Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Недостаточная обеспеченность витамином D как новый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний 15
1.2 Роль витамина D в развитии атеросклеротических изменений сосудистой стенки и в регуляции иммунного воспаления 17
1.3 Структура и механизмы активации рецептора витамина D 20
1.4 Роль рецептора витамина D в развитии
сердечно-cосудистых заболеваний 21
1.5 Полиморфизм гена рецептора витамина D 23
1.6 Рецептор витамина D и ремоделирование сердца 26
1.7 Общность молекулярно-биологических эффектов рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа и рецептора витамина D 27
1.8 Медикаментозная коррекция дефицита витамина D 31
1.9 Про- и антивоспалительные факторы
у больных ишемической болезнью сердца 34
Глава 2 Материалы и методы исследования 38
2.1 Клинические методы обследования больных 38
2.2 Клиническая характеристика обследованных больных 39
2.3 Лабораторно-биохимическое обследование 43
2.4 Молекулярно-генетические методы исследования 44
2.5 Методы проведения иммуноферментного анализа 48
2.6 Инструментальные методы диагностики 49
2.7 Методы статистической обработки полученных результатов 53
Глава 3 FOKI и TAQI полиморфизм гена рецептора витамина D, L162V полиморфизм гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа и особенности клинического течения ишемической болезни сердца 54
3.1 FokI, TaqI полиморфизм гена рецептора витамина D
у больных ишемической болезнью сердца:
клинико-генетические сопоставления 54
3.1.1 Распределение FF, Ff, ff генотипов и встречаемости F и f аллелей гена рецептора витамина D у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы 54
3.1.2 Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff и ff генотипов гена рецептора витамина D 56
3.1.3 Распределение TT, Tt и tt генотипов и встречаемость T и t аллелей гена рецептора витамина D у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы 59
3.1.4 Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей TT, Tt и tt генотипов гена рецептора витамина D 60
3.1.5 Особенности клинического течения заболевания у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff и ff генотипов гена рецептора витамина D 63
3.1.6 Особенности клинического течения заболевания у больных ишемической болезнью сердца – носителей TT,
Tt и tt генотипов гена рецептора витамина D 66
3.1.7 Характер ремоделирования миокарда левого желудочка у больных ИБС – носителей FF, Ff, ff генотипов гена
рецептора витамина D 68
3.1.8 Характер ремоделирования миокарда левого желудочка у больных ишемической болезнью сердца – носителей TT, Tt и tt генотипов гена рецептора витамина D 70
3.1.9 Особенности атеросклеротического поражения коронарных сосудов у больных ИБС – носителей FF, Ff и ff генотипов гена рецептора витамина D 71
3.1.10 Особенности атеросклеротического поражения коронарных сосудов у больных ишемической болезнью сердца – носителей TT, Tt и tt генотипов гена рецептора витамина D 73
3.2 L162V полиморфизм гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью сердца: клинико-генетические сопоставления 74
3.2.1 Распределение L162L и L162V генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы 75
3.2.2 Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162L и L162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа 76
3.2.3 Особенности клинического течения заболевания у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162V и L162L генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа 77
3.2.4 Характер ремоделирования миокарда левого желудочка и атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162L и L162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа 79
Глава 4 Обеспеченность витамином d и характер атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сеРДЦА – носителей FF, Ff, ff генотипов И TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FOKI и TAQI полиморфизм) 84
4.1 Обеспеченность витамином D больных ишемической болезнью сердца и обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы 84
4.2 Дефицит и недостаточность витамина D у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI и TaqI полиморфизм) 88
4.3 Взаимосвязи содержания витамина D с показателями липидного спектра сыворотки крови, индексом массы тела, факторами иммунного воспаления у больных ишемической болезнью сердца 88
4.4 Обеспеченность витамином D, ремоделирование миокарда левого желудочка сердца и характер атеросклеротического поражения коронарных сосудов у больных ишемической болезнью сердца 89
Глава 5 Факторы иммунного воспаления у больных ибс – носителей ff, ff и ff генотипов; TT, Tt и tt генотипов гена рецептора витамина d (foki и taqi полиморфизм); L162L и L162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа 92
5.1 Содержание факторов иммунного воспаления у больных
ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff и ff генотипов
и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI и TaqI
полиморфизм); L162L и L162V генотипов гена рецептора
активатора пролиферации пероксисом-альфа 93 5.2 Корреляционные связи С-реактивного белка, интерлейкина-10 и интерлейкина-8, а также их соотношений с показателями липидного спектра сыворотки крови 95
5.3 Содержание С-реактивного белка, интерлейкина-10, интерлейкина-8, характер ремоделирования миокарда левого желудочка и атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца 96
Глава 6 Сочетания генотипов foki, taqi полиморфизма гена рецептора витамина d и l162v полиморфизма гена рецептора активатора пролиферации пероксисом альфа у больных ишемической болезнью сердца:особенности клинического течения заболевания 99
6.1 Распределение генотипов и их сочетаний у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff генотипов и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI и TaqI полиморфизм) , L162L и L162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа и обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы 99
6.2 Традиционные факторы риска и характер дебюта ишемической болезни сердца у больных ишемической болезнью сердца – носителей сочетаний генотипов FokI, TaqI полиморфизма гена рецептора витамина D и L162V полиморфизма гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа 102
Заключение 106
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список сокращений 123
Список литературы
- Общность молекулярно-биологических эффектов рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа и рецептора витамина D
- Лабораторно-биохимическое обследование
- Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff и ff генотипов гена рецептора витамина D
- Дефицит и недостаточность витамина D у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI и TaqI полиморфизм)
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является многофакторной, полигенной патологией и занимает лидирующее место в структуре заболеваемости и смертности людей наиболее работоспособного возраста (Беркович О.А., 2002; Оганов Р.Г., 2012). Совершенствование алгоритмов ранней диагностики ИБС, выявление групп высокого риска позволяет наиболее эффективно воздействовать на модифицируемые факторы риска атеросклероза. К последним относятся артериальная гипертензия, нарушения липидного, углеводного метаболизма, медиаторы иммунного воспаления сосудистой стенки. Трансляционная активность генных сетей, ассоциированных с вышеуказанными звеньями патогенеза атеросклероза, регулируется системой ядерных рецепторов.
