Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. История изучения атеросклероза 12
1.2. Изменения в артериальной стенке при атеросклерозе 14
1.3. Адаптивный иммунитет в атерогенезе 17
1.4. Т-хелперы 1 типа 21
1.5. Т-хелперы 2 типа 21
1.6. Т-хелперы 17 22
1.7. Регуляторные Т-лимфоциты 23
1.8. Изучение роли субпопуляций лимфоцитов в развитии атеросклероза и его осложнений у человека 27
1.9. Лимфоциты, распознающие антигены в атеросклеретической бляшке
1.10. Иммуномодулирующие эффекты окЛНП 35
1.11. Заключение 3 7
2. Материалы и методы 39
2.1. Клиническое обследование пациентов, включенных в исследование 39
2.2. Получение образцов крови 43
2.3. Получение и активация мононуклеарных клеток крови в культуре 43
2.4. Выделение CD4+ лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации из мононуклеарной фракции крови здоровых добровольцев 43
2.5. Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке 44
2.6. Определение содержания ИЛ-17, ИЛ-10, вчСРБ, sCD25 в крови з больных
2.7. Получение окЛНП 47
2.8. Культивирование мононуклеарных и CD4+ клеток в присутствии окЛНП 47
2.9. Определение лимфоцитов, активированных в присутствии окЛНП, методом ELISPOT 48
2.10. Определение концентрации цитокинов в среде культивирования лимфоцитов 49
2.11. Статистический анализ данных 49
.Результаты 51
3.1. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления у пациентов с различной выраженностью и скоростью прогрессирования атеросклероза коронарных артерий 51
3.2. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления у пациентов с ИМ в анамнезе 60
3.3. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления в зависимости от пола 64
3.4. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления в зависимости от статуса курения 67
3.5. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления в зависимости от возраста 69
3.6. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий 69
3.7. Оценка показателей субпопуляционного состава лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления в зависимости от скорости прогрессирования (проспективно) атеросклероза коронарных артерий 74
3.8. Оценка действия окЛНП на содержание субпопуляций лимфоцитов в культурах мононуклеарных клетоки и CD4+ 81 лимфоцитов 3.9. Оценка активации мононуклеарных лейкоцитов в присутствии окЛНП по содержанию цитокинов в среде культивирования 82
3.10. Оценка активации лимфоцитов в мононуклеарной фракции в присутствии окЛНП методом поточной цитометрии и ELISPOT 84
4. Обсуждение результатов 88
Заключение 103
Выводы 105
Практические рекомендации 107
Список цитируемой литературы 1
- Изменения в артериальной стенке при атеросклерозе
- Лимфоциты, распознающие антигены в атеросклеретической бляшке
- Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке
- Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Атеросклероз (АС) представляет собой хронический воспалительный
процесс, развивающийся в интиме артерий. Воспаление инициируется
накоплением веществ, в первую очередь, окисленных липопротеидов низкой
плотности (окЛНП), которые способны активировать клетки
неспецифического иммунитета и обладают свойствами аутоантигенов
(аутоАГ). Презентация аутоАГ дендритными клетками (ДК) и макрофагами
Т-хелперам 1 типа (Тх1) стимулирует их пролиферацию и синтез цитокинов,
участвующих в поддержании воспалительного процесса, прежде всего,
интерферона(ИНФ)-гамма. Согласно данным, полученным в моделях АС,
минорные субпопуляции Т-клеток контролируют течение воспалительного
процесса. Т-хелперы, продуцирующие интерлейкин (ИЛ)-17 (Tх17),
оказывают провоспалительное и проатерогенное действие, стимулируя
аутоиммунные реакции. Регуляторные Т-лимфоциты (Tрег), напротив,
оказывают противовоспалительное и антиатерогенное действие путем
секреции трансформирующего фактора роста (ТФР)-бета и ИЛ-10,
цитотоксических агентов и посредством контактных механизмов,
ингибирующих активность эффекторных клеток.
Большинство клинических данных о субпопуляционном составе лимфоцитов крови при атеросклерозе получено для пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС), в т.ч. инфарктом миокарда (ИМ): показано снижение количества Tрег и повышение содержания Тх1 и Тх17 у пациентов с ОКС по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией (СС) и лицами без значимого поражения коронарного русла. Наряду с этим, результаты исследований, посвящённых изучению иммунного баланса у пациентов со стабильными проявлениями АС коронарных артерий (КА) и брахиоцефальных артерий (БЦА), противоречивы. Данных о связи
показателей клеточного иммунитета со скоростью прогрессирования АС не опубликовано.
