Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Факторы риска развития атеросклероза. 13
1.2. Атеросклероз как воспалительный процесс .19
1.3. Роль активных форм кислорода при атеросклерозе. Современное представление об антиоксидантной системе организма человека 23
1.4. Роль скавенджер рецепторов в развитии атеросклероза .30
1.5. Заключение 34
Глава2. Материал и методы исследования
2.1. Общая клиническая характеристика обследованных 36
2.2. Клинические методы исследования .39
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования .42
2.4. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Клиническая характеристика пациентов c различными проявлениями атеросклероза и количественный анализ выявленной экспрессии исследуемых генов в общей популяции .51
3.2. Клиническая характеристика пациентов и количественный анализ, выявленной экспрессии исследуемых генов в первой группе без клинических проявлений атеросклероза, но с наличием факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний 56
3.3. Клиническая характеристика пациентов и количественный анализ выявленной экспрессии исследуемых генов во второй группе с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий .59
3.4. Клиническая характеристика пациентов и количественный анализ активности экспрессии исследуемых генов в третьей группе пациентов с инфарктом миокарда в раннем постинфарктном периоде .69
3.5. Уровень экспрессии генов скавенджер рецепторов и регуляторов окисления липидов у пациентов с разными клиническими проявлениями атеросклероза (RQ) 81
3.5.1 Относительный уровень экспрессии исследуемых генов в группах пациентов с различными клиническими проявлениями атеросклероза .81
3.5.2 Качественные показатели активности экспрессии генов скавенджер ецепторов и генов регуляторов окисления липидов в первой группе пациентов в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (по CT) 84
3.5.3 Качественные показатели активности экспрессии генов скавенджер рецепторов и генов регуляторов окисления липидов во второй группе в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и степени стенозирования внутренней сонной артерии 87
3.5.4 Качественные показатели активности экспрессии генов скавенджер рецепторов и генов регуляторов окисления липидов в третьей группе в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, формы инфаркта миокарда и степени систолической дисфункции ЛЖ .92
3.6 Корреляционный анализ 100
Глава 4. Обсуждение полученных результатов .105
Выводы .116
Практические рекомендации .118
Перспективы дальнейшей разработки темы .119
Список сокращений .120
Список литературы .122
Список иллюстративного материала 143
- Роль активных форм кислорода при атеросклерозе. Современное представление об антиоксидантной системе организма человека
- Клиническая характеристика пациентов и количественный анализ выявленной экспрессии исследуемых генов во второй группе с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий
- Качественные показатели активности экспрессии генов скавенджер рецепторов и генов регуляторов окисления липидов во второй группе в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и степени стенозирования внутренней сонной артерии
- Корреляционный анализ
Введение к работе
Актуальность исследования. Атеросклероз – это системное прогрессирующее заболевание, поражающее различные артерии, преимущественно эластического и мышечно - эластического типа, но имеющее характерные особенности в различных сосудистых бассейнах (Гайгалайте В. И др.2013).
Как известно, наиболее важную роль в прогрессировании ишемической болезни сердца отводят дислипидемии, в развитии нарушений мозгового кровообращения – артериальной гипертензии, а в манифестации облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей – курению и сахарному диабету (Kannel et al.2006, Kannel W. B.,1994).
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза наиболее распространенной сердечно-сосудистой патологии, ряд вопросов, касающихся, прежде всего, разработки методов ранней диагностики атеросклероза, до сих пор остаются нерешенными.
Последнее десятилетие стало временем активного внедрения молекулярно-
генетических методов исследования в кардиологию. Многочисленные
исследования показали, что от активности целого ряда генов зависит степень
прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний (Levonen et al.2008,
Companioni et al.2011, Greaves et al.2009, Roberts R. 2014).
