Введение к работе
Поскольку во всех странах Европы ИБС остается ведущей причиной смертности и преждевременной потери трудоспособности мужчин в возрасте около 45 лет и женщин около 60 лет,,эта болезнь остается главной заботой кардиологов, медицины и социальной службы всех стран Европы (Pyorala,Backer,Graham. 1994).
Одной из ведущих причин развития атеросклероза в настоящее время считается нарушение липопротеидного обмена и связанное с этим повышение в крови концентрации липопротеидов низкой и очень низкой плотности. Близок к липопротеидам низкой плотности класс Лп(а). физиологическая роль которого в последние годы усиленно изучается.
Липопротеиды плазмы крови- сложные надмолекулярные соединения липидов и белков. Белковые компоненты липопротеидов. апопро-теины. определяют их способность связывать и транспортировать липиды. Липиды циркулируют в крови в форме липопротеидов. Основная масса белков класса Лп(а) (35% пула) представлена комплексом апоВ100/апо(а) с соотношением 2:1. Благодаря наличию такой специфической структуры, Лп(а), наряду с ЛПНП. приобретает способность связывать ХС и переносить его в сосудистую стенку. Лп(а) содержит два белка, апоВЮО и апо(а). расположенных на поверхности сферической частицы и связаных между собой ковалентно ди-сульфидными мостиками. Апо(а)- белок, состоящий из 4529 аминокислотных остатков (Utermann, 1989). апоВЮО содержит 4536 остатка (Yang. Chen. 1986). Одним из негативных свойств апоВЮ0/апо(а)
является способность образовывать агрегаты, особенно при высокой концентрации их в крови. Такие агрегаты могут быть причиной риска ИБС.
Лп(а) был открыт Каре Берг (Berg,1963), и первоначально он был представлен как качественный признак. В 1987 году Utermann с соавт. с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим иммуноблотингом. открыли и описали 6 (F,B,S1.S2,S3,S4,0) фенотипов апо(а). различающихся по молекулярному весу. Обнаружено, что концентрация Лп(а) изменяется в соответствии с фенотипом апо(а). Эти данные важны, поскольку повышенный риск ИБС связан с высокой концентрацией Лп(а). Установлено, что уровень Лп(а) в плазме крови больше либо равном 25-30 мг/дл является фактором риска развития ИБС. Возможно, это обусловлено двумя причинами: тем.что у лиц Лп(а+) наблюдается повышенный уровень общего холестерина, или это связано с атерогенностью самого Лп(а) (Walton. Valente,1976). Предположение об атерогенной роли Лп(а) получено в работах Harpel с соавт.(1992), обнаруживший Лп(а) в пораженных атеросклерозом участках сосудистой стенке, где они были локализованы вместе с ЛПНП и фибрином. Важным компонентом частицы Лп(а) является ХС и его эфиры (до 45% общего пула).
Несмотря на интенсивные исследования последних лет разных свойств Лп(а). остаются слабо разработанными клинические аспекты использования этого генетического маркера. Думается, что представленные выше сведения диктуют необходимость комплексного подхода к изучению возможности использования Лп(а) в качестве генетического маркера возможного диагноза развития ИБС.
Совокупность приведенных аргументов свидетельствует об актуальности и практической важности изучения количественного уровня концентрации Лп(а) в плазме крови человека с помощью специфических антител для выявления генетической предрасположенности к атеросклерозу.
Цель исследования- Изучение роли количественного уровня Лп(а) в плазме крови, как важного генетического маркера-для разработки концепции патогенеза атеросклероза.
Задачи исследования.