Работа выполнена по плану НИР ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а). Номер госрегистрации темы РК 114052670029.
Цель исследования. Изучение количества и функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов у пациентов с различной выраженностью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий и исследование влияния проатерогенных факторов на функциональную активность лимфоцитов в культуре.
Задачи исследования:
1. Определить содержание Тх1, Тх17 и Трег в крови у пациентов с
различной степенью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий.
-
Исследовать уровень цитокинов ИЛ-17, ИЛ-10, С-реактивного белка, измеренного высокочувствительным методом, и субъединицы рецептора ИЛ-2 (sCD25) в крови у пациентов с различной степенью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий.
-
Оценить влияние модифицированных ЛНП на содержание Тх1, Тх17 и Трег, а также на активность клеток по уровню продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток и СD4+ лимфоцитов, полученных из периферической крови здоровых добровольцев и пациентов с ИБС.
Научная новизна исследования. Впервые установлено изменение иммунологического баланса (уменьшение содержания в крови Трег и ИЛ-10 и увеличение содержания Тх17 и ИЛ-17) у больных с выраженным атеросклеротическим поражением КА и БЦА и с прогрессированием коронарного атеросклероза. Впервые показана связь базального уровня ИЛ-10-продуцирующих Т-клеток со скоростью прогрессирования коронарного АС у пациентов с диагностированной ИБС. Впервые установлено
присутствие в периферическом кровотоке человека лимфоцитов,
специфических к окЛНП.
Практическая значимость результатов исследования. Данные об
изменении иммунного баланса при АС могут лечь в основу дополнительных
диагностических методов, позволяющих оценить степень
атеросклеротических изменений КА и БЦА и прогнозировать скорость развития заболевания у конкретного больного. Выявление новых патогенетических звеньев атерогенеза способствует разработке методов лечения, воздействующих на воспалительный и иммунный компоненты АС.
Личное участие автора в получении результатов исследования.
Автором проводился анализ литературы, посвящённой изучаемой проблеме,
составление протокола исследования, ведение пациентов, включённых в
исследование, в течение стационарной госпитализации и амбулаторных
визитов. Автором проводилась работа с культурой лимфоцитов,
иммунофенотипирование клеток, отработана методика определения
активированных лимфоцитов методом ELISPOT. Автором выполнены статистическая обработка результатов, написание статей и тезисов, подготовка текста диссертации, разработка практических рекомендаций.
Внедрение результатов работы в клиническую практику и учебный процесс. Результаты работы внедрены в практику отдела хронической ИБС и лаборатории клеточной иммунологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ.
Апробация работы состоялась на межотделенческой научной
конференции ФГБУ «Российский кардиологический научно-
производственный комплекс» МЗ РФ 29 апреля 2015 года (протокол №22). Диссертация рекомендована к защите.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 5 работ в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ. Основные положения диссертации были представлены на международных и российских
конференциях: European Society of Сardiology Congress (2010), Congress of the European Atherosclerosis Society (2013, 2014, 2015), International Congress on Coronary Artery Disease (2009), Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference (2014, 2015), Конференция Инновационные технологии в медицине XXI века (2012), Юбилейная Всероссийская научно–практическая конференция с международным участием «Достижения современной кардиологии» (2014, 2015).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице, состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы, включающего 186 источников, в т.ч. 9 отечественных и 177 иностранных. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 19 рисунками, 6 клиническими примерами.
Изменения в артериальной стенке при атеросклерозе
Интима - внутренняя оболочка артериальной стенки, снаружи прилежит к медии. Состоит из слоя эндотелиальных клеток, обращенного к просвету сосуда, и двух соединительнотканных слоев, разделённых внутренней эластической мембраной, плохо различимой в местах бифуркаций, ветвления и изгибов артерий. Основными клеточными компонентами интимы являются эндотелиальные и гладкомышечные клетки, макрофаги, редко встречаются тучные клетки. Межклеточный матрикс, состоящий из протеогликанов, коллагенов, эластина, фибронектина и ламинина, компонентов плазмы, является основным компонентом интимы и составляет 60% ее объема. Матрикс является важным посредником транспорта и обмена питательных веществ, накопления продуктов обмена и средой для миграции клеток [144].