Так, на основе анализа данных литературы было сделано предположение, что
уровень экспрессии генов скавенджер рецепторов, кодирующих утилизацию
липидов и генов, регулирующих их оксидацию, может быть ассоциирован с
развитием атеросклероза (Segers F. M. et al.2012, Nakamura K. et al.2001, Zeller I.,
Srivastava S. 2014). Несмотря на это, подобные исследования крайне редки, как в
отечественной, так и в зарубежной литературе, а их результаты зачастую носят
неоднозначный характер. Таким образом, в настоящее время представляется
актуальной комплексная оценка изменения активности генов, кодирующих
окисление липидов, антиоксидантную систему, а также регуляцию скавенджер
рецепторов моноцитов крови у пациентов с разными клиническими
проявлениями атеросклероза для оптимизации прогноза сердечно-сосудистых заболеваний.
Цель исследования. Определить особенности экспрессии генов-регуляторов окисления и утилизации липидов у пациентов с факторами риска и различными клиническими проявлениями атеросклероза коронарных и периферических сосудов для выявления дополнительных маркеров тяжести атеросклеротического процесса.
Задачи исследования:
1. У пациентов с доклинической стадией атеросклероза и факторами риска
развития сердечно-сосудистых заболеваний, мультифокальным атеросклерозом
периферических артерий и ишемической болезнью сердца (первые трое суток
инфаркта миокарда) провести количественную оценку выявленной экспрессии
генов антиоксидантной системы (SOD1, SOD2, GPX1, GCLC), генов-регуляторов
окисления липидов (HMOX1, NQO1, NRF2, KEAP1) и скавенджер рецепторов
(CD36, CD68, MARCO, MSR1, SCARB2, SCARB1, SCARA5, SCARA3, COLEC12).
-
У пациентов с доклинической стадией атеросклероза и факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний определить уровень экспрессии исследуемых генов.
-
Оценить экспрессию исследуемых генов в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и степени стеноза внутренней сонной артерии у пациентов с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий.
-
У пациентов в первые трое суток инфаркта миокарда оценить экспрессию исследуемых генов в зависимости от формы инфаркта миокарда (с/без подъема ST) и систолической дисфункции левого желудочка.
5. Провести корреляционный анализ между факторами риска сердечно
сосудистых заболеваний, клиническими проявлениями атеросклероза и уровнем
экспрессии генов во всех исследуемых группах.
Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ экспрессии генов, регулирующих оксидацию и утилизацию окисленных ЛПНП (системы глутатиона (GPX1, GCLC), супероксиддисмутазы (SOD1,SOD2), гемокcигеназы (HMOX1),
NADP-оксидоредуктазы (NQO1), ядерного транскрипционного фактора (NRF2),
редокс-чувствительной сигнальной системы (KEAP1), мембранных
гликопротеиновых скавенджер рецепторов (CD36, CD68, MARCO, MSR1, SCARB2,
SCARB1, SCARA5, SCARA3, COLEC12) у пациентов с атеросклерозом разной
степени выраженности: с факторами риска без клинических проявлений
атеросклероза, с выраженным мультифокальным атеросклерозом периферических
артерий и атеросклерозом коронарных артерий, осложненным инфарктом
миокарда.
Показано, что у пациентов с различными клиническими проявлениями
атеросклероза и наличием факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких
как возраст от 59 лет и старше, гиперхолестеринемия, артериальная гипертония,
курение и избыточная масса тела, а также в первые трое суток инфаркта миокарда
с подъемом и без подъема сегмента ST, при разной степени систолической
дисфункции левого желудочка и стеноза внутренней сонной артерии,
обнаруживаются различия в экспрессии исследуемых генов, в том числе статистически значимые для генов, кодирующих систему глутатиона (GPX1, GCLC) и NADP-оксидоредуктазу (NQO1), что дает основание оценивать данные показатели с позиции дополнительных прогностических маркеров сердечнососудистых заболеваний.
Впервые выявлено снижение экспрессии генов, кодирующих
митохондриальную и эндоплазматическую супероксиддисмутазу (SOD1, SOD2) и глутатионпероксидазу (GPX1) у пациентов с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий в зависимости от наличия гиперхолестеринемии, избыточной массы тела и возраста старше 59 лет.
Впервые установлено, что у пациентов с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST снижена экспрессия генов, кодирующих окисление липидов и антиоксидантную активность (GPX1, GCLC, SOD2, HMOX1 NQO1, NRF2). Кроме того, показана зависимость относительного уровня экспрессии генов SOD2 и NQO1 от степени систолической дисфункции левого желудочка.
