Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Коронарная болезнь сердца и антитромбоцитарная терапия (обзор литературы) 11
1.1. Роль антитромбоцитарной терапии в профилактике сердечнососудистых событий 11
1.2. Феномен резистентности к антитромбоцитарным препаратам, распространенность и механизмы резистентности 15
1.3. Высокая реактивность тромбоцитов на фоне антитромбоцитарной терапии и риски сердечно-сосудистых катастроф 25
1.4. Возможные пути преодоления резистентности к антитромбоцитарным препаратам 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Дизайн исследования 41
2.2 Клиническая характеристика пациентов
2.2.1 Общая клиническая характеристика пациентов на терапии АСК 44
2.2.2 Общая клиническая характеристика пациентов на терапии клопидогрелом 46
2.3 Исследование функции тромбоцитов 49
2.3.1 Определение агрегации тромбоцитов 49
2.3.2 Определение диэлектрических характеристик тромбоцитов и других компонентов крови 2.4 Определение резистентности к терапии АСК и клопидогрелу 52
2.5 Генетический анализ 52
2.6 Статистический анализ 53
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторные особенности пациентов стабильной стенокардией резистентных и чувствительных к АСК и клопидогрелу 55
3.1 Встречаемость резистентности к АСК у пациентов стабильной стенокардией до и после АКШ (по результатам агрегационных тестов) 55
3.2 Диэлектрические особенности тромбоцитов и компонентов крови у пациентов стабильной стенокардией чувствительных и резистентных к АСК 60
3.2.1 Диэлектрические параметры тромбоцитов в диагностике резистентности к АСК 67
3.3 Диэлектрические особенности тромбоцитов и компонентов крови у пациентов стабильной стенокардией на комбинированной терапии АСК и клопидогрелом 70
ГЛАВА 4. Нуклеотидные полиморфизмы как возможная причина резистентности к аск и клопидогрелу 77
4.1 Однонуклеотидные полиморфизмы генов резистентности к АСК у пациентов стабильной стенокардией 78
4.2 Однонуклеотидные полиморфизмы генов резистентности к клопидогрелу у пациентов стабильной стенокардией на двойной антитромбоцитарной терапии (АСК+клопидогрел) 81
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов. Заключение 87
Выводы 97
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 104
З
- Высокая реактивность тромбоцитов на фоне антитромбоцитарной терапии и риски сердечно-сосудистых катастроф
- Определение диэлектрических характеристик тромбоцитов и других компонентов крови
- Диэлектрические особенности тромбоцитов и компонентов крови у пациентов стабильной стенокардией чувствительных и резистентных к АСК
- Однонуклеотидные полиморфизмы генов резистентности к клопидогрелу у пациентов стабильной стенокардией на двойной антитромбоцитарной терапии (АСК+клопидогрел)
Высокая реактивность тромбоцитов на фоне антитромбоцитарной терапии и риски сердечно-сосудистых катастроф
Антитромбоцитарный эффект АСК и клопидогрела у людей не одинаков. Существует документированная вариабельность как среди пациентов, так и среди здоровых добровольцев при лабораторной оценке агрегации тромбоцитов на фоне терапии антитромбоцитарными препаратами. У части пациентов блокирующие свойства лекарственных средств в отношении агрегации тромбоцитов могут быть минимальными либо со временем утрачиваются. [123] Распространенность резистентности к аспирину варьирует в пределах от 0% до 57% [18, 32, 69], к клопидогрелу 25-50 % [42, 74 , 75]. Причиной подобной вариабельности может быть отсутствие стандартизации методов диагностики, а также наличие у исследуемых сопутствующей патологии способной повлиять на состояние тромбоцитарных рецепторов.