Физиологическое утолщение интимы возникает в местах бифуркации и изгибов артерий и является компенсаторным механизмом в ответ на механический стресс в участках сосудов с переменным потоком и напряжением сосудистой стенки. Часто раннее развитие атеросклеротического поражения возникает в участках сосудистой стенки с адаптивным утолщением интимы (коронарные и почечные артерии, внутренняя сонная артерия (ВСА) на уровне каротидного синуса, дорсальная стенка абдоминальной аорты) [144].
Повреждение или активация эндотелия часто рассматривается как фактор, предрасполагающий к развитию утолщения интимы. Согласно другой гипотезе, агрегация тромбоцитов или отложение фибрина на поверхности интимы (обнаруживающиеся уже у детей и молодых взрослых) могут служить инициирующим фактором к развитию АС [144].
Считается, что липопротеиды (нативные и модифицированные) инициируют воспалительную реакцию и развитие атеросклероза в сосудистой стенке. Липопротеиды проникают винтиму путём трансцитоза через эндотелиальный слой или диффузией через поры в базальной мембране и присутствуют в интиме всегда, однако лишь в ряде случаев вызывают развитие атеросклеротических изменений[144]. Браун и Голдштейн (Brown, Goldstein) в экспериментах по изучению эндоцитоза смоделировали захват искусственно модифицированных ацетилированием ЛНП макрофагами посредством скавэнджер-рецепторов, отличных от ЛНП-рецепторов [66]. В дальнейшем Хенриксен (Henriksen) с соавторами показали возможность захвата макрофагами ЛНП, модифицированных естественным путём с участием эндотелиальных клеток [72,148]. В последующих работах показана ключевая роль именно ферментативно (с участием ферметов миелопероксидазы, липоксигеназ и других) и неферментативно модифицированных ЛНП в атерогенезе [53,75,83,120,179]. В настоящее время нет единого мнения насчёт конкретных эпитопов ЛНП, запускающих иммунный ответ. Исследователи из Швеции изучали иммунный ответ в отношении различных фрагментов пептида апоВЮО, входящего в состав молекулы ЛНП, и разработали 2 синтетических пептида, обладающих наиболее выраженными иммуногенными и проатерогенными свойствами [117]. Предполагают, что не только липопротеиды, но и другие антигены, обнаруженные в АСБ, способны активировать воспалительные реакции в сосудистой стенке. Собственные молекулы организма, подвергшиеся модификации (окислению или гликозилированию) начинают распознаваться организмом как чужеродные, активируя таким образом системы врождённого и адаптивного иммунного ответа. Например, окисленная и гликозилированная формы бета-2-гликопротеина 1 - плазменного протеина, выполняющего роль кофактора фосфолипидов и естественного антикоагулянта, - способны активировать незрелые дендритные клетки. Эндотелиальные клетки в ответ на различные стрессовые условия (окислительный стресс, химические агенты, вирусы, ишемическое и реперфузионное повреждение) экспрессируют значительные количества белков теплового шока как в цитозоле, так и на поверхности мембраны. Часть молекул высвобождается в межклеточное пространство, становясь триггером иммунного ответа (HSP90, gp96). Окисленная форма гемоглобина также может участвовать в клеточно-опосредованных иммунных реакциях при атерогенезе. Источником гемоглобина в АСБ являются геморрагии из vasavasorum [26].
