Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор по изучению структурно-функциональных особенностей переднего мозга рыб и хеморецепции 3-19
1.1. Структурно-функциональные особенности обонятельного анализатора и переднего мозга рыб 3 -7
1.2. Методологические аспекты изучения хеморецепции 8-13
1.3. Влияние запаховых веществ на поведение рыб 13 -17
1.4. Влияние загрязняющих веществ и синтетических препаратов на обонятельный анализатор рыб 17-19
2. Материал и методы исследования 20-30
2.1. Материал 20
2.2. Система жизнеобеспечения рыбы в процессе электрофизиологического эксперимента и регистрации биоэлектрической активности мозга 21 -23
2.3. Стимуляция сенсорных органов рыб 23-26
2.4. Тестирование кормовых компонентов и аминокислот 26-28
2.5. Тестирование нейротропных и непищевых запаховых веществ 29 - 30
3. Функциональные особенности структур мозга рыб при воздействии нейротропных препаратов 31 - 51
3.1. Биоэлектрическая активность обонятельной луковицы (ОЛ), конечного мозга (КМ) и крыши среднего мозга (КСМ) рыб при действии анестетиков: гидрохлорида хинальдина (ГХ) и трикаин метан сульфо-ната(МБ-222) 31 -42
3.2. Влияние кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойств водной среды на функции обонятельного анализатора рыб 43-44
3.3. Злектрофизиологическая характеристика синтетического вещества морфолина, применяемого для управления нерестовой миграцией лососевых рыб на конечных её этапах 45 -47
3.4. Особенности восприятия нейротропных веществ обонятельными рецепторами рыб 48-51
4. Функциональные особенности обонятельного анализатора при воздействии на обонятельные рецепторы кормовых компонентов и аминокислот 52-81
4.1. Обонятельная эффективность корма РГМ-6М и его компонентов 52 - 60
4.2. Особенности кросс-адаптации обонятельных рецепторов карпа к раст ворам аминокислот 61-78
4.3. Определение сродства к аминокислотам пищевого обонятельного стимула в жировой добавке к форелевым рационам линетоле и рыбьем жире 79-81
Заключение 82-84
Выводы 84
Список использованной литературы
- Методологические аспекты изучения хеморецепции
- Система жизнеобеспечения рыбы в процессе электрофизиологического эксперимента и регистрации биоэлектрической активности мозга
- Влияние кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойств водной среды на функции обонятельного анализатора рыб
- Особенности кросс-адаптации обонятельных рецепторов карпа к раст ворам аминокислот
Методологические аспекты изучения хеморецепции
Воздушная и водная среды создают различные условия для обонятельной рецепции. В воздухе обонятельными раздражителями не могут быть вещества с молекулярной массой свыше 300-400 (Минор, 1984). Водная среда практически снимает ограничения для раздражающих веществ по молекулярной массе, но регуляция размеров воспринимаемых рецепторами веществ может осуществляться слоем слизи. У рыб функционируют жгутиковые и микровиллярные обонятельные клетки, в то время как у наземных позвоночных - только жгутиковые. В электрофизиологических опытах было показано, что обонятельные рецепторы земноводных располагаются главным образом на жгутиках рецепторных клеток (Adamek, 1984). При отведении электрической активности от обонятельного эпителия в ответ на запаховое раздражение регистрировались электроольфактографические (ЭОГ) реакции. После удаления жгутиков обонятельного эпителия перфузией детергента тритона Х-100 и снижения амплитуды ЭОГ-реакций возрастание амплитуды происходило пропорционально длине жгутиков восстанавливающегося мерцательного эпителия. За два дня роста жгутиков до 40 мкм электрические обонятельные реакции достигали максимальных амплитуд. ЭОГ-реакции регенерирующего эпителия после обработки сульфатом цинка возрастают линейно до 30=го дня регенерации. С этого момента амплитуда реакций возрастает резко, что, вероятно, объясняется соединением рецепторов с окончаниями рецепторного аксона. В пользу локализации обонятельных рецепторов на жгутиках свидетельствует и значение их подвижности для функционирования обонятельных рецепторов (Бронштейн, Минор, 1975). У дальневосточных лососевых (кеты, горбуши, симы) различают три структурные разновидности рецепторных клеток: палочковидные, колбочковидные и нитевидные, - из которых преобладают палочковидные клетки. Рецепторные элементы представлены жгутиковыми и