Выделяют лабораторную и клиническую резистентность к антитромбоцитарным препаратам. К лабораторной резистентности относится высокая реактивность тромбоцитов на фоне терапии, к клинической – повторные неблагоприятные сосудистые события на фоне терапии антитромбоцитарными препаратами. [82]
Резистентность к аспирину может быть обусловлена клиническими факторами: низкой приверженностью к лечению [7,30], неадекватной дозой, низкой адсорбцией в тонком кишечнике (аспирин в энтеральной оболочке) [12], одновременным приемом с нестероидными противовоспалительными препаратами (индометацин, ибупрофен) [14], ингибиторами протонной помпы (ИПП). Среди причин резистентности к аспирину обсуждаются старший возраст, курение, гипергликемия, гиперхолестеринемия, сахарный диабет [26], острый коронарный синдром, застойная сердечная недостаточность, повышенный уровень катехоламинов, стресс, физическая нагрузка. Обсуждаемыми в литературе, клеточными механизмами резистентности к аспирину являются недостаточное подавление функции циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1), повышенная экспрессия циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) в тромбоцитах, эритроцитиндуцированная активация тромбоцитов, усиленное поступление в кровоток не подвергнутых воздействию аспирина тромбоцитов, возрастающая чувствительность тромбоцитов к аденозиндифосфату (АДФ) и коллагену, образование 8-изо простагландина F2a, большой размер тромбоцитов, увеличение количества тромбоцитов в крови, повышение уровня фактора Виллебранда в плазме, увеличение концентрации тромбина в плазме после аортокоронарного шунтирования в условиях искусственного кровообращения. Важная роль в развитие аспиринрезистентности принадлежит возможным генетическим факторам, таким как генетический полиморфизм рецепторов: гликопротеина (GP) IIb/IIIa, GP Iа, к коллагену, к тромбоксану, генетический полиморфизм ферментов: ЦОГ-1, ЦОГ-2, тромбоксан А2-синтазы. [5, 57, 58, 83, 121, 138 , 149, 154]
Связь аспиринрезистентности с наличием полиморфизмов гена, кодирующего ЦОГ-1, место приложения действия аспирина, представляется логичной. Однако результаты, полученные рядом исследователей, дают мало доказательств, для подтверждения этого тезиса. Недавние исследования показали, что резистентность к АСК у ряда людей может быть независимой как от полиморфизма гена ЦОГ-1 так и ЦОГ-2 [144 , 160, 176]. В работе [93] приводятся подобные результаты после оценки уровня тромбоксана (Тх) в сыворотке крови и в моче, агрегации, индуцированной арахидоновой кислотой у 148 здоровых субъектов с C50T/A-842G гетеро- или гомозиготным гаплотипом.
С другой стороны, ключевыми регуляторами агрегации тромбоцитов являются рецепторы GPIIb/IIIa. После активации клетки рецепторы способны связываться с фибриногеном и склеивать рядом расположенные тромбоциты друг с другом. Поэтому, полиморфизмы генов, кодирующих GPIIb/IIIa рецепторы, представляют большой интерес в исследовании аспиринрезистентности, наиболее исследованы единичные нуклеотидные полиморфизмы гена ITGB3 (Leo33Pro, rs5918). Некоторые исследователи указывают на взаимосвязь между наличием С аллеля и повышенной активностью тромбоцитов, их агрегацией и/или фибриноген связывающей способностью. [55, 97] Иные авторы обнаружили повышенную чувствительность к АСК у носителей данного полиморфизма [164] или отсутствие влияния носительства аллеля С на активность тромбоцитов. [116] В исследовании [191] различные полиморфизмы гена тромбоцитарных рецепторов GPIII встречались в следующей последовательности: ТТ – 55.3%, СТ – 39.4% и СС – 5,3%. У 180 пациентов со стабильной формой ИБС с гиперреактивностью тромбоцитов на фоне приема аспирина чаще встречался гомозиготный вариант СС. После многовариантного анализа генотип СС оказался единственным независимым фактором наличия гиперреактивности тромбоцитов.