Классически принято выделять три начальных стадии формирования атеросклеротического поражения: I - локальные отложения липидов в виде пенистых клеток в интиме, II - объединение локальных скоплений пенистых клеток в жировые полоски, III - стадия, предшествующая выраженным изменениям (появление внеклеточных отложений липидов с дезорганизацией интимы). Общими чертами стадий начального АС является выраженное накопление липидов в пенистых клетках, увеличение количества клеточных элементов (преимущественно макрофагов и пенистых клеток, отмечаются незначительные количества Т-лимфоцитов, изолированные тучные клетки), при этом нарушение структуры межклеточного матрикса и архитектоники интимы минимально. Медиа и адвентиция, прилежащие к местам отложения липидов в интиме, на этих стадиях, как правило, интактны. Клиническая значимость начальной стадии АС определяется возможностью прогрессирования болезни [146]. Следующие стадии - стадии выраженных изменений при АС, характеризуются прогредиентными нарушениями архитектоники интимы. Тип IV - атерома, отличающаяся крупным скоплением внеклеточных липидов («липидное ядро») и дезорганизацией интимы, фиброзная ткань на данной стадии не выражена. V (Va) тип характеризуется формированием выраженных слоев соединительной ткани. Vb, трансформирующиеся затем в VII, - кальцифицированные АСБ. АСБ Vc типа, трансформирующиеся в VIII, - характеризуются преобладанием фиброзной ткани, замещающей структуры интимы, и почти полным отсутствием липидного ядра. VI тип - осложнённые АСБ, характеризующиеся наличием изъязвлений (поверхностных, затрагивающих только эндотелиальный слой, или глубоких, проникающих до липидного ядра), интрамуральных кровоизлияний, тромбоза. Наиболее предрасположенные к изъязвлению типы АСБ - это IV и Va. Факторами, провоцирующими развитие повреждения поверхности АСБ, являются присутствие провоспалительных клеток в АСБ и синтез протеолитических ферментов и активных форм кислорода макрофагами, спазм коронарных артерий, структурные особенности АСБ, гемодинамические факторы. Все указанные типы выраженных атеросклеротических изменений артериальной стенки объединяет, в первую очередь, выраженная дезорганизация интимы, а также изменения структуры медии и адвентиции, заключающиеся в появлении скоплений лимфоцитов, макрофагов, пенистых клеток, источником которых могут служить, предположительно, vasa vasorum. Клиническая значимость описанных изменений заключается в формировании стенозирования просвета артерии, а также в высокой вероятности развития осложнений, приводящих к полной окклюзии просвета артерии [143,145].
Воспаление в сосудистой стенке регулируется лимфоцитарными субпопуляциями. Антиген-презентирующие клетки (АПК), играют роль связующего звена между неспецифическим и адаптивным иммунитетом, передающего информацию о клеточном повреждении Т-лимфоцитам. Пептидные антигены, синтезируемые внутри клетки, процессируются нелизосомальными протеазами и соединяются в цитоплазме с синтезированными в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме молекулами МНС-1, затем комплекс АГ-МНС-1 поступает на наружную мембрану АПК и презентируются цитотоксическим CD8+ лимфоцитам. Экстрацеллюлярные патогены фагоцитируются и в фаголизосомах процессируются и связываются с молекулами МНС-2, активируя CD4+ Т-хелперы. Молекулы CD1 богаты неполярными аминокислотами, создающими сайты связывания для гидрофобных липидных и гликолипидных молекул. Липидные антигены экзогенного происхождения интернализуются и в эндолизосомах связываются с CD1, затем комплекс АГ-CD1 попадает на плазматическую мембрану и презентируется цитотоксическим CD8+ лимфоцитам [150,167]. Таким образом, молекулы липопротеидов, являясь экзогенными по отношению к АПК молекулами и состоящие из пептидной и липидной частей, активируют Т-хелперные лимфоциты через МНС-2 и цитотоксические лимфоциты через CD1.
Лимфоциты, распознающие антигены в атеросклеретической бляшке
Образцы периферической венозной крови получали перед проведением КАГ. Взятие крови осуществляли из кубитальной вены через 12 часов после приема пищи между 8 и 10 часами утра. Образцы периферической крови забирали в пробирки без антикоагулянта и в цитратный антикоагулянт. Для получения сыворотки образцы центрифугировали в течение 20 минут при 2000 g и в дальнейшем хранили при -70С. Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови образцы крови забирали в цитратный антикоагулянт и хранили не более 2 ч до иммунофенотипирования клеток. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов крови проводили в течение 24 часов после окрашивания.
Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности по методике Воушп [22]. Клетки в концентрации 5 млн/мл ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки человека. Для активации клеток в культуру вносили 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы Sigma). Клетки инкубировали 5 ч при 37С и 5% СОг.