Рецептор витамина D (VDR) и рецептор активатора пролиферации
пероксисом-альфа (PPAR-alpha) относятся к суперсемейству ядерных
рецепторов и регулируют транскрипционную активность более
200 таргентных генов. Эти рецепторы имеют сходную доменную
структуру, механизмы активации и молекулярно-биологические эффекты
влияния на различные механизмы атерогенеза (Norman P.E., 2014).
В частности, как VDR, так и PPAR-alpha регулируют рост адипоцитов и
сотни других белков, которые участвуют в метаболизме (Vernochet, C.,
2009) и патогенезе иммунного воспаления (Delerive P., 2002;
Esposito E., 2012). В ряде исследований установлено, что активация VDR
снижает экспрессию тканевого фактора (Schmidt N. et al., 2012).
Подобным эффектом, направленным на подавление экспрессии тканевого
фактора, обладают и PPAR-alpha (Marx N., 2001). В ряде исследований
установлено, что активация VDR снижает экспрессию тканевого фактора
(Schmidt N. et al., 2012). Подобным эффектом, направленным на
подавление экспрессии тканевого фактора, обладают и PPAR-alpha (Marx
N., 2001). I. Kuipers и соавторы в 2008 году получили данные, что как
VDR, так и PPAR-alpha являются важными посредниками в регуляции
транскрипции ренина, действуют через специфические элементы в
промоторе ренина. Таким образом, PPAR-alpha и VDR обладают целым
рядом общих молекулярно-биологических механизмов действия,
имеющих отношение к патогенезу атеросклероза
Помимо генетических аспектов рассматриваются новые маркеры и медиаторы ССЗ. В последние годы дефицит витамина D рассматривается как один из новых факторов риска ишемической болезни сердца (Gouni-Berthold I. et al., 2009; Meems L.M. et al., 2011).
Таким образом, выявление новых молекулярных предикторов риска развития ИБС позволяет разрабатывать алгоритмы персонализированной первичной и вторичной профилактики этой многофакторной патологии.
Степень разработанности темы исследования. Данные о
взаимосвязи полиморфизма L162V гена PPAR-alpha и FokI, TaqI
полиморфизмов гена VDR с различными манифестациями атеросклероза
противоречивы. Так, по данным A. и соавторов (2014 год)
носительство генотипов FokI полиморфизма гена VDR не оказывало
значимого влияния на тяжесть атеросклеротического поражения
коронарных артерий. Однако в экспериментальной работе на
трансфицированных эндотелиальных клетках человека показано, что короткий белок рецептора витамина D в 1,7 раза более активен, чем длинный. В проспективном исследовании Northwick Park Heart Survey была установлена связь полиморфизма L162V гена PPAR-alpha с тенденцией к раннему развитию ишемической болезни сердца и прогрессированию коронарного атеросклероза (Flavell D.M., 2002).
Витамин D оказывает плейотропное влияние на процесс атерогенеза. В исследованиях на культурах эндотелиальных клеток установлено, что витамин D стимулирует продукцию оксида азота эндотелиоцитами (Queen L.R. et al., 2006; Molinari C. et al., 2011). Было установлено, что кальцитриол снижает экспрессию циклооксигеназы-2 и продукцию провоспалительных цитокинов эндотелиоцитами (Krishnan A.V. et al., 2010). Данные о роли витамина D в кальцификации сосудистой стенки носят противоречивый характер. С одной стороны, показано, что витамин D стимулирует поступление кальция в гладкомышечные клетки и способствует остеохондрогенезу и минерализации сосудистой стенки (Shalhoub V. et al., 2010). С другой стороны, в ряде экспериментальных исследований был установлен протективный эффект кальцитриола в отношении кальцификации сосудистой стенки (Zittermann A. et al., 2007).