Была предпринята попытка установить отношение полиморфизма гена тромбоцитарных рецепторов rs5918 к возникновению больших сердечнососудистых событий в течение года после ЧКВ. 200 пациентов с симптомной ИБС были обследованы на C аллель и затем наблюдались в течение года на фоне двойной антитромбоцитарной терапии АСК и клопидогрелом. Нормальный (ТТ), гетерозиготный (СТ), гомозиготный по мутантному аллелю (СС) варианты встречались с частотой 72%, 27,5% и 0,5%, соответственно. Наличие аллеля С не сопровождалось возникновением больших неблагоприятных событий в течение года после ЧКВ. [179] В работе [104] срок наблюдения за пациентами составил 18 месяцев. 1111 кавказоидов подвергались генотипированию по полиморфизму гена GPIIIa rs5918 после стентирования и наблюдались на предмет возникновения конечных точек: сердечнососудистой смертности, смерти от любой причины, фатального и нефатального ИМ, необходимости реваскуляризаии. Варианты генотипов встречались со следующей частотой: 71,6% - ТТ, 25,8% - ТС и 2,6% - СС. Полиморфный вариант rs5918 не имел влияния на отдаленные большие неблагоприятные события. Отсутствие однозначности в полученных результатах исследований не позволяет сделать вывод о том, что носительство мутантного аллеля rs5918 является определяющим в чувствительности тромбоцитов к АСК.
В исследовании [62] показано, что носительство аллеля Т полиморфизма гена тромбоцитарных рецепторов GPIа С807Т (rs1126643) имеет важное влияние на резистентность к АСК и может быть маркером генетической предрасположенности резистентности к аспирину. Исследование включало 200 пациентов китайского происхождения с высоким риском атеросклероза, принимавших аспирин (100 мг/сут) в течение 7 дней, метод оценки функции тромбоцитов – агрегатометрия, индуцированная АДФ и арахидоновой кислотой (АК). Ассоциацию полиморфизма С807Т и ишемического инсульта у азиатов описали Wu G. и соавт. в метаанализе 15 исследований 2242 пациентов и 2408 человек из контрольной группы, но со слов авторов, данная ассоциация не обнаружена в кавказской популяции. [115]
Определение диэлектрических характеристик тромбоцитов и других компонентов крови
Резистентность к АСК определялась при уровне агрегации тромбоцитов с арахидоновой кислотой более 20% хотя бы в одной точке наблюдения (недостаточный ответ тромбоцитов согласно инструкции к индуктору, разработанному «НПО Ренам») на дезагрегантной терапии после АКШ или при инкубации обогащённой тромбоцитами плазмы пациента с АСК in vitro до начала лечения АСК и проведения оперативного вмешательства (Рисунок 1). Также резистентность к АСК определялась при значениях хотя бы одного из параметров диэлектрических характеристик крови пациентов: r0, x0, y0 импеданс-годографа, выходящих за пределы референтного интервала, определенного для чувствительных к АСК пациентов [9]
Резистентность к клопидогрелу определялась как степень уменьшения максимальной интенсивности агрегации тромбоцитов под действием 5 М АДФ по отношению к исходному значению (на фоне отмены клопидогрела минимум за 5 суток до АКШ) по формуле: (Амплитуда агрегации исходная-Амплитуда агрегации на 8-10 сутки после АКШ)/ Амплитуда агрегации исходная 100%. При значениях 29% и 30% пациенты определялись как резистентные и чувствительные к терапии клопидогрелом. [38]
Генетический анализ проводился на базе Красноярского филиала Гематологического научного центра РАМН (директор, к.м.н, доцент Ольховский Игорь Алексеевич) ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс» научно-производственной фирмы «Литех». Далее с образцами выделенной ДНК была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием комплектов реагентов для амплификации «SNP-экспресс» и «SNP-экспресс-РВ» с электрофоретической детекцией продуктов амплификации и детекцией результата в режиме реального времени соответственно. Образцы ДНК были исследованы на наличие полиморфизмов в генах, кодирующих компоненты тромбоцитарных рецепторов, опосредующих процессы адгезии и агрегации кровяных пластинок: ген АДФ-рецептора тромбоцитов P2RY12 (СT, rs2046934); ген рецептора к коллагену ITGA2 (807 СT (Phe224Phe), rs1126643); ген рецептора к фибриногену ITGB3 (176 TC (Leu33Pro), rs5918), ген тромбоцитарного рецептора фактора Виллебранда GP1BA (Thr145Met, rs6065), ген цитохрома Р450 СYP2C19 2 и CYP2C19 3 (rs4244285; rs4986893).