Выделение CD4+ лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации из мононуклеарной фракции крови здоровых добровольцев Мононуклеарные клетки, выделенные из крови доноров, разводили в рабочем буфере (фосфатно-солевой буфер (ФБ) без Са2+ и Mg2+ (рН 7.4), 0.5 % бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ ЭДТА), 10 млн клеток в 80 мкл буфера. Для сепарации клеток использовали наборы производства MiltenyiBiotec. К клеткам добавляли магнитные бусы, конъюгированные с антителами к CD4 из расчета 20 мкл на каждые 10 млн клеток и инкубировали 15 минут при температуре 6-8С. После инкубации клетки отмывали центрифугированием (300 g, 10 минут, +4С) в рабочем буфере, и клеточный осадок ресуспендировали в рабочем буфере из расчета 500 мкл буфера на каждые 100 млн клеток. Для получения фракции CD4+ Т-лимфоцитов клеточную суспензию наносили на установленную в магнитном держателе колонку. Для удаления клеток, не экспрессирующих CD4, колонку промывали не менее трех раз рабочим буфером, после чего оставшиеся клетки снимали с колонки и отмывали в ФБ. Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева. Для определения чистоты полученной популяции клетки окрашивали антителами к CD3 и CD4, анализ связывания антител проводили на поточном цитофлюориметре. Содержание CD4+ лимфоцитов в выделенной фракции составляло 95-98%.
Для выявления поверхностных антигенов использовали флуоресцентно меченные моноклональные антитела CD4-FITC, -РС5, CD25-PC5, CD127-PE, CD45-APC (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, eBioscience, BeckmanCoulter). Окрашивание поверхностных антигенов проводили в цитратной крови с использованием растворов для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) и в культуре мононуклеарных лейкоцитов. Для идентификации внутриклеточных белков использовали наборы для фиксации и пермеабилизации клеток (eBioscience) и флуоресцентно меченные антитела (FoxP3-Alexa488, IL17A-PE, IL-10-PE, и IFN gamma-FITC, eBioscience). Окрашивание клеток антителами к цитокинам проводили после активации в культуре. Лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов, фиксацию и пермеабилизацию клеток проводили в соответствии с протоколами производителей. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлуориметрии в потоке (FACS Calibur, Becton Dickinson Immunocytometry Systems).
Лимфоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния (рисунок 4) и по экспрессии CD45.
Для определения количества апоптотических клеток пробы дополнительно окрашивали Аннексином V- FITC согласно протоколу производителя (BeckmanCoulter).
Исследование концентрации sCD25 и ИЛ-10 в сыворотке крови проводили хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC - Siemens). Концентрацию ИЛ-17 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом с использованием набора Bender MedSystems. Концентрацию СРБ определяли высокочувствительным методом на нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия - США). 200 40Q 600 300 1000
Выделенные мононуклеарные клетки или CD4+ лимфоциты, полученные от здоровых добровольцев и пациентов с коронарным атеросклерозом, 2-4 млн/мл, переводили в культуральную среду RPMI 1640, содержащую 10% инактивированной пулированной сыворотки человека, 10 мМ HEPES по 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 20 мкМ меркаптоэтанола, по 1% пирувата и смеси неэссенциальных аминокислот. При культивировании CD4+ лимфоцитов в среду культивирования дополнительно вносили рекомбинантный интерлейкин-2 человека (Cysl45Ser, RandDSystems) в количестве 4 нг/мл.
Клетки культивировали в 24-луночных с плоским дном или 96-луночных планшетах с U-образным дном в течение 24 (для мононуклеарных) или 48 часов (для CD4+) в С02-инкубаторе при 37С и 5% С02.
В опытные ячейки добавляли окЛНП в концентрации 5 и 50 мкг/мл. При анализе количества ИЛ-2-продуцирующих Т-клеток методом ELISPOT в качестве позитивного контроля использовали клетки, культивированные в присутствии фитогемагглютинина (митоген для Т-лимфоцитов, Sigma) в концентрации 5 мкг/мл. Для оценки относительного содержания лимфоцитарных субпопуляций (Тхі, Тх17) в последние 4 часа инкубации в среду культивирования клеток вносили 25 нг/мл ФМА, 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы Sigma).
