и использованию экспериментальных животных.
Уоллеровская дегенерация и регенерация периферического нерва
В результате нарушения анатомической целостности периферического нерва аксоны на всём протяжении дистального отрезка нервного ствола подвергаются уоллеровскои дегенерации. В центральном отрезке нерва аксоны дезинтегрируют от места травмы до первого неповреждённого узлового перехвата Ранвье (Horn and Crumley, 1984). Морфологически уоллеровская дегенерация проявляется в виде гранулярной дезинтеграции осевых цилиндров и миелиновой оболочки. Начальная фаза уоллеровскои дегенерации характеризуется прекращением аксонного транспорта. Органеллы и белковые комплексы аккумулируются в дистальных сегментах центрального и периферического нервных отрезков, вызывая набухание аксонов (Powell, 1985). В течение следующих 24 часов аксоны в дистальном отрезке нерва утрачивают способность проводить потенциал действия, нейрофила-менты и микротрубочки подвергаются гранулярной дегенерации, миелиновая оболочка распадается на липидные глобулы (Greenfield, Adams et al., 1984). Фрагменты осевых цилиндров и миелина активно фагоцитируются макрофагами и частично шванновскими клетками. Несмотря на то, что Уоллер сделал своё открытие более 150 лет назад (Waller, 1850), молекулярные механизмы дегенерации аксона до сегодняшнего дня остаются не раскрытыми. Замедленная дезинтеграция нервных проводников у мутантных мышей WlcP расширяет наше представление об уоллеровскои дегенерации (Coleman and Perry, 2002). У таких мышей аксоны дистального отрезка перерезанного нерва в течение 2-х недель сохраняет структурную целостность и способность проводить вызванный потенциал действия.
Быстрое и эффективное удаление клеточного детрита необходимо для создания под сохранившейся базальной мембраной свободного пространства, в котором интенсивно пролиферирующие шванновские клетки формируют бюнгнеров-ские ленты—цепочки шванновских клеток, соединяющие центральные отростки аксонов с мишенями (Bungner, 1891). Бюнгнеровские ленты, окружённые базальной мембраной, служат направляющими путями для растущих аксонов (Cajal, 1928). Элонгация аксонов происходит между поверхностью шванновских клеток и базальной мембраной в направлении клеток-мишеней. Основным препятствием для регенерирующих аксонов является место травмы. При сохранении анатомической целостности нервного ствола, например, при механическом раздавливании нерва, начальная скорость роста аксонов составляет 0,25 мм в сутки, а после прохождения зоны повреждения скорость увеличивается до 3-4 мм в сутки (Stoll and Muller, 1999). Однако, при значительном расхождении центрального и периферического отрезков повреждённого нерва хаотично растущие нервные волокна на конце центрального отрезка образуют ампутационную неврому, препятствующую реиннер-вации клеток-мишеней. Хирургическое восстановление анатомической целостности нерва путём иссечения невромы и сшивания свободных нервных концов возобновляет регенерацию аксонов из центрального сегмента нерва.
Навигация и рост аксонов на большие расстояния (более 1 метра у человека) регулируются разнообразными сигнальными молекулами. Нейротрофические факторы, факторы роста, цитокины, молекулы адгезии и межклеточного матрикса, обеспечивающие элонгацию аксона, локально продуцируются шванновскими клетками (Zochodne and Cheng, 2000; Kubo, Yamashita et al., 2002), скелетными мышечными волокнами (Funakoshi, Belluardo et al., 1995; Sakuma, Watanabe et al., 2001), макрофагами (Hughes, Wells et al., 2002; Shamash, Reichert et al., 2002) и фиброблас-тами (Siironen, Vuorio et al., 1996; Pu, Zhuang et al., 1999) (табл. 3-1).
Эстрогеновый комплекс в регуляции экспрессии генов
Эффекты эстрогенов на функцию клетки реализуются через рецепторные белки, относящиеся к надсемейству ядерных рецепторов (Jensen, 1962; Mangelsdorf, Thummel et al., 1995; Behl, 2001). У млекопитающих рецепторы эстрогенов кодируют два гена — рецептор эстрогенов альфа и бета. Рецептор эстрогенов альфа (ERct — Estrogen Receptor) был клонирован в 1986 году (Green, Walter et al., 1986; Greene, Gilna et al., 1986) и до последнего времени считался единственным рецептором эстрогенов, но в 1996 году появилось сообщение о клонировании нового рецептора эстрогенов — бета (ER (3) (Kuiper, Enmark et al., 1996).
Рецепторные белки ERa и ER0 содержат 6 идентичных функциональных доменов (рис. 4-1) (ВеЫ, 2001; Klinge, 2001). Домены Аи В — вариабельный участок рецептора, взаимодействующий со специфическим промотором ДНК; содержит фрагмент AF-1 (Activation Function-1), модулирующий транскрипцию гена-мишени. Консервативный домен С состоит из двух «цинковых пальцев» — активаторов транскрипции; через С домен ER прямо взаимодействует со спиралью ДНК. Домен D разделяет ДНК- и лиганд-связывающие домены, а также содержит участок, ответственный за ядерную локализацию рецептора. Лиганд-связывающий домен Е состоит из 12 а-спиралей, формирующих уникальное «гнездо» для взаимодействия с лигандом, и содержит фрагмент AF-2. Домен F участвует в распознавании агонистов эстрогенов.