микровиллярными типами. Опорные клетки, имеющие большое количество митохондрий, интенсивно секретируют слизь (Дорошенко, 1984). В эмбриональном развитии радужной форели циллиарные рецепторные клетки появляются на 18=ый день после оплодотворения. В это время обонятельные плакоды завертываются, образуя желобковидную структуру впереди глаза. К моменту вылупления передний край обонятельного эпителия содержит только циллиарные рецепторные клетки, а в его средней части имеются и циллиарные, и микровиллярные рецепторные клетки. У эмбрионов форели при наличии спорадических циллиарных рецепторных клеток были зарегистрированы нервные ответы на аминокислоты (Zielinski, Нага, 1983). Установлено, что у осетровых на стадии выклева дифференциация обонятельных клеток практически закончена. У личинок проходных видов (белуга, осетр, севрюга) преобладают жгутиковые рецепторы, а у непроходных (стерлядь) - микровиллярные (Пяткина, 1984). Методом просвечивающей электронной микроскопии исследовано строение обонятельного эпителия у особей желтокрылого бычка, находящихся на разных фазах жизненного цикла. Показано, что в репродуктивный период у жгутиковых и микровиллярных рецепторных клеток отмечаются признаки усиления синтетических процессов: увеличение количества свободных полирибосом, фрагментирование каналов гранулярного эндоплазматического ретикулюма. В опорных мерцательных клетках увеличивается количество митохондрий (Клименков, 1988). При сравнительно-анатомическом исследовании обонятельных розеток 79 видов карповых рыб Китая анализировались формы и углы наклона центральных септ, что позволило разделить все виды на 6 групп. Показано, что морфология обонятельных розеток может играть определенную роль в таксономии Cyprinidae. На основании величины процентного соотношения диаметра глаза и обонятельной капсулы все исследованные виды карповых разделялись на две большие группы: с преобладающим развитием зрения и с преобладающим развитием обоняния (Chen Xing Yu, 1988). Предполагается, что вторичная складчатость обонятельных розеток лососевых, выраженная в более высокой степени у чавычи по сравнению с кетой и горбушей, коррелирует с характеристиками хоминга (Дорошенко, Девицина, 1988). Рыбы обладают способностью к усилению рецепторного анализа химических стимулов слабой интенсивности за счет дополнительного прокачивания воды через обонятельнные мешки. Интересная система регуляции обонятельного восприятия имеется у многопера Polypterus senegalus. Обонятельный мешок многопера состоит из трех верхних и трех нижних долей, каждая из которых имеет еще несколько карманов. Поступление и выведение воды регулируется двумя трубочками обонятельного мешка. Все доли обонятельного мешка сообщаются друг с другом и с общим протоком. Поступающая через входную трубочку вода проходит через все карманы несколько раз, меняя направления течения. Если проток воды содержит слабый запах, то эта вода может вторично прогоняться по карманам, омывая островки сенсорного эпителия (Bjerring, 1988). Специализированной обонятельной структурой головного мозга рыб является обонятельная луковица (ОЛ). У осетра ОЛ обособляется от полушарий переднего (конечного) мозга в возрасте 30-35 суток и представляет собой парное образование, имеющее все основные слои, характерные для ОЛ взрослого животного. Дальнейшее развитие ОЛ идет по пути дифференцирования самих клеточных слоев и элементов. Основное формирование ОЛ у осетра завершается в возрасте 70 суток (Рустамов, 1984). В морфологических и электрофизиологических работах на обонятельной луковице карпа выявлены различия между митральными и пучковыми клетками ОЛ. Показано наличие лишь у митральных клеток аксона, связанного с обонятельным трактом (Fujita Ichiro, 1988). Местом генерации ритмических колебаний потенциала в ответ на электрическую стимуляцию обонятельных трактов является область тел и дендритных ветвлений митральных клеток. Выявлена четкая синхронизация импульсной активности митральных клеток с ритмическими колебаниями потенциала в ОЛ. Получены результаты, которые подтверждают гипотезу синаптических дендро-дендритных взаимодействий между митральными и зернистыми клетками в ОЛ (Yamaguchi, Satou, Ueda, 1988). По-видимому, эти взаимодействия лежат в основе механизма кодирования стимулов в ОЛ всех позвоночных (MacLeod, 1976).