В данном эксперименте использовали клетки мононуклеарной фракции, выделенные из периферической венозной крови здоровых добровольцев (п=8, средний возраст 40,4 лет) и пациентов с ИБС (п=10, средний возраст 57,8 лет), верификацию ИБС и коронарного АС проводили с использованием нагрузочных стресс-тестов и КАГ/ мультиспиральной компьютерной томографии коронарных артерий). Выявление лимфоцитов, активированных в присутствии окЛНП, производили по детекции продуцируемого ими ИЛ-2 методом ELISPOT, согласно протоколу производителя (BectonDickinson). Клетки культивировали в 96-лучноных плашках в концентрации 200 тыс клеток в 200 мкл среды. Для каждой пробы методом иммуно флюоресценции и поточной цитометрии определяли количество Т-лимфоцитов (CD3+CD45+ клеток) в составе мононуклеарной фракции; количество активированных лимфоцитов нормировали на общее содержание Т-лимфоцитов. Количество ИЛ-2 продуцирующих клеток определяли визуально путем подсчета окрашенных пятен на дне планшетов.
Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке
Состояние эффекторного и регуляторного звеньев иммунитета приИБС привлекает в последние годы особое внимание учёных и клиницистов. Это связано, прежде всего, с развитием современных экспериментальных решений. В работах ведущих лабораторий мира продемонстрирована значимость иммунного компонента атерогенеза. Полученные данные, в свою очередь, позволили предполагать абсолютно новые подходы к терапии атеросклероза, которые в настоящее время проходят доклинические фазы исследования, а некоторые уже допущены к клиническим исследованиям.
В настоящем исследовании мы впервые оценили баланс проатерогенных (Txl и Тх17) и антиатерогенных (Трег) популяций лимфоцитов и ассоциированных с ними растворимых маркеров у больных со стабильным течением ИБС и различной выраженностью и скоростью прогрессии коронарного АС.
У больных с тяжелым многососудистым атеросклерозом коронарных артерий по сравнению с пациентами без значимого коронарного атеросклероза мы наблюдали изменение субпопуляционного состава лимфоцитов крови - снижение содержания Трег и увеличение содержания Txl7. Содержание Трег было обратно пропорционально тяжести поражения коронарных артерий, оцененного по индексу Gensini.
Поскольку АС является системным заболеванием и поражает различные сосудистые бассейны, мы подтвердили изменения иммунного баланса (уменьшение содержания Трег и большие значения активированных лимфоцитов и Txl7), отмеченные у пациентов с ИБС, у лиц с выраженными атеросклеротическими изменениями БЦА.
В ряде работ подтверждено уменьшение содержания Трег [37,69,85] и нарушение их супрессорной функции [97,114] у пациентов со стабильной стенокардией по сравнению со здоровыми добровольцами. В одном из крупнейших исследований в данной области, включившем 200 пациентов, напротив, не было выявлено различий в содержании CD4+CD25highCD1271ow Трег между лицами без ИБС и пациентами со стабильной стенокардией [14]. В настоящем исследовании мы также не выявили различий в содержании исследуемых клеточных субпопуляций (Трег и Тх 17) и их соотношении у пациентов без значимого поражения КА и пациентов с 1-2-сосудистым поражением без прогрессирования коронарного АС. В то же время значимое изменение иммунологического баланса отмечается при тяжёлых атеросклеротических изменениях сосудов.
По-видимому, участие лимфоцитарного компонента в регуляции воспалительной реакции при атерогенезе наиболее важно на более поздних стадиях АС. Указанная тенденция прослеживается и при анализе результатов исследований, посвященных изучению иммунологических особенностей при АС сонных артерий. Ammirati с соавт. [14] не выявили различий в содержании Трег у пациентов с различной выраженностью АС сонных артерий на начальных стадиях (увеличение ТИМ до 1,5 мм). Данные Lui с соавт. (2012) указывают на снижение содержания Трег и более высокое содержание Тх17 и ассоциированных цитокинов у пациентов с выраженными атеросклеротическими изменениями и нестабильными АСБ в сонных артериях по сравнению с пациентами без АСБ в сонных артериях [103].