1.Экспериментально разработать методику получения гетероим-мунных моноспецифических антисывороток для определения количественного уровня Лп(а) плазмы крови человека;
2.Провести скрининг населения г.Новосибирска, коренных жителей Чукотки и Горного Алтая с помощью полученных антисывороток и сравнить особенности распределения разных уровней Лп(а) у больных ИБС и лиц того же возраста без ИБС среди различных этнических групп населения Западной Сибири и Чукотки;
3. Провести сравнительное изучение особенностей биохимических показателей липидного обмена среди больных ИБС и лиц того же возраста без ИБС с разным уровнем Лп(а) в плазме крови;
4.Изучить корреляцию количественных уровней Лп(а) с частотой развития атеросклероза и некоторыми факторами риска развития ИБС;
5. Определить концепцию и возможности метода определения количественного уровня Лп(а) при анализе корреляции последнего с частотой развития ИБС.
Для решения поставленных задач был использован комплекс современных иммунологических, иммунохимических, иммуногенетических и биохимических методов исследования и гибридомная технология получения антисывороток.
Объект исследования.Репрезентативные выборки из этнических популяций и неорганизованного населения Сибири и Крайнего Севера- мужчины 24- 59 лет. отобранные и обследованные по методике разработанной в ВОЗ.
Основные положения, выносимые на зашту.
1.Получение гетероиммунных антисывороток к Лп(а) и другим липопротеидам плазмы крови человека с использованием нового вида лабораторных - минисвиней является наиболее перспективным.
2.Уровень концентрации Лп(а) плазмы крови у этнических популяций Сибири и Крайнего Севера от 0 до 80 мг/дл. Повышенная изменчивость значений уровня концентрации Лп(а) сопровождается смещением кривой распределения в вариационном ряду влево, что указывает на тенденцию организма образовывать и сохранять в повышенном количестве вариации с более низким уровнем концентрации Лп(а) плазмы крови.
-
Уровень холестерина в крови также связан с концентрацией Лп(а) в плазме крови. Так при концентрации Лп(а) 5 мг/дл среди лиц без ИБС уровень общего ХС составлял 4,7-5 ммоль/л и 5,2-6 ммоль/л среди лиц с ИБС. При концентрации Лп(а) свыше 30 мг/дл уровень общего ХС был на 20% выше (Р<0.001).
-
Во всех возрастных периодах встречались лица как с высокими, так и с низкими уровнями концентрации Лп(а) в крови. Из 60 практически здоровых жителей г.Новосибирска, имевших уровень Лп(а) 13,8 мг/дл, 73% составляли лица в возрасте 30-34 лет. Среди больных ИБС в этом возрасте уровень 13,8 мл/дл встречался в 2 раза реже.
5.У больных ИБС уровень концентрации Лп(а) плазмы крови прямо пропорционально ассоциирован с риском развития заболевания.
Научная новизна.Впервые разработана методика использования минисвиней- нового вида лабораторных животных, выведенные в нашей стране, в том числе и для изучения иммуногенетических особенностей атерогенных классов липопротеидов плазмы крови человека. Разработана схема иммунизации, определен возраст животных и установлена доза антигена, наиболее эффективные для получения гетероиммунных антисывороток.
Впервые в нашей стране изучен количественный уровень концентрации Лп(а) плазмы крови в различных этнических популяциях Сибири и Крайнего севера. Исследованы проживающие в разных экстремальных условиях близкие этнические группы населения (чукчи прибрежные и тундровые) и в одинаковых условиях- разные группы населения (коренные жители Чукотки и пришлое население из европейской части страны, а также чукчи и эскимосы).
Впервые изучена частота и особенности распределения уровней концентрации Лп(а) плазмы крови у больных ИБС и лиц того же возраста без ИБС. Определена сопряженность различных уровней концентрации Лп(а) плазмы крови с развитием ИБС и некоторыми факторами риска этого заболевания. Отмечен достоверно более высокий уровень концентрации Лп(а) в крови у больных ИБС с наличием ги-перхолестеринемии по сравнению с больными, имеющими нормальный уровень липидов. Показана возможность использования показателя уровня концентрации Лп(а) плазмы крови в качестве прогностического теста.