Полиморфизм генов этих ядерных рецепторов и их ассоциация с
особенностями клинического течения ишемической болезни сердца в
Северо-Западном регионе Российской Федерации изучены недостаточно,
что и стало предметом настоящего исследования. Также недостаточно
изучена обеспеченность витамином D и её взаимосвязь с
распространённостью коронарного атеросклероза у больных ишемической болезнью сердца в Северо-Западном регионе Российской Федерации, поэтому изучение уровня витамина D, а также медиаторов иммунного воспаления у больных ИБС было одной из задач данной работы.
Цель исследования
Изучить особенности клинического течения ишемической болезни сердца, ремоделирование сердца и характер атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI, TaqI полиморфизм) и L162L, L162V, V162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа.
Задачи исследования:
-
Определить и сопоставить распределение FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов и встречаемость аллелей гена рецептора витамина D (FokI, TaqI полиморфизм) и L162V, L162L, V162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных сопоставимого возраста без заболеваний сердечно-сосудистой системы.
-
Изучить особенности клинического течения ишемической болезни сердца у носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI , TaqI полиморфизм) и L162V, L162L, V162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа.
-
Оценить ремоделирование левого желудочка и характер атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI, TaqI полиморфизм) и L162V, L162L, V162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа.
-
Изучить и сопоставить уровни 25-гидроксивитамина D, интерлейкина-8, интерлейкина-10 и С-реактивного белка сыворотки крови у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI, TaqI полиморфизм) и L162V, L162L, V162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа.
-
На основании результатов клинико-генетического исследования выявить группы повышенного риска раннего развития ишемической болезни сердца.
Научная новизна
В работе получены новые научные данные о большей
встречаемости f аллеля (FokI полиморфизм) гена рецептора витамина D у больных ишемической болезнью сердца, чем у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы. Установлено, что f аллель
вышеуказанного полиморфизма ассоциируется с дебютом ишемической болезни сердца в форме инфаркта миокарда и с развитием Q-инфаркта миокарда.
Выявлено, что t аллель (TaqI полиморфизм) гена рецептора витамина D у больных ишемической болезнью сердца встречался чаще, чем в группе сравнения. t аллель вышеуказанного полиморфизма ассоциирован с дебютом заболевания в возрасте до 55 лет включительно.
Установлено, что у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162V генотипа гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа, перенесших инфаркт миокарда, развивается более выраженное ремоделирование левого желудочка, чем у носителей L162L генотипа данного гена.
В настоящей работе впервые получены данные о том, что для
больных ишемической болезнью сердца – жителей Северо-Западного
региона РФ характерен дефицит или недостаточность витамина D
сыворотки крови. Уровень 25-гидроксивитамина D у больных
ишемической болезнью сердца ниже, чем у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы. Минимальные значения 25-гидроксивитамина D в сыворотке крови регистрировались у больных ишемической болезнью сердца с трехсосудистым атеросклеротическим поражением коронарных артерий.
Практическая значимость работы
В ходе настоящего исследования установлено, что у больных ишемической болезнью сердца в Северо-Западном регионе Российской Федерации обеспеченность витамином D низкая и ассоциирована со степенью распространённости коронарного атеросклероза, что имеет практическое значение для разработки дифференцированных алгоритмов первичной и вторичной профилактики заболевания. Выявлено, что носительство f аллеля гена рецептора витамина D (FokI полиморфизм) ассоциировано с дебютом ишемической болезни сердца в форме инфаркта миокарда. У больных ишемической болезнью сердца, перенесших инфаркт миокарда, – носителей L162V генотипа гена PPAR-alpha более выражено ремоделирование левого желудочка, чем у носителей L162L генотипа данного гена.
Основные положения, выносимые на защиту
У больных ишемической болезнью сердца встречаемость f аллеля и t аллеля (FokI, TaqI полиморфизм) гена рецептора витамина D выше, чем у обследованных сопоставимого возраста без заболеваний сердечнососудистой системы. Однако носительство данных аллелей не повышает риск развития ишемической болезни сердца. Встречаемость L162L
и L162V аллелей гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа значимо не различается у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных сопоставимого возраста без заболеваний сердечнососудистой системы.
Носительство f аллеля (FokI полиморфизм) гена рецептора витамина D повышает риск дебюта заболевания с инфаркта миокарда, а носительство t аллеля (TaqI полиморфизм) гена рецептора витамина D ассоциировано с развитием ишемической болезни сердца в возрасте до 55 лет включительно.
