Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Полиморфноядерные лейкоциты (ПМЛ) являются жизненно важным компонентом системы неспецифической клеточной резистентности организма к бактериальной инфекции (Weissman I.I., Cooper M.D., 1993; Paul W.E., 1993). Под влиянием тканевого повреждения происходит формирование очага нейтрофильной инфильтрации, являющегося квинтэссенцией острого воспалеїшя (Мечников И.И., 1898). Элиминация агента, вызвавшего острое воспаление, осуществляется, главным образом, нейтрофилами (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Помимо миграции в очаги патологии, имеет место постоянный выход нейтрофилов из кровеносного русла в ткани и на поверхность слизистых (Murphy Р., 1976). Такая естественная миграция нейтрофилов обеспечивает, вместе с другими системами, предотвращение бактериальной инвазии в экстравазальные ткани. Как физиологический, так и патологический выход ПМЛ из кровеносного русла обязательно требует адгезии ПМЛ на эндотелиоцитах и компонентах тканевого матрикса. Наряду с ключевой ролью в инициации острого воспаления, адгезия ПМЛ имеет весьма важное значение в его разрешении, поскольку элиминация патогена часто осуществляется путем фагоцитоза, требующего адгезивного контакта с мишенью, или под действием деструктивных субстанций ПМЛ, секретируемых последними в состоянии сцепления с субстратом в очаге воспаления. Недавно был вскрыт еще один существенный механизм, действующий в периоде угасания острого воспаления и также зависимый от адгезивных реакций ПМЛ - фагоцитоз апоптозных нейтрофилов макрофагами (Savill J.C. et al., 1989). При этом варианте элиминация "излишка" ПМЛ не сопровождается освобождением деструктивных компонентов нейтрофильных гранул в окружающую среду. Благодаря этому обеспечивается ускорение репарации и минимизация субститущш пораженных тканей.
Учитывая сказанное выше, нетрудно понять интенсивность, с которой в настоящее время изучаются адгезивные реакции ПМЛ. Несмотря на огромный объем информации, накопленный в результате этих исследований, ряд важных аспектов адгезии ПМЛ не получил освещение в литературе.
Прежде всего, обращает на себя внимание тот факт, что в большинстве работ изучается только начальная стадия адгезии, максимум до 60й мин пребывания клеток на субстрате. Между тем, логика процесса говорит о том, что с течением времени количество клеток, прикрепленных к адгезивной поверхности, должно снижаться. Изучение адгезии ПМЛ на IgG-сефарозе и СЗЬ-сефадексе в нашей лаборатории показали, что данный феномен действительно имеет место (Чеботарь И.В., Коныншша Т.М., 1989). При этом ЛДГ (как маркер разрушения клеток) в среде инкубации не обнаруживалась. Это могло говорить либо о десорбции клеток с сохранением целостности цитоплазматической мембраны, либо об инактивации ЛДГ в супернатанте и/или присутствии ее в среде в недоступной для индикации активности форме (например, в микровезикулах) после разрушения адгезированных ПМЛ. Очевидно, что обнаружение свидетельств в пользу какого-либо варианта и его дальнейшее изучение способствовало бы лучшему пониманию регуляции дашамики острого воспаления и могло открыть новые подходы к его фармакологической коррекции.
Следующим неясным аспектом является возможная гетерогенность популяции нейтрофилов в реакциях IgG-опосредованной адгезии. Известно, что нейтрофилы физически (центриф>тированием) могут быть разделены на две субпопуляции, которые существенно отличаются друг от друга по способности образовывать розетки с эритроцитами, покрытыми IgG (Klempner M.S., Gallin J.I., 1978). О каких-либо проявлениях подобной гетерогенности ПМЛ при адгезии к IgG-покрьгтой поверхности ничего неизвестно, однако, некоторые особенности показателей прикрепления ПМЛ к IgG-субстратам могут быть интерпретированы с этих позиций (Чеботарь И.В., 1989).
Наконец, не охарактеризовано изменение
реактивности ПМЛ, адгезированных на различных субстратах
по отношению к стимулам, действующим через рецепторы,
аналогичные таковым для лигандов субстрата. Такая ситуация
вполне реальна in vivo: при некоторых видах
иммунокомплексной патологии происходит отложение ИК на мембранах альвеол (экзогенный аллергический альвеолит) и клубочков почек (иммунокомплексный гломерулонефрит) (Roitt I., 1996). Последующая аккумуляция ПМЛ на мембранах, обусловлешіая взаимодействием фиксированных иммунных комплексов с рецепторами ПМЛ (адгезия через Fey и/или СЗЬ рецепторы), детерминирует повреждение мембран продуктами секреции адгезированных ПМЛ. Нередкое присоединение вторичной инфекции приводит к ситуации, когда ПМЛ, прикрепленные к субстрату посредством Fey и/или СЗЬ рецепторов, подвергаются дополнительной стимуляции через аналогичные рецепторы бактериями, опсонизированными комплементом и/или антителами (гомологичная рестимуляция). Определение характера изменения реактивности ПМЛ при данных обстоятельствах означало бы прояснение важного момента в патогенезе указанных процессов.