Физико-химические свойства воды создали благоприятные условия для развития у рыб высокочувствительного обонятельного анализатора. У различных по экологии рыб Белого моря оценивалось развитие обонятельного и зрительного анализаторов. Вычислялись размеры всего головного мозга, обонятельных луковиц и зрительных областей, а также экологические коэффициенты - процентные отношения площадей поверхностей обонятельных и зрительных рецепторов. Между площадью обонятельной выстилки и размерами ОЛ (относительно величины мозга) существует достоверная положительная корреляция. Более высокие экологические коэффициенты у донных видов по сравнению с пелагическими обусловлены в основном редукцией зрительных рецепторов, так как относительные размеры обонятельных рецепторов изменялись незначительно от вида к виду. Для донных видов отмечено незначительное увеличение относительных размеров ОЛ. (Девицина, 1984).
В конечном мозге (КМ) рыб надежно установлены локальные области зрительных проекций (Ракич, Белехова, Коневич, 1979). С другой стороны известно, что в ответ на рецепторную активацию в проецирующихся в КМ нейронных элементах обонятельной луковицы формируется мощная ритмическая активность (Goh, Tamura, 1978). Не исключено, что в нейронной сети КМ реализован аппарат воспроизведения ольфакторного ритма (Freeman, 1975). Учитывая данные о конвергентных отношениях обонятельного и зрительного анализаторов на уровне КМ (Никоноров, Обухов, 1983), можно допустить, что зрительный афферентный вход лишь повышает возбудимость КМ и таким образом запускает генератор ольфакторного ритма в этой структуре. Тем более, что в литературе неоднократно высказывалось мнение о генерализованном активирующем характере влияний зрительной афферентации на КМ у рыб (Laming, 1980).
Система жизнеобеспечения рыбы в процессе электрофизиологического эксперимента и регистрации биоэлектрической активности мозга
В электрофизиологических опытах на 23=х особях карпа обоего пола изучалось действие нейротопных веществ при добавлении их в эффективной концентрации в жаберный проток подопытных рыб.
В ответ на диффузный засвет глаза в условиях темновой адаптации в паллиальном отделе контралатерального полушария КМ регистрировалась вызванная ритмическая активность (ВРА), которая достигала максимальной амплитуды в зоне sulcus ypsiliformis КМ. На рисунке 3 видно, что в структуре ритмического ответа КМ выделяются два компонента: быстрый фазический (30-50 кол/с), занимающий первые 200-300 мс реакции, и медленный тонический (8-14 кол/с), сохраняющийся при длительной стимуляции в течение 3-4 секунд с последующей трансформацией в отдельные веретена. На рисунке 4 видно, что при одновременной регистрации ВРА в КМ и ОЛ по частотным характеристикам ольфакторная ритмика близка к тонической составляющей ВРА на свет в КМ. В период развития электрических реакций в ОЛ не наблюдается каких-либо изменений ВРА в КМ, в то время как развитие быстрого фазического компонента ВРА КМ в ответ на вспышку света приводит к значительному угнетению электрической реакции ОЛ, что видно на рисунке 4 Б.