У больных ишемической болезнью сердца, перенесших инфаркт
миокарда, – носителей L162V генотипа гена рецептора активатора
пролиферации пероксисом-альфа развивается более выраженное
ремоделирование левого желудочка, чем у носителей L162L генотипа.
Обеспеченность витамином D у больных ишемической болезнью сердца существенно ниже, чем у обследованных сопоставимого возраста без заболеваний сердечно-сосудистой системы независимо от генотипа гена рецептора витамина D (FokI и TaqI полиморфизм) и максимально снижена у пациентов с трехсосудистым стенозом коронарных артерий.
Личный вклад автора в проведенное исследование
Автор принимал личное участие в комплексном клинико-
инструментальном обследовании больных, заготовке образов плазмы
крови для иммуноферментного анализа, выделял ДНК. Автор разработал
анкеты и составил базу данных, проводил статистическую обработку
результатов. Автор самостоятельно проводил анализ литературы по теме
диссертационной работы, писал главы диссертации. Результаты
настоящей работы отражены в публикациях, в которых личный вклад автора составляет 75%.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Результаты работы доложены в форме докладов на Всероссийской
научно-практической конференции «Молекулярные основы клинической
медицины – возможное и реальное» в 2012 году; на Всероссийской
научно-практической конференции с международным участием
«Трансляционные исследования в инновационном развитии здравоохра
нения» в 2014 году; на научно-практической конференции с
международным участием «Диагностика и лечение ишемической болезни
сердца: от В.И. Колесова до наших дней» в 2014 году; на 82-м конгрессе
Европейского общества по изучению атеросклероза (Мадрид, 2014);
на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные
основы клинической медицины – возможное и реальное» в 2015 году;
на II научно-практической международной конференции «Современные биотехнологии для науки и техники» в 2015 году.
Имеется 11 публикаций, 3 из которых в рецензируемых журналах.
Высокая достоверность исследований обеспечивается достаточным объемом фактического материала (422 обследованных), использованием комплекса современных методов исследований и статистической обработки данных в соответствии с поставленными задачами.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в лекционный материал и учебный процесс кафедры факультетской терапии ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России.
Структура и объем диссертации
Текст диссертации изложен на 151 странице, содержит 48 таблиц и
10 рисунков. Структура диссертации представлена введением, обзором
литературы, 5 главами результатов собственного исследования,
заключением, выводами, практическими рекомендациями. Список
литературы насчитывает 258 публикаций, в том числе 28 отечественных и 230 иностранных.
Общность молекулярно-биологических эффектов рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа и рецептора витамина D
Витамин D оказывает плейотропное влияние на процесс атерогенеза. Известно, что дисфункция эндотелия начинается на ранних этапах атеросклеротических изменений сосудистой стенки. В исследованиях на культурах эндотелиальных клеток установлено, что витамин D стимулирует продукцию оксида азота эндотелиоцитами [84, 156], а также предохраняет их от оксидантного стресса [169]. Кроме того, витамин D регулирует высвобождение вазоконстрикторных метаболитов арахидоновой кислоты в сосудистой стенке [227]. Было установлено, что кальцитриол (1,25(OH)2D3) снижает экспрессию циклооксигеназы-2 и продукцию провоспалительных цитокинов эндотелиоцитами [143]. В исследованиях на культурах эндотелиальных клеток O. Equils и соавторы в 2006 году установили, что кальцитриол ингибировал продукцию ИЛ-6, ИЛ-8, причём этот эффект был опосредован через систему ядерного фактора каппа-бета. Авторы сделали вывод, что кальцитриол аутокринным/паракринным путём блокировал иммунное воспаление [81]. В ряде исследований было установлено, что эндотелиоциты содержат фермент 1-альфа-гидроксилазу и сами могут синтезировать кальцитриол [126]. Y. Talmor и сотрудники установили, что кальцитриол подавляет экспрессию адгезивных молекул и интерлейкина-6 эндотелиоцитами. На фоне терапии 1,25(OH)2D3 в коронарных артериях человека снижалась экспрессия Е-селектина, межклеточной молекулы сосудистой адгезии 1 типа и ИЛ-8 [63, 64].
В исследованиях последних лет установлено, что витамин D влияет на некоторые механизмы стабилизации атеросклеротической бляшки. Известно, что ангиогенез предрасполагает к разрыву нестабильной атеросклеротической бляшки. D.J. Mantell и соавторы установили, что витамин D ингибирует продукцию сосудистого эндотелиального фактора роста, рост эндотелия и ангиогенез [29]. В экспериментальных работах на культурах эндотелиоцитов показано, что кальцитриол ингибирует экспрессию матриксной металлопротеиназы 1 типа, продукцию адгезивной молекулы тромбоцитов (CD62p) [85]. Таким образом, кальцитриол способствует стабилизации атеросклеротической бляшки, снижению риска внутрисосудистого тромбоза. В ряде клинических исследований было установлено, что достаточная обеспеченность организма витамином D способствует улучшению функционального состояния эндотелия [101, 118, 250]. Известно, что синтез провоспалительных цитокинов эндотелиоцитами и гладкомышечными клетками опосредуется через систему ядерного фактора каппа-бета. K.L. Jablonski и соавторы в 2011 году установили, что у пациентов с дефицитом 25(OH)D3 была выше экспрессия ядерного фактора каппа-бета на поверхности эндотелиоцитов сосудов по сравнению с группой больных с достаточной обеспеченностью 25(OH)D3 [118].