Выражаю искреннюю благодарность за обучение методике ПЦР в реальном времени и с электрофоретической детекцией к.б.н., доценту, старшему научному сотруднику учебного отдела красноярского филиала Гематологического научного центра РАМН Субботиной Татьяне Николаевне.
Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ SPSS Statistics (Версия 20.0) и программы Excel for Windows.
Для количественных показателей вычислялись следующие показатели описательной статистики: среднее значение, стандартное отклонение, квартили, минимальное и максимальное значение. Описательные статистики представлены как M±, где М - средняя арифметическая величина вариационного ряда, - ошибка среднего. Для качественных показателей вычислялись следующие показатели: число наблюдений и доля (в %) от общего количества пациентов или от количества пациентов в соответствующей подгруппе. Проверка нормальности распределения значений переменных в группах наблюдения проводилась с использованием критерия Колмагорова-Смирнова.
Достоверность различий между двумя независимыми выборками оценивалась по критерию Манна-Уитни при несоответствии выборки нормальному закону распределения, либо при n 30. При соответствии выборки нормальному закону распределения различия между независимыми выборками проводили с помощью t-критерия Стьюданта. Сравнение между двумя зависимыми выборками проводилось с помощью теста Уилкоксона. Для категориальных переменных применяли 2-тест. При частоте встречаемости признака 5 и менее использовался точный критерий Фишера. Для оценки риска развития резистентности при наличии мутантного аллеля изучаемых полиморфизмов производили оценку отношения шансов в таблицах сопряженности 2 2 с расчетом доверительных интервалов по стандартной методике с помощью четыпехпольной таблицы. Формула расчета отношения шансов: (ОШ) = (a/b)/(c/d).Соотношение между количественными показателями оценивалось с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (n 30) или Пирсона (при n 30 и нормальном распределении выборки). Различия считали статистически значимыми при уровне значимости 95% (р 0,05).
Диэлектрические особенности тромбоцитов и компонентов крови у пациентов стабильной стенокардией чувствительных и резистентных к АСК
Это позволило нам сделать вывод о том, что одной из причин резистентности к АСК после аортокоронарного шунтирования являются: применение селективных НПВС в послеоперационном периоде.
Воздействия на ЦОГ отражаются в синтезе двух важных регуляторов гемостаза - простаноидов ТхА2 простациклина. Простациклин является ингибитором активации тромбоцитов и вазодилататором. Клетки эндотелия сосудов способны синтезировать обе изоформы ЦОГ, что важно учитывать для кардиопротекции. Селективные НПВС, воздействуя в большей степени на ЦОГ-2, одновременно подавляют выделение простациклина, что может способствовать сохранению высокой остаточной реактивности тромбоцитов и, как следствие, вероятности тромбозов и развитию неблагоприятных сердечнососудистых событий [119].
Не исключено что умеренное нарушение функции почек после искусственного кровообращения и синдром воспаления, обусловленный операционной травмой, могут быть одной из причин транзиторной резистентности тромбоцитов к АСК. По данным исследования Modica A. и соавт., резистентность к АСК в 2 раза чаще наблюдалась среди пациентов с ОКС и пневмонией, по сравнению с пациентами имеющими только ОКС – 90% против 46% [141].
Также установлено, что на фоне 10 – дневной терапии АСК, у 33% пациентов резистентных к АСК (агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой на фоне приема аспирина 20 %) после инкубации тромбоцитов с АСК in vitro агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой составляла уже 20%. Очевидно, что у этих пациентов была снижена биодоступность кишечнорастворимой формы АСК. Grosser T. и соавт., также указывают на связь между резистентностью к АСК и приемом аспирина в энтеральной оболочке [98].
Таким образом, для снижения частоты резистентности к АСК и рисков тромбозов шунтов после АКШ, в послеоперационном периоде следует отдавать предпочтение неселективным НПВС, не кишечнорастворимым формам АСК. Поэтому, при повышенном воспалительном ответе после АКШ и нарушении функции почек можно рекомендовать оценку функциональной активности тромбоцитов и при повышенной остаточной реактивности тромбоцитов на терапии АСК возможно добавление клопидогрела к терапии АСК.