На рисунке 5 видно, что при одновременной регистрации ВРА в зрительных областях КМ и КСМ развитие быстрого фазического компонента ВРА КМ совпадает с периодом "оп"-ритмики в КСМ. При этом частотные характеристики обоих ритмов лежат в диапазоне 30-50 кол/с, что в отношении КСМ согласуется с данными других авторов (Барминцев, Лукьянов, 1977). В отличие от быстрого фазического компонента ВРА КМ, медленный тонический компонент не находил электрографического отражения в параллельно регистрируемой активности КСМ. Интегральная оценка ВРА КМ и КСМ по площади под огибающей пики волн кривой показала, что при изменении интенсивности зрительной стимуляции реакции в КМ возникают и достигают
Электрическая активность конечного мозга І верхний луч) и кршш среднего мозга (низший луч) при адекватной зрительной стимуляции. Калибровка; 25 мкВ, 2G0 мс.
Изменения ашщтуды первичного комплекса "ои"-о?вега КСМ ( I I) и интегральной оценки вызванной ритмической активности в конечном мозгу ( ЕПЗ) карпа при увеличении интенсивности зрительной стимуляции: по вертикали - величина параметра г % от максимальной величины с указанием стандартной ошибки; по горизонтали - уровни интенсивности зрительной стимуляции. насыщения при меньших значениях освещенности, чем первичные ВРА в КСМ (Рис. 6). При ухудшении функционального состояния препарата первым исчезает фазический компонент ВРА КМ, тогда как медленная составляющая ВРА КМ и первичные реакции в КСМ еще в течении некоторого времени могут оставаться неизменными.
Изучение нейротропного действия ГХ на центральную нервную систему рыб проводилось после подачи раствора этого анестетика к жабрам рыб. При обратной замене раствора анестетика на чистую воду в жаберном протоке рыб осуществлялась "отмывка" препарата. Контроль осмотической нагрузки производился добавлением в проток чистой воды через жабры рыб хлористого натрия, а изменений рН - нейтрализацией раствора ГХ добавлением в него едкого натра до отметок рН 6,9-7,1.
Сравнительный анализ фоновой и вызванной обонятельными и зрительными стимулами активностей ОЛ и КСМ не показал каких-либо заметных изменений в этих структурах при циркуляции в жаберном протоке рыб растворов ГХ в концентрациях 5-45 мг/л. Иная картина наблюдалась в электрической активности КМ. Через 4-7 минут после подачи в жаберный проток раствора ГХ концентрацией 5-20 мг/л ВРА в КМ в ответ на зрительный стимул значительно увеличивается по амплитудам электрических колебаний (Рис. 7). При этом наблюдается облегчение как начального фазического, так и тонического компонентов ВРА КМ. Замена в жаберном протоке раствора ГХ на чистую воду приводит к постепенному восстановлению ВРА в КМ до контрольного уровня.
Динамика интегральной характеристики ВРА КМ (по площади огибающей пики электрических колебаний кривой) в процессе действия ГХ и последующей "отмывки" показана для одного из типичных опытов на рисунке 20. Выраженность ВРА в КМ резко возрастает в 2,0-2,5 раза в первые 15 минут действия ГХ с последующим переходом в фазу "плато", завершающимся обычно к 40-50 минуте от момента подачи раствора анестетика. В дальнейшие 24 часа наблюдения ВРА в КМ остается относительно неизменной при хорошем функциональном состоянии препарата. Замена в жаберном протоке раствора ГХ на чистую воду приводит к постепенному восстановлению ВРА КМ до контрольного уровня. Длительность восстановительного периода прямо зависит от продолжительности хинальдиновой экспозиции. При экспозиции рыбы в растворе ГХ равной 30 минутам восстановление ВРА в ходе последующей отмывки завершается к 35-40 минуте (Рис. 8). Менее длительной экспозиции в і
Динамика изменения вьлражениосій вызванной ритмической активности КМ в процессе деЯ-ся-вик ГХ /14 мг«/л/ ы последующей ОТМНВВЭЕ По ве-ртикгчтіад- — ннражениостъ раазспии т згллтчннх «.гпснипау, по горизонтали - шкала времеяга в
растворе ГХ (до 10 минут) соответствует 10-15 минутный период восстановления ВРА КМ.