У пациентов с доклинической стадией атеросклероза значимо снижена экспрессия генов CD68, NQO1, NRF2, GCLC по сравнению с пациентами мультифокальным атеросклерозом и инфарктом миокарда.
Выявлено, что снижение экспрессии генов-регуляторов окисления липидов (SOD2, HMOX1 и SOD1) наиболее выражено у пациентов с инфарктом миокарда и мультифокальным атеросклерозом периферических артерий, что свидетельствует об истощении антиоксидантной системы в условиях тяжелой гипоксии и острого повреждения миокарда.
Впервые установлены тесные корреляционные связи между экспрессией генов CD68, NQO1, генов регуляторов системы глутатиона GPX1 и GCLC с уровнем холестерина, избыточным весом и наличием артериальной гипертензии, формой инфаркта миокарда и фракцией выброса левого желудочка сердца, что позволяет рассматривать данные показатели в качестве дополнительных маркеров факторов риска, повреждения миокарда и степени выраженности систолической дисфункции левого желудочка.
Впервые выявлена статистически значимая обратная корреляционная зависимость между наличием выраженного стеноза внутренней сонной артерии и экспрессией SOD2 и GCLC, что позволяет использовать данные показатели в качестве дополнительных критериев прогрессирования атеросклеротического стеноза периферических артерий.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлено, что наличие факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких как возраст от 59 лет и старше, избыточный вес, артериальная гипертония, гиперхолестеринемия, курение, сопровождается снижением количества пациентов с выявленной активностью генов антиоксидантной системы и скавенджер рецепторов.
У пациентов в первые трое суток инфаркта миокарда с подъемом сегмента ST и низкой фракцией выброса левого желудочка (менее 40%) наблюдается низкая активность всех исследуемых генов.
У пациентов с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий степень выраженности стеноза внутренней сонной артерии обратно коррелирует с уровнем экспрессии генов SOD2 и GCLC, что позволяет использовать данные
показатели в качестве дополнительных маркеров тяжести атеросклеротического процесса.
Гены, для которых были обнаружены изменения экспрессии, могут рассматриваться в качестве значимых прогностических факторов в развитии атеросклероза. Оценка их экспрессии может представлять интерес для формирования групп риска, связанного с осложненным течением атеросклероза.
Положения, выносимые на защиту:
1. У пациентов с разными клиническими формами атеросклеротического
поражения сосудов выявляются различные показатели экспрессии генов-
регуляторов окисления и утилизации липидов.
2. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний оказывают влияние на
экспрессию генов-регуляторов скавенджер рецепторов и окисление липидов.
3. Экспрессия генов, регулирующих окисление и утилизацию липидов, является
дополнительным прогностическим маркером при оценке величины инфаркта
миокарда, систолической дисфункции левого желудочка и степени стеноза
внутренней сонной артерии.
Степень достоверности и апробация результатов работы. Степень
достоверности результатов проведенного исследования определяется
соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, достаточным
объемом выборок обследованных пациентов и выполненных наблюдений с
использованием разноплановых методов исследования, применением
статистических методов, адекватных поставленным задачам.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийском форуме «Вопросы неотложной кардиологии 2014: от науки к практике» (Москва, 2014); Всероссийской конференции «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2014); конференции «Российские дни сердца» (Москва, 2015); 89-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 70-летию Победы в Великой Отечественной Войне (Казань, 2015); VI международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2015); Всероссийской конференции «Кардиология в XXI веке: традиции и инновации» и Международном форуме молодых кардиологов
РКО (Рязань , 2016.); научно-практической конференции студентов и молодых
ученых с международным участием «Белые цветы» ( Казань, 2016); Российском
национальном конгрессе кардиологов «Кардиология 2016: вызовы и пути
решения»(Екатеринбург, 2016); международном конгрессе по атеросклерозу,
посвященном памяти Аничкова Н.Н. «Дни Аничкова» (Санкт – Петербург, 2016); V
Съезде терапевтов Сибирского федерального округа и Дальневосточного
федерального округа (Новосибирск, 2016); международной научно-практической конференции «Новшества в медицине и фармакологии»(Тюмень, 2016); научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Белые цветы»(Казань, 2017); 50st Annual Scientific Meeting of the European Society of Human Genetics (Copenhagen Denmark, 2017); 51st Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation (Genoa Italy, 2017); Российском национальном конгрессе кардиологов (Санкт-Петербург, 2017).