Гладкомышечные клетки также содержат фермент 1-альфа-гидроксилазу и имеют рецептор к витамину D. Установлено, что кальцитриол ингибирует пролиферативный эффект эпидермального фактора роста и эндотелина в отношении гладкомышечных клеток [70, 82]. Это может способствовать замедлению роста атеросклеротической бляшки. В физиологических дозах кальцитриол и 25(OH)D3 ингибируют миграцию гладкомышечных клеток [104], усиливают продукцию ими простациклина [249].
Известно, что прогрессирование атеросклероза сопровождается кальцификацией сосудистой стенки. Гладкомышечные клетки сосудов способны к остеогенной трансформации и продукции остеоидоподобного внеклеточного матрикса, способствующего кальцификации сосудистой стенки [206]. Степень кальцификации коронарных артерий имеет прогностическое значение [204]. В гладкомышечных клетках коронарных артерий был обнаружен целый ряд белков, вовлечённых в остеогенез: остеопонтин, фетуин-А, остеопрогерин [125]. Данные о роли витамина D в кальцификации сосудистой стенки носят противоречивый характер.
С одной стороны, показано, что витамин D стимулирует поступление кальция в гладкомышечные клетки и способствует остеохондрогенезу и минерализации сосудистой стенки [71].
С другой стороны, в ряде экспериментальных исследований был установлен протективный эффект кальцитриола в отношении кальцификации сосудистой стенки [257]. Особенно этот эффект был выражен в исследовании на экспериментальной модели сахарного диабета [238].
Клинические исследования также показали как прямую, так и обратную связь между степенью обеспеченности витамином D и выраженностью кальцификации сосудистой стенки. У больных с хронической болезнью почек выявлена обратная взаимосвязь между концентрацией кальцитриола плазмы крови и степенью кальцификации сосудистой стенки [33, 52, 107]. Однако в работах других авторов у этой же категории больных установлена положительная корреляция между уровнем кальцитриола плазмы крови и кальцификацией сосудов [122, 125, 187].
M. Hewison в своём обзоре отмечает, что 1,25(OH)2D3 восстанавливает баланс в системе про- и противовоспалительных цитокинов. Снижается активность Т-хелперов 1 типа, которые продуцируют провоспалительные цитокины (интерферон-гамма, ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-12), и повышается активность Т-хелперов 2 типа и экспрессия противовоспалительных цитокинов (ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13) [122].
Недостаточно изучены механизмы влияния витамина D на липидный метаболизм. E. Zoico и соавторы в 2014 году установили, что содержание 25(OH)D3 в плазме крови имело положительную корреляционную связь с концентрацией липопротеинлипазы. Этот факт объясняет выявленную авторами обратную корреляцию между уровнем триглицеридов и концентрацией 25(OH)D3 в плазме крови [176]. Таким образом, витамин D оказывает многочисленные плейотропные эффекты как на ранних, так и на поздних стадиях развития атеросклероза.
Лабораторно-биохимическое обследование
Для определения уровня 25-гидроксивитамина D, интерлейкина-8, интерлейкина-10, СРБ забор крови больным проводился натощак из локтевой вены. Образцы центрифугировали в течение 20 минут при 1 500 об/мин. Полученную сыворотку хранили в замороженном виде в пробирках при температуре -25 С не более месяца. Для проведения иммуноферментного анализа сыворотки быстро размораживали посредством тепловой обработки на водяной бане при температуре 37 С.
Определение уровня 25(ОН)D в сыворотке крови проводилось при помощи иммуноферментного метода с использованием анализатора ImmunoChem-2100 и коммерческих реактивов (25(ОН)D ids). Согласно большинству рекомендаций значения 25(ОН)D в сыворотке крови, равные или превышающие 75 нмоль/л, принимали за достаточную обеспеченность витамином D [124]. Значения в диапазоне 50-75 нмоль/л рассматривали как недостаточную обеспеченность, а значения ниже 50 нмоль/л расценивали как дефицит. Набор для твердофазового иммуноферментного анализа 25(ОН)D предназначен для количественного определения витамина D в сыворотке крови in vitro. В наборе используются стрипы, разделенные на отдельные лунки, с иммобилизованными моноклональными антителами к 25(ОН)D. На первой стадии в лунках инкубировали калибраторы и исследуемые образцы, разведенные с 25(ОН)D, меченым биотином в течение 2 часов при температуре 18-25 С. За время инкубации определенное количество 25(ОН)D в сыворотке пациента и известное количество меченного биотином витамина конкурируют за участки связывания с фиксированными антителами. Не связавшийся 25(ОН)D удаляли 300 л промывного раствора, данная процедура проводилась трижды. Для выявления связавшегося меченного биотином 25(ОН)D проводили вторую инкубацию в течение 30 мин при температуре 18-25 С, используя 200 л стрептавидина, меченного пероксидазой. Затем повторяли промывку. Связавшаяся пероксидаза вызывает цветное окрашивание во время третьей инкубации с субстратом тетраметилбензидином (200 л) в течение 30 мин при той же температуре. Результаты интерпретировали с помощью стандартной калибровочной кривой.