Увеличение амплитуд электрических колебаний ВРА КМ зависит от концентрации ГХ в жаберном протоке. Минимальной концентрацией ГХ в растворе, необходимой для заметного облегчения ВРА КМ в ответ на зрительный стимул, является концентрация 5-7 мг/л. При увеличении концентрации ГХ в жаберном протоке с 7 до 14 мг/л оба компонента ВРА значительно возрастают не только по амплитуде, но и по длительности (Рис. 7). Дальнейшее увеличение концентрации ГХ в жаберном протоке до 45 мг/л приводит к постепенному угнетению фоновой электрической активности КМ с последующим снижением реакций на вспышку света (Рис. 9).
Добавление MS-222 в жаберный проток рыб во всех опытах приводило к угнетению фоновой электрической активности ОЛ, КМ, КСМ. Угнетение фоновой активности ОЛ становилось заметным при концентрации MS-222 в жаберном протоке рыб 65-78 мг/л (Рис. 10). Угнетение фоновой активности КМ и КСМ становилось заметным при концентрациях MS-222 17-34 мг/л, когда достигается лишь некоторая транквилизация рыб без существенных нарушений двигательной активности (Рис. 11). Увеличение концентрации MS-222 до 55 мг/л приводило к почти полному угнетению фоновой активности КМ и снижению фоновой активности КСМ на 60-80%. При такой концентрации MS-222 происходит не только транквилизация, но и нарушение равновесия и потеря двигательной активности рыб. Угнетение фоновой электрической активности структур мозга рыб достигало максимума в течение первых 7-10 минут действия анестетика.
Переключение жаберного протока раствора MS-222 на проток чистой воды приводило к постепенному восстановлению электрической активности мозга рыб (Рис. 11). При концентрациях MS-222 17-34 мг/л нормальная активность мозга восстанавливалась через 7-13 минут после включения протока чистой воды через жабры рыб. При действии MS-222 в высоких концентрациях (до 60 мг/л) на рыб в течение 35-40 минут для восстановления электрической активности мозга требовалось 20 минут отмывки: в первые 10 минут происходило значительное возрастание фоновой электрической активности КМ и КСМ, а в последующие 10 минут фоновая электрическая активность этих структур мозга постепенно восстанавливалась до нормального уровня. Проток растворов MS-222 через жабры рыб не приводил к заметному изменению обонятельных реакций ОЛ
Влияние кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойств водной среды на функции обонятельного анализатора рыб
В электрофизиологических экспериментах для обонятельного тестирования использовались водные экстракты гранулированного корма РГМ-6М и его компонентов (витаминного премикса ПФ-1В, дрожжей, крилевой муки и соевого шрота) из расчета 0,005 и 0,05 мг сухого вещества на 1 мл. В ответ на раздражение обонятельных рецепторов карпов водными экстрактами указанных концентраций этих кормовых веществ в ОЛ рыб регистрируется характерная электрическая реакция: комплекс высокоамплитудных двухфазовых колебаний с частотой 8-Ю кол./с и длительностью до 10-15 секунд (Рис. 14). Для количественной характеристики этой реакции, получившей название "вызванные волны", были выбраны следующие параметры: площади под кривыми, огибающими графические отображения реакций по пикам волн за 1,5 секунды регистрации начальных фаз этой реакции (S1,5) и за весь период регистрации этой реакции (ST); максимальная амплитуда электрических колебаний (А) и период регистрации выраженной реакции в секундах (Т). Площади под кривыми, огибающими графические отображения реакций, измерялись с помощью планиметра с точностью до 0,1 см2. Максимальная амплитуда электрических колебаний измерялась в милливольтах. В качестве контроля к обонятельным рецепторам через канал стимуляции подавалась вода, которая неприрывно поступала в обонятельные полости в качестве фонового протока.