Для понимания влияния морфо-функционального состояния тромбоцитов на резистентность к антитромбоцитарным препаратам нами изучены диэлектрические параметры тромбоцитов, цельной крови и ее компонентов.
Выявлена достоверность отличий диэлектрических характеристик крови в группах АР и АЧ пациентов, что позволяет использовать данный тест в реальной клинической практике для прогнозирования и диагностики недостаточного ответа тромбоцитов на АСК, с целью коррекции антитромбоцитарной терапии и профилактики тромбозов коронарных шунтов. Чувствительность метода составила 79,2%, специфичность - 76,9%.%. Частота встречаемости резистентности к АСК, определенная методом Фурье-спектроскопии составила 40,5%.
Также, анализируя диэлектрические параметры крови и ее компонентов, не остается незамеченным огромная роль межклеточного взаимодействия (тромбоцитов и моноцитов) в повышенной реактивности тромбоцитов и воспалительной реакции после АКШ.
На 1-3 сутки после АКШ диэлектрическая активность тромбоцитов пациентов на терапии АСК коррелирует с количеством моноцитов, уровнем креатинина. А диэлектрические свойства плазмы крови коррелируют с количеством моноцитов, базофилов, лимфоцитов, нейтрофилов.
Из полученных данных можно сделать вывод о том, что диэлектрическая активность тромбоцитов взаимосвязана с межклеточным взаимодействием. Диэлектрическая активность тромбоцитов взаимосвязана с количеством клеток белой крови при воспалительном ответе. Тромбоцит рассматривается как активный участник воспаления и по данным литературы [195]
На 8-10 сутки подобных корреляционных связей как на терапии АСК так и на двойной антитромбоцитарной терапии не прослеживается, что может быть связано с противовоспалительным влиянием АСК и клопидогрела, уменьшающее взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами [56]
Одной из причин резистентности к антитромбоцитарным препаратам называют мутации генов, кодирующих тромбоцитарные рецепторы, циклооксигеназу-1, цитохром р450. [86, 182, 168] Однозначного мнения о четкой ассоциации генетических полиморфизмов и резистентности к АСК в настоящий момент нет, что связано с отсутствием стандартизации тестов функциональной активности тромбоцитов, с различием применяемых диагностических критериев резистентности к АСК. Несколько независимых исследований продемонстрировали ассоциацию между субоптимальным образованием активного метаболита клопидогрела, снижением подавления функции тромбоцитов, наличием полиморфизмов генов печеночных энзимов и клиническими исходами. [110, 34, 30] Тем не менее, ни одно исследование не связало все эти параметры в одной популяции, сохраняются некоторые неопределенности. Остаются открытыми вопросы о возможности генотипирования пациентов до назначения антитромбоцитарных препаратов для выявления групп высокого тромботического риска, о необходимости дальнейших исследований ассоциации полиморфизмов генов с развитием первичной резистентности к антитромбоцитраным препаратам, а также с риском развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. В нашем исследовании мы изучили не только частоту распространенности полиморфизмов генов тромбоцитарных рецепторов и цитохрома р450 среди резистентных и чувствительных к АСК и клопидогрелу пациентов, но также сравнили носителей мутантного аллеля с носителями нормальной гомозиготы полиморфизмов данных генов.
Однонуклеотидные полиморфизмы генов резистентности к клопидогрелу у пациентов стабильной стенокардией на двойной антитромбоцитарной терапии (АСК+клопидогрел)
Таким образом, для снижения частоты резистентности к АСК и рисков тромбозов шунтов после АКШ, в послеоперационном периоде следует отдавать предпочтение неселективным НПВС, не кишечнорастворимым формам АСК. Поэтому, при повышенном воспалительном ответе после АКШ и нарушении функции почек можно рекомендовать оценку функциональной активности тромбоцитов и при повышенной остаточной реактивности тромбоцитов на терапии АСК возможно добавление клопидогрела к терапии АСК.
Для понимания влияния морфо-функционального состояния тромбоцитов на резистентность к антитромбоцитарным препаратам нами изучены диэлектрические параметры тромбоцитов, цельной крови и ее компонентов.