Изучеіше феноменологии, механизмов и
функциональных последствий адгезии ПМЛ к IgG. Изучение функциональных последствий адгезии ПМЛ к коллагену, СЗЬ и DEAE-сефадексу..
1. Определить механизм снижения количества
нейтрофилов, адгезированных на IgG-поверхности in vitro, с
течением времени.
2. Изучить возможную гетерогенность нейтрофилов в
реакциях IgG-зависимой адгезии.
3. Охарактеризовать изменения функционально-
морфологического статуса ПМЛ и состояния адгезивной
поверхности после продолжительного контакта на модели
IgG-зависимой адгезии.
4. Изучить кислородзависимую реактивность
нейтрофилов, адгезированных на рецепторзависимых и рецепторнезависимом сорбентах, к различньм стимулам. НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые подробно изучены механизмы десорбции нейтрофилов с IgG-субстратов. Доказано отсутствие гетерогенности ПМЛ в реакциях IgG-зависимой адгезии и участие первоначально не адгезировавшихся клеток в замедлении кинетики десорбции. Обнаружен феномен снижения сорбционной емкости IgG-покрытой поверхности при длительном физическом контакте с нейтрофилами и вскрыт его механизм - селективное связывание компонентов мембранных протеинов ПМЛ с поверхностью. Описаны изменения функционально-морфологического статуса нейтрофилов после естественной десорбции с IgG-покрыгых поверхностей: апоптозные изменения в значительной части клеточной популяции, снижение мембранной экспрессии FcyRII и FcyRIII.
Изучено изменение статуса реактивности ПМЛ, находящихся в состоянии рецепторзависимой и рецепторнезависимой адгезии, к гомологичным и гетерологичным рецепторзависимым стимулам.
В ходе исследования получена новая информация о механизмах и феноменах адгезии фагоцитов в патологии. Изучение гетерогенности нейтрофилов в реакциях IgG-зависимой адгезии, а также постдесорбционных изменений ПМЛ и адгезивной поверхности позволяет существенно расширить представления о регуляции воспалительной реакции. Обнаруженные in vitro феномены (пролонгирующий эффект первоначально неадгезированных нейтрофилов на IgG-зависимую адгезию популяции этих клеток, снижение сорбционной емкости рецепторзависимых субстратов, селективное связывание мембранных протеинов с IgG-покрытой поверхностью, апоптозные изменения ПМЛ при адгезии, угнетение реактивности адгезированных ПМЛ к гомологичной рестимуляции) могут во многом детерминировать характер иммунокомгшексного воспаления
на биомембранах (аллергический альвеолит, ИК-гломерулонефрит). Полученная нами шіформация будет полезна при разработке новых методов и препаратов для коррекции данных патологических состояний.
-
Уменьшение количества адгезированных ПМЛ на поверхностях, покрытых IgG, с течением времени связано с десорбцией клеток, сохраняющих гаггегральность плазматической мембраны.
-
Постдесорбционные изменения ПМЛ заключаются в индукции апоптоза в значительной части клеточной популяции, уменыпешш количества мембранных Fey рецепторов II и III, но не I типа.
-
Пролонгированный (360-420 мин) контакт ПМЛ с поверхностями, покрытыми IgG и СЗЬ, приводит к снижению сорбционной емкости данных субстратов к свежей порции ПМЛ. В случае IgG-зависимой адгезии этот феномен сопровождается оставлением селективных протеинов мембраны ПМЛ на поверхности сорбента.
4. Нейтрофилы, адгезированные на различных
рецепторзависимых (покрытых IgG, СЗЬ, коллагеном I типа) и
рецепторнезависимом субстрате (DEAE-сефадекс) в
большинстве случаев демонстрируют пониженный по
сравнению с интактными клетками хемилюминесцентный
ответ на различные стимулы. Изменение
хемилюмішесцєнтного ответа адгезированных ПМЛ зависит от типа сорбента, стимулятора и усилителя ХЛ (люминол или люцигенин).
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