Для сравнения реакций на кормовые экстракты между отдельными реализациями стимулов и между опытами на разных рыбах, перечисленные выше параметры реакций ОЛ в ответ на обонятельные стимулы кормовых веществ нормировались: брались в отношении к соответствующим параметрам реакций ОЛ в ответ на обонятельное стимулирование чистой водой. Полученные безразмерные величины показывают, во сколько раз реакции ОЛ на тест-стимул по соответствующим параметрам превосходят реакции ОЛ на чистую воду, прошедшую канал стимуляции. По всем полученным данным были вычислены средние и ошибки (Табл.1). По параметру площади электрографической реакции ОЛ за весь период развития реакции (S) дрожжи и соевый шрот были менее эффективными обонятельными раздражителями, чем корм РГМ-6М, премикс и крилевая мука (Рис.15). По параметру площади электрографической реакции ОЛ за первые 1,5 с развития реакции (S1,5) эффективность всех обонятельных раздражителей была примерно одинаковой (Рис. 16). По параметру периода реакции (Т) наименее эффективными обонятельными раздражителями были соевый шрот и дрожжи. При этом крилевая мука была менее эффективной в концентрации из расчета 0,05 мг сухого вещества на 1 мл воды. (Рис. 17). По параметру максимальной амплитуды реакций ОЛ (А) все кормовые вещества были примерно в равной степени эффективны (Рис. 18). Таким образом, дрожжи и соевый шрот оказались менее эффективными обонятельными раздражителями, чем все остальные тестируемые кормовые вещества.
Наиболее показательным параметром для оценки обонятельной эффективности сложных кормовых веществ является площадь электрографической реакции ОЛ.
Премикс растворялся в воде практически полностью и его обонятельная эффективность объясняется, по-видимому, большим содержанием в нем аминокислот (15,7%). При этом глутаминовая кислота, которая является эффективным обонятельным раздражителем, среди других аминокислот пребладает и составляет 5,3% в составе витаминного премикса.
В отдельной серии опытов проводилось обонятельное тестирование корма РГМ-6М на фоне протока через обонятельные полости рыб воды из аквариума, где содержались карпы с плотностью посадки 3,5 кг/м3. Обнаружено, что непосредственно после включения фонового протока загрязненной метаболитами аквариумной воды стимуляция обонятельных рецепторов экстрактом корма РГМ-6М из расчета 0,005 и 0,05 мг/мл сначала не приводила к возникновению электрических реакций ОЛ, а затем реакции ОЛ появлялись и возрастали по своим параметрам в течение 60 минут. Однако, даже при длительной адаптации обонятельных рецепторов к аквариумной воде, эти реакции ОЛ оказались по максимальной амплитуде электрических колебаний в 2 раза меньше соответствующих реакций ОЛ на корм РГМ-6М на фоне протока через обонятельные полости рыб отстоянной водопроводной воды.
Из рыбоводной практики известно, что повышение содержания в среде обитания рыб их метаболитов и остатков корма приводит к снижению пищевой активности рыб. Таким образом, электрофизиологические данные могут
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования электрофизиологической методики для количественного определения запаховой эффективности кормовых веществ для рыб, поведенческие реакции на которые известны (корм РГМ-6М и все его инградиенты вызывали у карпов пищевые поведенческие реакции). Большое различие исследуемых рыб в восприятии всех тестируемых кормовых веществ, кроме дрожжей, возможно, объясняется их индивидуальными различиями и условиями содержания до помещения в лабораторию (в лабораторном аквариуме рыбы адаптировались в течение не менее 2=х месяцев). Отсутствие достоверности в различиях обонятельной эффективности корма РГМ-6М, премикса и крилевой муки не должно служить препятствием для применения электрофизиологической методики для определения более эффективных по запаху кормовых веществ, так как в результате опытов выявлены менее эффективные по запаху кормовые инградиенты: дрожжи и соевый шрот. При этом необходимо нормирование всех реакций на тестируемые вещества по контрольному стимулу, не содержащему метаболитов рыб и других сложных органических веществ. Метаболиты изменяют чувствительность обонятельного анализатора к веществам, а сложные органические соединения, как показали опыты, часто имеют большую вариабельность восприятия у рыб.
Полученные количественные данные по запаховой эффективности кормовых веществ по параметрам реакций ОЛ представлены на рисунках 15-18. 4.2. Особенности кросс-адаптации обонятельных рецепторов карпа к растворам аминокислот.