Выявлена достоверность отличий диэлектрических характеристик крови в группах АР и АЧ пациентов, что позволяет использовать данный тест в реальной клинической практике для прогнозирования и диагностики недостаточного ответа тромбоцитов на АСК, с целью коррекции антитромбоцитарной терапии и профилактики тромбозов коронарных шунтов. Чувствительность метода составила 79,2%, специфичность - 76,9%.%. Частота встречаемости резистентности к АСК, определенная методом Фурье-спектроскопии составила 40,5%.
Также, анализируя диэлектрические параметры крови и ее компонентов, не остается незамеченным огромная роль межклеточного взаимодействия (тромбоцитов и моноцитов) в повышенной реактивности тромбоцитов и воспалительной реакции после АКШ.
На 1-3 сутки после АКШ диэлектрическая активность тромбоцитов пациентов на терапии АСК коррелирует с количеством моноцитов, уровнем креатинина. А диэлектрические свойства плазмы крови коррелируют с количеством моноцитов, базофилов, лимфоцитов, нейтрофилов.
Из полученных данных можно сделать вывод о том, что диэлектрическая активность тромбоцитов взаимосвязана с межклеточным взаимодействием. Диэлектрическая активность тромбоцитов взаимосвязана с количеством клеток белой крови при воспалительном ответе. Тромбоцит рассматривается как активный участник воспаления и по данным литературы [195]
На 8-10 сутки подобных корреляционных связей как на терапии АСК так и на двойной антитромбоцитарной терапии не прослеживается, что может быть связано с противовоспалительным влиянием АСК и клопидогрела, уменьшающее взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами [56]
Одной из причин резистентности к антитромбоцитарным препаратам называют мутации генов, кодирующих тромбоцитарные рецепторы, циклооксигеназу-1, цитохром р450. [86, 182, 168] Однозначного мнения о четкой ассоциации генетических полиморфизмов и резистентности к АСК в настоящий момент нет, что связано с отсутствием стандартизации тестов функциональной активности тромбоцитов, с различием применяемых диагностических критериев резистентности к АСК. Несколько независимых исследований продемонстрировали ассоциацию между субоптимальным образованием активного метаболита клопидогрела, снижением подавления функции тромбоцитов, наличием полиморфизмов генов печеночных энзимов и клиническими исходами. [110, 34, 30] Тем не менее, ни одно исследование не связало все эти параметры в одной популяции, сохраняются некоторые неопределенности. Остаются открытыми вопросы о возможности генотипирования пациентов до назначения антитромбоцитарных препаратов для выявления групп высокого тромботического риска, о необходимости дальнейших исследований ассоциации полиморфизмов генов с развитием первичной резистентности к антитромбоцитраным препаратам, а также с риском развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. В нашем исследовании мы изучили не только частоту распространенности полиморфизмов генов тромбоцитарных рецепторов и цитохрома р450 среди резистентных и чувствительных к АСК и клопидогрелу пациентов, но также сравнили носителей мутантного аллеля с носителями нормальной гомозиготы полиморфизмов данных генов.
При подробном анализе частоты встречаемости генетических вариантов полиморфизмов у АР и АЧ пациентов между этими группами не было выявлено статистических отличий по трем предполагаемым полиморфизмам резистентности к АСК: rs5918 (гена тромбоцитарного рецептора к фибриногену), rs1126643 (гена тромбоцитарного рецептора к коллагену), rs2046934 (гена тромбоцитарного АДФ-рецептора). У мутантных аллелей и нормальных гомозигот по данных полиморфизмам генов не было найдено достоверных отличий по агрегационным свойствам тромбоцитов.
Значимо чаще в группе АР встречается мутантная аллель полиморфизма rs6065 гена рецепторов к фактору Виллебранда GB1BA и у носителей мутантного аллеля полиморфизма GB1BA площадь под кривой агрегации тромбоцитов с индуктором АК на 10 сутки после АКШ была выше таковой в отличие от носителей нормальной гомозиготы полиморфизма. Как известно, после АКШ повышается уровень эндотелиального воспаления, фактора Виллебранда, который может сильнее активировать тромбоцит при повышенной экспрессии на нем рецепторов к фактору Виллебранда и снижать эффективность АСК. [10]