Теоретическое и практическое значение. Результаты, полученные в настоящем исследовании, имеют определенное теоретическое и практическое значение, поскольку расширяют представление о патогенезе атеросклероза и ИБС. Полученные результаты дают основу для утверждения, что Лп(а) является дополнительным фактором риска ИБС. Это дает возможность дифференцированного подхода к выявлению, профилактике и лечению ИБС в конкретных условиях Сибири. Чукотки и Горного Алтая. Высокая чувствительность и специфичность метода определения количественного уровня Лп(а) в отношении ИБС указывают на возможность использования этого теста в клинической диагностике ИБС и в прогностических целях.
Разработан метод получения гетероиммунных антисывороток к ли-попротеидам человека на мини-свиньях, а также использование метода радиальной иммунодиффузии на пластинах с 0,5% гелем агарозы с полимеризованными в нем антителами к Лп(а), так как этот метод наиболее доступен для клинических лабораторий, что позволяет использовать метод количественного определения концентрации Лп(а) в широкой практической работе.
Полученные результаты в отношении полиморфизма липопротеидов могут быть использованы в экспериментальной разработке новых им-муногенетических методов раннего прогноза атеросклероза и ИБС.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюз. конф. "Биологическая характеристика лабораторных животных и экстраполяция на человека экспериментальных данных" (Москва, 1980); Всесоюз. конф. "Особенности патологии коренного и пришлого населения в условиях Крайнего Севера"(Красноярск, 1981); III Всесоюз. конф. по адаптации человека в разных климато-географических и производственных условиях (Ашхабад. 1981); Симпозиуме"Популяционная генетика человека"(Москва, 1983); I Всесоюз. съезде медицинских генетиков(Киев.1984); Междунар. конф. по профилактической кардиологии (Москва,1985); VT-th Intern. Symposium on circulation health (Anchorage,1985); Науч. конф. "Биохимия-медицине" (Ленинград. 1989); IX Intern. Congress on Clrcumpolar Health (Reykjavik. 1993): 3-rd Intern. Conf. on Preventive Cardiology (Norway. 1993); Научно-практической конф. "Актуальные проблемы охраны здоровья малочисленных народов Севера" (Красноярск,1993); Всероссийской конф. "Кар-
диология : успехи, проблемы и задачи" (Санкт- Петербург.1993); Конф. "Актуальные вопросы профилактики неинфекционных заболеваний" (Москва. 1993); Научно-практических конф. врачей Новосибирска "Новые методы диагностики, лечения и профилактики заболеваний" (Новосибирск, 1993. 1994); Научных конф. Института терапии СО РАМН (Новосибирск.1991.1992,1993, 1994); Xth Intern. Symposium on Atherosclerosis (Montreal, 1994); Meeting of the working Group Epidemiology and Prevention of the European Society of Cardiology. Venice.1994); Межрегион, конф. (Тюмень. 1994); Всероссийской учредит, конф. геронтологов и гериартров (С.-Петербург.1994):111 межрегиональной конф. общества мед. генетиков (Москва.1994);VI симп. по биохимии липидов (С.-Петербург,1994); I Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск. 1995).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 60 печатных опубликованных работах, в т.ч. в 9 статьях в центральных журналах и в одном зарубежном, 10 в трудах международных симпозиумов, 9 Всероссийских и 9 межрегиональных и региональных конференций. 3 рацпредложениях.
Настоящая работа является частью комплексного исследования аспектов патогенеза атеросклероза и ишемической болезни сердца, проводимого в Институте терапии СО РАМН и в ЦНИЛ НМИ под руководством академика Никитина Ю.П.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 176 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 28 таблицами. Прилагаемый список цитируемой литературы содержит библиографические сведения о 301 отечественной и 357 иностранных публикациях.
Материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Сбор материала проведен в ходе 6 комплексных экспедиций на Чукотку и Горный Алтай, а также в клинике и при скрининге одного из районов г.Новосибирска по программе В03"МОНИКА". Все серологические, иммунохимические исследования и часть биохимических исследований (в лаборатории биохимии атеросклероза ВКНЦ РАМН) также выполнены автором.