Эстрогены, взаимодействуя с ER, вызывают диссоциацию рецепторов с моле-кулами-шаперонами (белками теплового шока) Hsp70 и Hsp90. Освободившись от молекул-шаперонов, активированные ERa и ER(3 образуют эстрогеновые комплексы — гомодимеры (ERa-ERa, ERP-ER[3) или гетеродимеры (ERa-ER(3). Традиционно считалось, что активированные рецепторы эстрогенов из цитоплазмы транслоцируются в ядро клетки и индуцируют транскрипцию генов-мишеней (классический геномный механизм) (Klinge, 2001). В последнее время получены данные, свидетельствующие о наличии рецепторов эстрогенов, ассоциированных с плазматической мембраной (Lee and McEwen, 2001). Активация этих рецепторов запускает альтернативный механизм действия эстрогенов. В нейронах ЦНС эстрогеновые комплексы индуцируют как классический, так и альтернативный внутриклеточные каскады (Simoncini and Genazzani, 2003).
По классическому геномному механизму комплексы лиганд-рецептор прямо взаимодействуют с эстроген-чувствительным элементом в промоторе гена-мишени, активируя транскрипцию ДНК (рис. 4-2). Активированные рецепторы эстрогенов — факторы транскрипции широкого спектра генов-регуляторов функций половой сферы (лютеинизирующего гормона, пролактина, окситоцина, рецептора прогестерона), а также генов, участвующих в процессах пролиферации, диффе-ренцировки, роста и апоптоза (c-jun, c-fos, bcl-2, холин ацетилтрансферазы, VEGF) (Mangelsdorf, Thummel et al., 1995; Klinge, 2001).
Экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста и его рецепторов Flt-І и Flk-І
Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF-A (известный как VEGF) принадлежит к семейству факторов роста, проявляющих ангиогенную активность в эмбриогенезе, при опухолевом росте, гипоксии и регенерации ткани. VEGF син 90 тезируется в эпителиальных (Boussat, Eddahibi et al., 2000), соединительнотканных (Tokuda, Kozawa et al., 2000), мышечных (Giordano, Gerber et al., 2001; Chintalgattu, Nair et al., 2003), нервных (Maurer, Tripps et al., 2003) и опухолевых клетках (Ilan, Tucker et al., 2003). Взаимодействуя с высокоаффинными рецептор-ными тирозин киназами (Fit-1 [Fetal Liver Kinase] и Flk-1 [Feline Sarcoma Vims-Like Tyrosine Kinase]), встроенными в плазмолемму эндотелиальных клеток, VEGF регулирует пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных клеток в растущих кровеносных сосудах.
VEGF, первоначально идентифицированный как митоген эндотелиальных клеток и фактор проницаемости сосудов, недавно был представлен в роли нейротро-фического фактора (Oosthuyse, Moons et al., 2001). VEGF синтезируется нейро-нальными стволовыми клетками, зрелыми нейронами и глиальными клетками в различных анатомических областях ЦНС (Nico, Corsi et al., 2002; Yoshida, Imaizumi et al., 2002; Famiglietti, Stopa et al., 2003; Krum and Khaibullina, 2003). Синтез VEGF значительно повышается в условиях гипоксии (Ogunshola, Antic et al., 2002). Однако, кроме защиты нервной ткани от кислородного голодания, VEGF также стимулирует пролиферацию нейробластов (Jin, Zhu et al., 2002) и рост аксонов (Sondell, Sundler et al., 2000), способствует выживаемости нейронов in vitro и in vivo (Matsuzaki, Tamatani et al., 2001; Oosthuyse, Moons et al., 2001). Ингибиторы VEGF-рецепторной тирозин киназы (Hennequin, Thomas et al., 1999; Wood, Bold et al., 2000) предотвращают васкуляризацию и рост опухоли у безтимусных «голых» мышей (Bold, Altmann et al., 2000; Drevs, Hofmann et al., 2000), индуцируют апоп-тоз эмбриональных нейронов коры головного мозга (Ogunshola, Antic et al., 2002).
Недавно созданная линия мышей Vegffd, у которых в промоторе гена VEGF отсутствует чувствительный к фактору гипоксии (HIF-loc) элемент, приблизила исследователей к пониманию механизмов VEGF-нейропротекции (Oosthuyse, Moons et al., 2001; Lambrechts, Storkebaum et al., 2003). Было установлено, что у Vegf/d-m imeu развивается прогрессирующая дегенерация мотонейронов, напоминающая таковую при боковом амиотрофическом склерозе. У трансгенных мышей G93A, экспрессирующих мутантный ген супероксид дисмутазы SOD1 (при мутации гена развивается наследственная форма бокового амиотрофического склероза), показана ослабленная индуцированная гипоксией экспрессия VEGF (Murakami, Ilieva et al., 2003). При скрещивании Vegf/d и мышей G93 А полученное потомство погибает в раннем возрасте в результате выраженной дегенерации мотонейронов (Lambrechts, Storkebaum et al., 2003). In vitro VEGF способствует выживанию мотонейронов, экспрессирующих мутантный ген SOD1 (Li, Xu et al., 2003). Вместе с тем, полной ясности в механизме VEGF-зависимой нейропротекции на сегодняшний день не существует. Нами изучена экспрессия VEGF и его рецепторов (Fit-1 и Flk-І) в поясничном отделе спинного мозга после передавливания седалищного нерва у мышей-самцов.