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликованы 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ, 2 публикации в журнале, включенном в международную базу цитирования Scopus.
Внедрение результатов работы. Научно-практические разработки
диссертационной работы внедрены в практическую деятельность врачей отделения сосудистой хирургии № 1 ГАУЗ «Республиканская клиническая больница» г. Казани, учебный процесс кафедры госпитальной терапии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России.
Личное участие автора. Весь объем клинических наблюдений и методов исследования осуществлен при непосредственном личном участии диссертанта. Автором определены цель и задачи, разработан дизайн, выбраны методы, спланировано проведение исследования по всем разделам диссертации, проведен обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Самостоятельно проведен анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных данных. Формулировка выводов, практических рекомендаций, положений, выносимых на защиту, принадлежат лично автору. Генетические
исследования (определение экспрессии генов-регуляторов антиоксидантной системы и утилизации липидов) выполнены при личном участии диссертанта.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материал и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, перспективы дальнейшей разработки темы и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 31 рисунком. Список использованной литературы включает 201 источник, из них 60 отечественные и 141 иностранные авторы.
Роль активных форм кислорода при атеросклерозе. Современное представление об антиоксидантной системе организма человека
К настоящему времени сложилось четкое представление об АС, как о хронической воспалительной реакции, о чем свидетельствует волнообразный характер его течения со сменой фаз обострения и ремиссии.
В фазу обострения наблюдается резкое повышение уровня плазменных медиаторов воспаления в сосудистом русле, прогрессирование дисфункции эндотелия, мощная активация клеток-эффекторов воспаления, что приводит к выбросу в сосудистое русло супероксид-радикалов, продуктов перекисного окисления липидов, ускорению тромбогенеза и, как следствие этого, к деструкции сосудистой стенки [30,96,117]. За этим процессом давно закрепился термин «окислительного или оксидативного стресса».
В фазу ремиссии уровень воспалительных медиаторов и АФК снижается, наступает баланс в кровеносном русле и эндотелии и атерогенные бляшки вместе с содержащимися в них тромбами стабилизируются. Такая последовательность процессов может происходить в стенке любого сосуда, независимо от локализации, что, несомненно, сказывается на клинической картине заболевания. Именно этот механизм, рано или поздно, приводит к дестабилизации АБ и развитию окклюзирующих осложнений [76,84,163]. В настоящее время сформировалась концепция о важной роли окислительного стресса в патогенезе АС [4,158,198], что сопровождается нарушением баланса в системе прооксидантной/ антиоксидантной защиты организма со сдвигом в сторону накопления прооксидантов, к которым, в первую очередь, относят АФК [37,143]. Согласно перекисной гипотезе возникновения и развития АС, по которой главным фактором, провоцирующим это заболевание являются свободные радикалы [11,23,53]. Свободным радикалам могут противостоять только эндогенные антиоксиданты (АО). При недостатке же эндогенных АО в организме наблюдается беспрепятственное развитие АС [161].
Сам механизм развития АС по этой гипотезе мало изучен. Одни авторы полагают, что свободные радикалы, а это, по-видимому, преимущественно АФК, которые, прежде всего, повреждают стенки артерий c формированием АБ [35]. А другие считают, что ведущая роль в атерогенезе принадлежит частицам ЛПНП, подвергшимся окислению свободными радикалами [127]. Окисленные формы ЛПНП (оЛПНП), находясь в стенках артерий, вызывают на себя те же макрофаги, речь о которых шла выше. Моноциты, захватив оЛПНП и трансформируясь в макрофаги, не могут выйти из стенок артерий и переходят в пенистые клетки, из которых и развиваются затем АБ по схеме, описанной выше. Согласно данной гипотезы не столь важно знать, повреждаются ли вначале стенки артерий свободными радикалами, инициируя тем самым развитие АС, или же процесс АС сам провоцирует активацию оЛПНП. Возможно, что оба эти процесса идут параллельно и независимо друг от друга, то есть частицы ЛПНП могут подвергаться окислению свободными радикалами и стенки артерий могут повреждаться свободными радикалами, а в итоге создаются условия для развития АС [184,185].