Определение ИЛ-8 и ИЛ-10 осуществлялось этим же методом («сэндвич» вариант твердофазного иммуноферментного анализа) с учетом рекомендаций, предложенных фирмой-производителем. СРБ определяли методом иммунотурбидиметрии на приборе СА-90 фирмы FURUNO (Япония) с использованием реактивов фирмы «Витал».
Инструментальное обследование пациентов включало артериального давления, регистрацию электрокардиограммы 12 стандартных отведениях, эхокардиографию (ЭхоКГ), мониторирование по Холтеру, коронароангиографию по показаниям. Эхокардиография (ЭхоКГ) проводилась на аппарате «Vivid-5» производства фирмы General Electric. Исследование проводили в М-модальном режиме и в режиме секторального сканирования в стандартных эхокардиографических позициях.
Оценивали конечно-диастолический размер межжелудочковой перегородки (КДРМЖП) и задней стенки левого желудочка (КДРЗС ЛЖ), конечно-диастолический размер левого желудочка (КДР ЛЖ). Массу миокарда левого желудочка (ММ ЛЖ) вычисляли по формуле R.B. Devereux (1986). Индекс массы миокарда левого желудочка (ИММ ЛЖ) оценивали как отношение ММЛЖ к площади поверхности тела пациента. Признаком гипертрофии левого желудочка считали ИММЛЖ 125 г/м2 у мужчин и 110 г/м2 у женщин по данным G. Mancia и соавторов (2007).
Был проведен анализ данных коронарографии (КАГ). КАГ выполнялась больным ИБС с дифференциально-диагностической целью. Процедуру проводили по методике M. Judkins и соавторов (1968) феморальным доступом. Использовались диагностические катетеры 7F (USCI, Cordis). Контрастное вещество (омнипак) вводили болюсно от руки в количестве 5-10 мл на каждую инъекцию. Съемка коронарных артерий шла с частотой 25 кадров/секунду. Использовалась дигитальная установка HICOR (фирма «Siemens»). При визуальном контроле оценивали коронарные артерии и их ветви, тип кровоснабжения, число пораженных сосудов, локализацию основного поражения (проксимальная или дистальная).
В каждой возрастной подгруппе больных ИБС оценивалось количество пораженных сосудов (учитывался стеноз более 50%), тип кровоснабжения, уровень поражения передней межжелудочковой ветви левой коронарной артерии и правой коронарной артерии. Анализ данных коронарографии не выявил значимых различий по количеству пораженных сосудов, типу кровоснабжения, локализации поражения ПМЖВ и ПКА в разных возрастных группах больных (p 0,05, таблицы 4-7). Таблица 4 – Характер поражения коронарных сосудов у пациентов с ишемической болезнью сердца в разных возрастных группах
Группы больных ИБС Проксимальное поражение Дистальное поражение p лет (n=15) 7 (46%) 8 (54%) p 0,05 50-59 лет (n=27) 11 (41%) 16 (59%) Старше 60 лет (n=47) 13 (28%) 34 (72%) Примечание – p – доверительный уровень вероятности точного критерия Фишера при сравнении групп больных ИБС разного возраста по уровню поражения ПКА. 2.7 Методы статистической обработки полученных результатов
Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff и ff генотипов гена рецептора витамина D
PPAR-alpha так же, как и рецептор витамина D, относятся к семейству ядерных рецепторов. PPAR-alpha оказывают многоуровневое влияние на обмен липидов, иммунное воспаление и функцию эндотелия. Известно, что полиморфизм L162V ассоциирован с более ранним развитием ИБС и ангиографически верифицированным атеросклерозом [211]. Следующим этапом настоящей работы был анализ традиционных факторов риска, особенностей клинического течения заболевания и особенностей поражения коронарных артерий.
У 303 (279 мужчин и 24 женщин) больных ИБС был определен полиморфизм PPAR-alpha. L162L генотип был выявлен у 268 обследованных, L162V генотип – у 35 обследованных, V162V генотип выявлен не был. Средний возраст в данной группе составил 60,5±0,58 лет. Средний возраст развития ИБС был 55,5±0,52 года. ИМ перенесли 210 (69%) человек, средний возраст развития ИМ – 55,9±0,65 лет.