Нами был выявлен более высокий уровень sCD25 в крови у пациентов с многососудистым атеросклерозом коронарных артерий и с выраженным диффузным поражением брахиоцефальных артерий по сравнению с пациентами без значимого поражения артерий. sCD25 - растворимая («отщепленная» с поверхности клетки) форма рецептора ИЛ-2. Основным, источником sCD25 являются активированные лимфоциты [23], и уровень sCD25 значительно повышается при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях [78]. Концентрация sCD25 в крови также выше у пациентов с онкологическими заболеваниями, в этом случае его источником могут являться Трег [96,121]. Подтверждено повышение уровня sCD25 у пациентов с ОКС и стабильной стенокардией [5,139]. Ранее нами было показано увеличение содержания Трег и пропорциональное увеличение концентрации sCD25 в сыворотке у пациентов сАС коронарных артерий через 1 месяц после имплантации стентов с рапамициновым покрытием. Рапамицин и его аналоги, являясь цитостатическими агентами, подавляют иммунный ответ, опосредованный в том числе эффекторными лимфоцитами, и обладают уникальным действием, обеспечивающим выживание Трег. Вероятно, выявленное в данной работе увеличение содержания sCD25, пропорциональное увеличению уровня Трег, было обусловлено действием рапамицина. Указанные показатели возвращались к исходным значениям спустя 6 месяцев от вмешательства [124]. В настоящее исследование не включались пациенты, у которых срок от предыдущей ТБКА со стентированием не превышал 6 мес. В связи с тем, что содержание sCD25 в крови оказалось прямо пропорционально количеству Тх17 и обратно пропорционально содержанию Трег, мы считаем, что данный показатель может отражать процесс активации лимфоцитов при атеросклерозе.
При анализе концентрации вчСРБ были выявлены ожидаемо более высокие значения вчСРБ у больных с выраженным многососудистым атеросклеротическим поражением коронарного русла по сравнению с пациентами без значимого атеросклероза КА [101].
Сывороточная концентрация ИЛ-10 оказалась ниже у пациентов с многососудистым коронарным АС по сравнению с пациентами с интактными КА. В то же время отмечена тенденция к повышению содержания ИЛ-17 у пациентов с многососудистым поражением коронарного русла и выраженным АС сонных артерий по сравнению с пациентами с малоизменёнными артериями, что, в целом, подтверждает полученные ранее результаты, указывающие на связь повышенного уровна ИЛ-17 в сыворотке и атеросклеретических изменений сосудов у человека [97].
Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркёров воспаления у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий
Таким образом, проатерогенные эффекты факторов риска АС могут быть отчасти опосредованы подавлением регуляторного звена иммунитета и активацией провоспалительных клеточных субпопуляций.
Влияние статинов на иммунологические показатели и содержание маркёров воспаления у пациентов с ИБС и аутоиммунными заболеваниями активно обсуждаются в настоящее время. Терапия статинами способствует аккумуляции Трег в АСБ [111] и ассоциирована с увеличением количества циркулирующих CD4+ FoxP3+ Трег у здоровых добровольцев [129] и у пациентов с ОКС [82]. Указанные изменения иммунного статуса могут быть обусловлены плейотропными эффектами статинов, включая регуляцию внутриклеточных сигнальных каскадов и рецепторных межклеточных взаимодействий [16]. В настоящем исследовании все пациенты на момент включения получали терапию статинами в сопоставимых дозах, что позволило не учитывать данный параметр при анализе.
Окисленные ЛНП вызывают активацию мононуклеарных клеток крови in vitro, сопровождающуюся секрецией цитокинов ИЛ-1 бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-10, в меньшей степени - ИЛ-4 и ИЛ-17. При этом в концентрации ИЛ-1 бета, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИФН-гамма в среде культивирования клеток мононуклеарной фракции оказались значительно выше в случае присутствия в среде окЛНП по сравнению с поликлональным Т-клеточным митогеном ФГА. Это свидетельствует о значительной роли моноцитов, присутствующих в культуре мононуклеарных клеток, в секреции указанных цитокинов. Указанное влияние окЛНП на активацию неспецифического иммунитета, аналогичное эффекту липоплисахарида, подробно описано ранее [18]. В настоящей работе мы обнаружили активирующее действие окЛНП на компоненты адаптивного иммунитета - секрецию ИЛ-2 лимфоцитами, выделенными из периферической крови. В литературе описано выявление клонов АГ (окЛНП)-специфических лимфоцитов в АСБ животных и человека. Однако попытки идентифицировать окЛНП-специфические лимфоциты в периферическом кровотоке оказались безуспешны [149], что, вероятно, связано с низкой чувствительностью использованных методов. В настоящей работе мы применили ELISPOT для детекции АГ-специфических клеток. Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) в течение более чем 30 лет используется для детекции иммунного ответа в отношении инфекционных агентов, опухолевых антигенов, трансплантатов и вакцин. Отличие метода от иммуноферментного анализа заключается в том, что цитокины, продуцируемые активированными клетками в ответ на присутствие в среде культивирования антигена, сразу же связываются с антителами, которыми покрыто дно плашки, и не успевают деградировать в растворе, что обеспечивает высокую чувствительность метода и позволяет оценивать количество цитокин-продуцирующих клеток [158]. Fei с соавт. (2003) методом ELISPOT показали, что в АСБ человека присутствуют мононуклеарные лимфоциты, активирующиеся в присутствии окЛНП и продуцирующие ИЛ-12 и ИЛ-10 [56]. В данной работе впервые показано наличие АГ-специфических (активирующихся и секретирующих ИЛ-2) клеток в периферическом кровотоке здоровых добровольцев и, в меньшей степени, пациентов с мультифокальным АС.