Окисление молекул липидов приводит к необратимому изменению мембранных структур клеток и нарушению их проницаемости для ионов. АФК необходимы для энергетического обеспечения, а также для борьбы с инфекционными агентами, детоксикации ксенобиотиков, регуляции структурных процессов (пролиферации, дифференцировки и апоптоза). Вместе с тем высокая реакционная способность кислорода, особенно его активных форм, участвующих в разнообразных патологических процессах (воспаление, лихорадка, ишемия и другие нарушения работы организма), определяет целесообразность включения многоуровневой системы защиты [16,47]. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов перекисного окисления липидов можно условно разделить на физиологическую – механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам, и биохимическую – собственно антиоксидантная система (АОС) организма, включающая широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов. Физиологический компонент системы антиоксидантной защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Биохимическую АОС организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую.
Специфическая АОС направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АОС связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительно - восстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомального окисления) [6,22]. Неспецифическая АОС включает ряд белков плазмы, таких как церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин и другие, играющих важную роль в защите жидких сред организма. Для понимания механизмов действия АО их можно разделить по точкам приложения или выполнения ими антирадикальной функции.
Патогенному воздействию АФК на организм противостоят специализированные ферментные системы. К специфическим антиоксидантным ферментам можно отнести такие АО первой линии защиты, как супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и параоксоназа (PON) и ферменты системы глутатиона: глютатионпероксидаза (GPX), глутатионредуктаза (GRD) и глутатионтрансфераза (GTF) [12,34,50]. Эта группа ферментов, локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать свободные радикалы, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Ферменты антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации, а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других. Содержание антиоксидантных ферментов в различных тканях организма существенно различается. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом [94,136]. В условиях гипоксии и гипероксии, то есть состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток [36,107]. Ферментные АО практически всегда выполняют свою функцию внутри клеток, так как большая молекулярная масса молекул ферментов препятствует их выходу из клетки, это же является препятствием для проникновения внутрь клетки введенных в организм в виде лекарственных препаратов экзогенных ферментов (например, SOD) [27]. Среди неферментных АО можно выделить соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами (витамины С, D, Е, К, F; убихиноны, триптофан, фенилаланин, флавоноиды, каротины и каротиноиды; вещества, имеющие в своем составе SH-группы) [44,126]. Этанол, манит, глюкоза и некоторые другие органические молекулы эффективно акцептируют синглетный кислород и гидроксильный радикал [3,109]. Нарушение баланса между прооксидантной и антиоксидантной системами организма приводит к развитию окислительного стресса, что в комплексе с наличием гиперлипидемии создает благоприятные условия для развития АС. Окислительная модификация ЛПНП в общей циркуляции выражена слабо. Основной процесс клеточного окисления ЛПНП in vivo происходит в субэндотелиальном слое артериальной стенки в условиях высокой концентрации ионов металлов переменной валентности (Cu2+ и Fe2+) и в присутствии активных кислородных метаболитов, секретируемых макрофагами, Т-лимфоцитами и пенистыми клетками [132,146].
В норме существует баланс между образованием АФК и уровнем АОС, который обеспечивает физиологически необходимый уровень АФК. Баланс окислительно-восстановительных процессов в клетке определяет клеточный редокс-статус (от англ. redox — reduction-oxidation reaction). Баланс между продукцией АФК и уровнем АОС вносит значительный вклад в состояние клеточного редокс-статуса. Изменения редокс-состояния молекул, являющиеся следствием стрессовых воздействий или результатом активности самих клеток, вовлечены в редокс-регуляцию клеточных процессов. Важную роль в поддержании клеточного редокс-статуса и в редокс-регуляции играют тиолсодержащие молекулы глутатиона (GSH) и -глутамил-L-цистеинилглицина (GSSG), а также и редокс-зависимые белки - тиоредоксины, глутаредоксины и пероксиредоксины [2,17,33,173].