Распределение L162L и L162V генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы
Распределение L162L и L162V генотипов гена PPAR-alpha и встречаемость L162 и V162 аллелей значимо не различалось (p 0,05, таблица 26). Распределение генотипов в группе больных ИБС было следующим: L162L – 268 из 303 (88,4%), L162V – 35 из 303 (11,6%). У обследованных без заболеваний ССС распределение генотипов было следующим: L162L – 95 из 112 (93%), L162V – 7 из 112 (7%).
Распределение L162L и L162V генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью сердца и у обследованных без заболеваний сердечно-сосудистой системы
Традиционные факторы риска у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162L и L162V генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа Одним из важных критериев оценки возможного риска развития ССЗ является отягощенная наследственность. Анализ распределения L162V и L162L генотипов и встречаемости L162 и V162 аллелей гена PPAR-alpha у больных ИБС с отягощенной наследственностью и у больных с неотягощенной наследственностью значимых различий не выявил (p 0,05, таблица 27). Распределение L162V и L162L генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена PPAR-alpha у больных ИБС с наличием и отсутствием традиционных факторов риска значимо не различалось (p 0,05).
Распределение L162L и L162V генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа у больных ишемической болезнью с отягощенной и неотягощенной наследственностью
Группы больных ИБС Генотип гена PPAR-alpha Встречаемость аллеля L162L LI 62V LI 62 V162 Отягощеннаянаследственность(n=133) 124 (94%) 9 (6%) 257 (0,97) 9 (0,03) Неотягощеннаянаследственность(n=270) 244 (90,4%) 26 (9,6%) 501 (0,97) 13 (0,03) p 0,3 0,65 Примечание – p – доверительный уровень вероятности при проверке однородности распределения генотипов и встречаемости аллелей при сравнении группы больных ИБС с отягощенной и неотягощенной наследственностью. Распределение L162L и L162V генотипов и встречаемость L162 и V162 аллелей гена PPAR-alpha у больных ишемической болезнью сердца с абдоминальным ожирением и без него значимо не различалось (p 0,05).
Анализ показателей липидного спектра сыворотки крови (ОХ, ТГ, ЛПНП, ЛПВП) у больных ишемической болезнью сердца – носителей различных генотипов PPAR-alpha не выявил значимых различий (p 0,05, таблица 28).
Особенности клинического течения заболевания у больных ишемической болезнью сердца – носителей L162V и L162L генотипов гена рецептора активатора пролиферации пероксисом-альфа Больные ИБС были разделены на 2 подгруппы с развитием заболевания до 55 лет и после 55 лет. Распределение генотипов в подгруппе больных с дебютом заболевания до 55 лет было следующим: L162L генотип – 127 из 149 (85%), L162V – 22 из 149 (25%) (OR=1,82 (0,883,77)). А в подгруппе больных ИБС с развитием заболевания после 55 лет L162L встречался у 137 из 150 (91%), а L162V встречался у 13 из 150 (9%) больных. Различие при таком распределении значимо (p=0,037, таблица 29). Встречаемость L162 аллеля в подгруппе с развитием ИБС до 55 лет была 0,93, V162 аллеля – 0,07 (OR=1,75 (0,863,56)). Встречаемость аллелей в подгруппе с развитием заболевания после 55 лет была следующей: L162 – 0,96, V162 – 0,04. Различие значимо (p=0,039, таблица 29). Таким образом, носительство L162V генотипа и V162 аллеля ассоциировано с ранним дебютом ИБС до 55 лет.
Дефицит и недостаточность витамина D у больных ишемической болезнью сердца – носителей FF, Ff, ff и TT, Tt, tt генотипов гена рецептора витамина D (FokI и TaqI полиморфизм)
Анализ традиционных факторов риска развития ИБС не выявил значимых различий в распределении FF, Ff и ff генотипов гена VDR у больных ИБС с отягощенной и неотягощенной наследственностью, наличием или отсутствием традиционных факторов риска. Однако в работе N. Swapna и соавторов (2011) носительство FF генотипа и F аллель являлись высоким риском в плане развития эссенциальной гипертензии для обоих полов, в подгруппах с отягощенной наследственностью и среди курящих [188]. В исследовании О.А. Обуховой у больных ишемическим атеротромботическим инсультом распределение трех аллельных вариантов FokI полиморфизма не отличалось у пациентов с артериальной гипертензией и у лиц с нормальным АД, так же как и в контрольной группе. Хотя у больных ишемическим атеротромботическим инсультом с нормальным и повышенным артериальным давлением вариант генотипа FokI полиморфизма гена VDR практически не влиял на склонность к развитию инсульта [16]. В клинической работе В.Ю. Гарбузова в 2013 году оценивала факторы риска развития ОКС у больных ИБС, носителей различных генотипов FokI полиморфизма. По данным автора, не было выявлено связи между данным полиморфизмом у пациентов с ОКС и ГБ. Больший риск развития ОКС имели носители FF генотипа с ИМТ25 кг/м2, чем гомозиготы с нормальным ИМТ. А также носители Ff и ff генотипа, которые курили, чем некурящие [7].