В нормальных условиях наличие Трег обеспечивает достаточный уровень толерантности организма к аутоАГ. В случае внедрения в организм чужеродного АГ происходит активация провоспалительного звена и подавление регуляторных систем для более быстрой элиминации чужеродного агента. После элиминации равновесие восстанавливается. Однако в случае аутоиммунной реакции постоянное присутствие аутоАГ приводит к непрерывному течению воспалительного процесса и хроническому подавлению регуляторных систем (Трег). Исходя из литературных данных и полученных в настоящей работе результатов, ход воспаления в артериальной стенке при АС можно представить следующим образом. Нативные ЛНП проникают из плазмы в интиму здоровых сосудов. При активации эндотелия и присутствии в интиме макрофагов, вырабатывающих протеолитические ферменты и активные формы кислорода, ЛНП претерпевают химические изменения (в первую очередь, окисление). Модифицированные ЛНП являются триггерами активации реакций адаптивного иммунитета. окЛНП фагоцитируются АПК в АСБ и презентируются лимфоцитам в лимфатических узлах. В случае узнавания АГ в составе МНС-П лимфоцитом со специфическим Т-клеточным рецептором происходит активация и клональная пролиферация последнего. Клоны АГ-специфических лимфоцитов попадают в кровоток и циркулируют как клетки памяти. При неинтенсивном воспалительном процессе в сосудистой стенке и медленном образовании окЛНП модифицированные молекулы успевают удаляться из внеклеточного пространства, фагоцитируемые макрофагами (клиренс). При нарушении процессов клиренса (нарушение подвижности макрофагов, апоптоз, избыточное накопление окЛНП в межклеточном пространстве) окЛНП узнаются циркулирующими АГ-специфическими лимфоцитами, те интенсивно мигрируют в сосудистую стенку, их содержание в периферическом кровотоке уменьшается. Данная гипотеза может объяснять полученные в исследовании различия в количестве АГ-специфических лимфоцитов у здоровых лиц и пациентов с АС.
Важно отметить различие в возрасте групп здоровых добровольцев и пациентов с мультифокальным АС. Это может обуславливать различия в содержании лимфоцитарных субпопуляций вообще и в количестве АГ-специфических лимфоцитов в частности. Необходимо изучение динамики содержания клеток у здоровых людей с возрастом, сравнение с пациентами сАС соответствующего возраста. Диагностическая и прогностическая ценность данной методики в отношении пациентов с предрасположенностью к прогрессированию АС требует уточнения в дальнейших исследованиях.
Данные о влиянии окЛНП на выживаемость и активность мононуклеарных клеток в культуре немногочисленны и противоречивы. Культивирование лимфоцитов в среде с окЛНП приводило к подавлению пролиферации лимфоцитов в присутствии ФГА и усилению апоптоза [13,31]. Мы подтвердили усиление апоптоза Т-лимфоцитов в присутствии окЛНП. Возможно, отсутствие увеличения концентрации провоспалительных цитокинов в среде культивирования клеток с окЛНП обусловлено сравнительно невысоким содержанием АГ-специфических Т-лимфоцитов, их продуцирующих, и превалированием токсических эффектов окЛНП. Вероятно, в АСБ множественные факторы микроокружения способствуют развитию воспалительного ответа активированных лимфоцитов.