Клиническая характеристика пациентов и количественный анализ выявленной экспрессии исследуемых генов во второй группе с мультифокальным атеросклерозом периферических артерий
Вторую группу обследованных составили пациенты с МФА периферических артерий, то есть с поражением от двух сосудистых бассейнов и более. Среди пациентов с МФА преобладали мужчины – 48 чел (84,2 %).
Основные анамнестические данные обследованных пациентов второй группы представлены в таблице 10. Так, в группе с МФА периферических артерий 33,3 % имели поражение коронарных артерий (по данным КАГ). Из них у 24,6% - постинфарктный кардиосклероз (ПИКС), а 19,3 % - стабильная стенокардия, 33,3 % - ишемическая кардиомиопатия, у 31,6% - ФВ 40%. Диагноз ИБС был верифицирован на основании имеющейся у пациента медицинской документации (данных тестов с нагрузкой, суточного мониторирования ЭКГ, ЭХО-КГ, КАГ). Если указание в анамнезе на перенесенный ИМ сочеталось с одним из объективных признаков (зубцы Q на ЭКГ, зоны нарушенной локальной сократимости по данным ЭХО-КГ), диагноз ПИКС считали доказанным (таблица 11).
Проявления цереброваскулярной болезни (ЦВБ) наблюдались в 47,4% случаев в виде перенесенного острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) и у половины случаев в виде хронической ишемии головного мозга.
Клинические проявления АС артерий нижних конечностей наблюдались у 32 пациентов (56,1 %). Практически у всех пациентов имелось от 1 до 3 сопутствующих заболеваний в стадии клинической ремиссии или медикаментозно контролируемых. Наиболее частой сопутствующей патологией была АГ – у 33 пациентов (57,9 %) (таблица 10).
Учитывая наибольшую доступность для исследования бассейна БЦА, в качестве оценки степени атеросклеротического поражения оценивался стеноз одной из основных его ветвей - ВСА. По степени стенозов ВСА пациенты второй группы были разделены на две подгруппы:
- со стенозом ВСА 50-70 % (выраженный стеноз);
- со стенозом ВСА 71-99% (критический стеноз). При этом, облитерирующий АС нижних конечностей был выявлен у 11 человек.
Далее были проанализированы различия по частоте встречаемости ФР, к которым относились возраст, АГ, дислипидемия, курение, семейный анамнез раннего развития ССЗ, СД, ожирение (ИМТ), злоупотребление алкоголем, гиподинамия. Полученные данные представлены в таблице 12.
Уровень общего ХС крови менее 5,0 ммоль/л наблюдался у 25 пациентов (43,9 %) с МФА, умеренное повышение общего ХС (от 5,1 ммоль/л до 6,1 ммоль/л) отмечалось у 17 пациентов (29,8%) и высокий уровень общего ХС (более 6,2 ммоль/л) определялся у 15 пациентов (26,3%). 100% пациентов принимали статины в терапевтических дозах, антиагреганты, антигипертензивные и антиангинальные препараты по показаниям.
Количественный анализ выявленной активности генов регуляторов СР и окисления липидов пациентов с МФА периферических сосудов проводился в зависимости от ФР развития ССЗ и степени стеноза ВСА по данным ЦДС сосудов БЦА.
Согласно полученным данным, экспрессия генов GPX1, NQO1(p 0,001), SOD2, SOD1, GCLC (p 0,05) выявлялась чаще у мужчин, чем у женщин (таблица 13). У пациентов 59 лет и старше процент экспрессии всех исследуемых генов был, в целом, выше, чем в подгруппе меньше 60 лет. При этом, статистическая значимость различий наблюдалась при анализе экспрессии генов, кодирующих систему глутатиона (GPX1 и GCLC) и NADP- оксидоредуктазу (NQO1) (p 0,05) (таблица 13, рисунок 5).
Аналогичные результаты в зависимости от уровня холестерина в крови (таблица 13, рисунок 6) и наличия АГ в анамнезе (таблица 14, рисунок 7) были получены для большинства исследуемых генов GPX1, NQO1, GCLC, SOD2 (p 0,05).