В доступной литературе имеются противоречивые данные о возможной связи изучаемых генотипов и антропометрических показателей. По данным настоящей работы распределение FF, Ff и ff генотипов по антропометрическим критериям у больных ИБС значимо различалось. Распределение генотипов FF, Ff, ff в подгруппе больных ИБС без абдоминального ожирения было следующим: FF – 15 из 39 (40%), Ff – 12 из 39 (30%), ff – 12 из 39 (30%). А в подгруппе с абдоминальным ожирением распределение генотипов было следующим: FF – 38 из 147 (26%) (OR=0,51 (0,261,15)), Ff – 79 из 147 (54%) (p=0,035; OR=2,6 (1,235,55), p=0,01), ff – 30 из 147 (20%) (OR=0,57 (0,261,87)). Носительство Ff генотипа увеличивает риск развития абдоминального ожирения в 2,6 раза.
Напротив, по данным L. Laczmanski и соавторов (2013) не было получено значимых различий в распределении генотипов FokI полиморфизма как у мужчин, так и у женщин по антропометрическим и биохимическим параметрам. Исследование проводилось среди лиц старше 65 лет [243]. В клиническом исследовании А.И. Козлова и соавторов (2013) FF генотип был ассоциирован с большим индексом массы тела, чем Ff генотип. Авторы анализировали связь обеспеченности витамином D, полиморфизмов гена VDR с антропометрическими особенностями среди молодых людей – жителей республики Коми. Выявленные особенности авторы связывают именно с тем, что включенные в исследование лица находились в периоде ростового скачка с последующей за ним стабилизацией размеров тела [2]. Y. Zhao (2014) в северной части Китая обследовали 391 пациента с метаболическим синдромом; контрольную группу составили 400 практически здоровых человека. По данным авторов, FF генотип FokI полиморфизма коррелировал с более низким индексом массы тела среди больных с метаболическим синдромом [48].
В настоящей работе не было выявлено связи между генотипами FokI полиморфизма гена VDR и показателями липидного спектра. Это совпадает с данными L. Laczmanski и соавторов (2013) [243]. Однако в клиническом исследовании с участием больных с СД 2 типа A.M. Mackawy и соавторы (2014) выявили связь FokI полиморфизма гена VDR с липидным профилем, уровнем витамина D. Данная особенность была характерна только для больных с сахарным диабетом 2 типа без метаболического синдрома [153]. В азиатской популяции (Индия) в работе P. Prabhakar и соавторов (2015) также была выявлена ассоциация генотипов FokI полиморфизма и показателями липидного спектра. У носителей ff генотипа FokI полиморфизма гена VDR уровень общего холестерина был выше, чем у носителей FF генотипа (p=0,04) [112]. Отсутствие связи генотипов FokI полиморфизма гена VDR в настоящем исследовании может быть обусловлено терапией основного заболевания. Большинство больных ИБС находилось на гиполипидемической терапии статинами.
В доступной литературе практически не встречалось исследований по ассоциации аллельных вариантов TaqI полиморфизма с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. В единичных работах анализировалась связь Bat/baT гаплотипов BsmI, ApaI и TaqI полиморфизмов гена рецептора витамина D. Так D.A. Ferrarezi и соавторы (2013) выявили, что гаплотип bAt был связан с повышенным риском ИБС у больных сахарным диабетом 2 типа (DIABHYCAR), независимо от воздействия других факторов сердечно-сосудистого риска [36]. В настоящей работе не было выявлено значимых различий в распределении генотипов данного полиморфизма у больных и обследованных без заболевания ССС. Тем не менее, у обследованных больных ИБС встречаемость T аллеля была 0,62 (OR=0,78 (0,551,09)), t аллеля – 0,38 (OR=1,28(0,911,8). В группе сравнения встречаемость T аллеля – 0,68, t аллеля – 0,32. Данное различие было значимым (p=0,02). Таким образом, t аллель чаще встречался в группе больных ИБС, чем в группе сравнения. Анализ традиционных факторов риска не выявил значимых различий в распределении генотипов между подгруппами больных ИБС с наличием и отсутствием традиционных факторов риска. Следует отметить, что в подгруппе больных с отягощенной наследственностью частота встречаемости T аллеля была 0,58, t аллеля – 0,42. Встречаемость T аллеля в подгруппе больных с неотягощенной наследственностью была – 0,65; t аллеля – 0,35 (p=0,03). Таким образом, встречаемость t аллеля была выше в подгруппе больных ИБС с отягощенной наследственностью.