Частота полученной активности исследуемых генов соответствовала тяжести стеноза ВСА. Так, у пациентов со стенозом ВСА от 71% и более процент выявленной экспрессии был существенно выше, чем в группе меньше 70%. Однако достоверность была зарегистрирована только для гена GCLC (p 0,05) (таблица 14, рисунок 8).
Таким образом, во второй группе с МФА периферических артерий наиболее часто выявлялась экспрессия большинства исследуемых генов в зависимости от возраста, уровня ХС в крови, наличия АГ, курения и степени стеноза ВСА.
Однако, статистически значимое повышение этого параметра было зарегистрировано только для генов, кодирующих систему глутатиона (GCLC и GPX1), митохондриальную супероксиддисмутазу (SOD2) и NADP оксидоредуктазу (NQO1).
Качественные показатели активности экспрессии генов скавенджер рецепторов и генов регуляторов окисления липидов во второй группе в зависимости от факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и степени стенозирования внутренней сонной артерии
У мужчин с МФА периферических артерий наблюдалась тенденция к замедлению достижения пороговых значений экспрессии генов CD68, GPX1, SOD2, SOD1, NQO1, HMOX1. При этом, статистически значимые различия были выявлены только для генов CD 68 и NQO1 (p 0,05 ) (таблица 23).
Показатели экспрессии генов в зависимости от возраста были неоднозначными. У большинства генов наблюдалось замедление экспрессии (СD68, SOD2, NQO1, SOD1, GCLC), однако статистически значимые различия были выявлены только при экспрессии гена SOD1 (таблица 23).
У пациентов с ГХС (рисунок 24) и избыточной массой тела наблюдалось общая закономерность в виде замедления экспрессии большинства исследуемых генов. При этом, активность генов GPX1, SOD1 и SOD2 у данной подгруппы была ниже, чем у пациентов без ГХС, в 84, 3,5 и 2 раза соответственно (p 0.01; p0,05) (таблицы 23 и 24).
Аналогичные результаты, но без статистически значимой достоверности были получены при исследовании уровня и величины экспрессии генов у пациентов второй группы с АГ. Еще меньше различий было выявлено у курящих пациентов. Вероятно, это связано с общей тяжестью течения АС в даннойгруппе пациентов, что, в какой то мере, уменьшает клиническую значимость такого ФР, как курение. Так, у курящих пациентов была выявлена статистически значимая экспрессия лишь у гена NRF2 (p 0,05) (таблица 24).
При анализе экспрессии исследуемых генов у пациентов с разной степенью атеросклеротического поражения ВСА, несмотря на более высокую частоту выявления самой экспрессии в подгруппе со стенозом 70%, все различия были статистически незначимыми (р 0.05) ; но выявлена умеренная обратная корреляционная связь между выраженностью стеноза ВСА - и экспрессией SOD2 (r=-0,28;p=0,050), GCLC ( r= -0,35;p=0,026).
Таким образом, у мужчин с ГХС и избыточной массой тела в группе МФА периферических артерий наблюдалось замедление экспрессии большинства исследуемых генов. Однако статистически значимые различия были выявлены только у генов, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD1, SOD2).
Кроме того, у пациентов с ГХС было обнаружено значительное удлинение достижения порога экспрессии гена, кодирующего глутатионпироксидазу (GPX1). Активность экспрессии гена СР (СD68), в целом, была ниже у курящих мужчин 59 лет и старше, с повышенным уровнем холестерина, избыточной массой тела и АГ.
Различий уровней экспрессии исследуемых генов в зависимости от степени стеноза ВСА выявлено не было ( таблица 25).
Корреляционный анализ
Нами был проведен корреляционный анализ между:
1) показателями экспрессии генов и факторами риска развития ССЗ в общей популяции;
2) показателями экспрессии генов и тяжести ССЗ.
Теснота корреляционной связи оценивалась по шкале Чеддока (0,3 – 0,5 – умеренная; 0,5 – 0,7 – заметная; 0,7 – 0,9 – сильная) (таблица 30).
В зависимости от факторов риска развития ССЗ была получена:
- заметная обратная корреляционная связь только между возрастом и экспрессией CD68 (r= -0,53; p=0,003) и NQO1 (r= -0.54; p=0,002);
- умеренная – между уровнем ХС и экспрессией CD68 (r= -0,40;p=0,011), NQO1 (r=-0,39; p=0,016) , генов регуляторов системы глутатиона GPX1 (r= 0,47;p=0,027) и GCLC (r= -0,31; p=0,050); курением и экспрессией HMOX1 (r= 0,46;p=0,001)и NRF2 (r= - 0,37; p=0,035); избыточной массой тела и экспрессией генов регуляторов системы глутатиона GPX1 (r= -0,39; p=0,016) и GCLC (r= 0,36;p=0,035); артериальной гипертензией и экспрессией NQO1(r= 0,39;p=0,015), GCLC (r= -0,27; p=0,040), полом и экспрессией NRF2 (r=0,48; p=0,001).
Между показателями экспрессии генов и тяжести ССЗ была выявлена:
- сильная прямая корреляционная связь между наличием инфаркта миокарда в анамнезе и экспрессией GPX1 (r=0,77; p=0,001), SOD2 (r=0,73; p=0,001), HMOX1(r=0,71; p=0,002);
- заметная – между инфарктом миокарда и экспрессией NQO1 (r=0,66; p=0,008),SOD1 (r=0,56; p=0,051), NRF2 ( r=0,58; p=0,043), GCLC (r=0,68; p=0,005);
- умеренная - между фракцией выброса левого желудочка и экспрессией CD68 (r=0,44; p=0,052), SOD2 (r=0,30; p=0,046), NQO1 (r= 0,44; p=0,030), генов регуляторов системы глутатиона GPX1 (r=0,41; p=0,013) и GCLC (r=0,30;
p=0,049). В группе МФА выявлена умеренная обратная корреляционная связь между выраженностью стеноза ВСА - и экспрессией SOD2 (r= -0,28; p=0,050), GCLC (r= -0,35; p=0,026) (таблица 30).
Был проведен анализ структуры взаимосвязи исследованных показателей экспрессии генов методом корреляционного кластерного анализа при уровне кластеризации равном 0,7, что соответствует значению корреляции 0,3 (р 0,05, при n 50).
Анализируя структуру взаимосвязей в целом по всем обследованным группам, было обнаружено наличие одного кластера. Он объединил гены CD68, SOD2, NQO1 и SOD1. Остальные результаты экспрессии генов показали независимость друг от друга.
В группах пациентов с разными клиническими проявлениями АС кластерный корреляционный анализ был проведен по значениям восьми сопоставимых показателей. В первой группе был выявлен кластер, состоящий из уровней экспрессии трех генов: NRF2, SOD1 и NQO1 (рисунок 29).
В отличие от предыдущей группы, в группе пациентов с МФА периферических артерий была выявлена большая степень кластеризации показателей экспрессии генов. В кластер были объединены пять показателей (в порядке объединения): NQO1, SOD2, СD68, SOD1 и GPX1. Только три показателя - GCLC, NRF2 и HMOX1 являлись независимыми (рисунок 30).
В группе пациентов с острыми коронарными событиями была выявлена та же степень кластеризации показателей экспрессии генов, что и в группе с МФА, но изменился один из показателей экспрессии. В этой группе в кластер были объединены следующие пять показателей (в порядке объединения): NQO1, SOD2, CD68, HMOX1 и GPX1. Остальные три показателя экспрессии генов GCLC, SOD1, NRF2 являются независимыми и могут быть использованы в качестве отдельных критериев ИМ (рисунок 31).
Таким образом, корреляционный кластерный анализ позволил кластеризировать совокупность показателей экспрессии генов, контролирующих работу СР CD68 и антиоксидантных ферментов (глутатионпироксидазы (GPX1), митохондриальной супероксиддисмутзы (SOD2), а также NADP оксидоредуктазы, превращающей хиноны в стабильные гидрохиноны (NQO1), в группах с клиническими проявлениями АС и дает основание к использованию данные совокупности показателей экспрессии генов при выявлении группы риска с осложненным АС.