Для адекватного обонятельного стимулирования и длительных перфузии использовались растворы десяти аминокислот (тирозина, фенилаланина, валина, триптофана, лейцина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина, треонина, аланина) в достаточно высокой концентрации (10"3 моль/л).
Тестируемыми в паре аминокислотами последовательно раздражали обонятельные рецепторы при протоке чистой воды через обонятельные полости рыб и регистрировали реакции ОЛ. При перфузии раствора одной из аминокислот на обонятельные рецепторы рыб в течение 2-4 минут происходила адаптация обонятельного анализатора рыб к этому раствору. Вновь установившаяся фоновая активность ОЛ по амплитуде, как правило, превышала фоновую активность ОЛ при протоке через обонятельные полости рыб чистой воды. Адаптированные к одной аминокислоте обонятельные рецепторы стимулировали раствором другой аминокислоты и регистрировали электрические реакции ОЛ. Максимальные амплитуды полученных реакций ОЛ были меньшими по своим величинам, по сравнению с максимальными амплитудами реакций ОЛ на тот же стимул при протоке чистой воды через обонятельные полости рыб. В течение всех опытов контролировалась чистота канала химической стимуляции, когда по нему к обонятельным рецепторам подавалась чистая вода из фонового протока (полученные реакции ОЛ по сравнению с реакциями на аминокислоты были незначительными).
Особенности кросс-адаптации обонятельных рецепторов карпа к раст ворам аминокислот
Для восполнения содержания в искусственных кормосмесях незаменимых жирных кислот рекомендуются добавки линетола (Коренев, Краснов, 1988), а также рыбьего жира (Таутс, Тяхт, Тедерсоо, 1988). При добавлении в корм линетола и рыбьего жира сеголеткам и двухлеткам сёмги на Кандалакшском рыбоводном заводе Главрыбвода выявлено стимулирующее влияние этих жировых добавок на пищевое поведение рыб. Линетол является маслянистой жидкостью желтоватого цвета со слабым запахом рыбьего жира.
Для точной интерпретации содержащегося в линетоле запахового стимула были проведены поведенческие опыты. Белая поролоновая губка отпугивала не пораженных катарактой зрячих сеголеток и двухлеток семги. Пораженная двусторонней катарактой слепая молодь семги не реагировала на расположенную в садке поролоновую губку. При поступлении в стеклянную трубку фильтрата эмульсии линетола поролоновая губка пропитывалась им и становилась источником запахового стимула. Рыбы подплывали к губке, наблюдались поклевки губки слепыми рыбами и кусочков мусора вблизи губки зрячими рыбами. Кусочки пробки, не смоченные линетолом, схватывались только зрячими рыбами. Смоченные линетолом кусочки пробки схватывались как зрячими, так и слепыми рыбами, но не заглатывались ими.
В электрофизиологических опытах с семикратной повторностью было проведено тестирование фильтрата эмульсии линетола и рыбьего жира (0,5 мл на 100 мл воды) по методике кросс-адаптации в парах с растворами аминокислот (глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина, лейцина и валина) в концентрации 0,001 моль/л. Расчёт выраженности электрографических реакций ОП в ответ на стимул фильтрата эмульсии линетола в условиях адаптации обонятельного анализатора к растворам аминокислот производился по формуле (1).
Линетол оказался близким к рыбьему жиру по обонятельному восприятию его рыбами (перфузия фильтрата эмульсии рыбьего жира снижала реакции ОЛ на стимул фильтратом эмульсии линетола до 40,0 _+ 2,4%, а рыбий жир - к валину (перфузия раствора валина снижала реакции ОЛ на стимул фильтратом эмульсии рыбьего жира до 41,5 _+ 2,5%.
По восприятию обонятельным анализатором карпа линетол наиболее близок к глутаминовой кислоте. Глутаминовая кислота является хорошим пищевым запаховым аттрактантом для рыб, в том числе для молоди и производителей семги (Шпарковский и др., 1983).
Основными компонентами линетола являются этиловые эфиры жирных кислот льняного масла (олеиновой, линолевой, линоленовой), которые в воде распадаются на спирт и жирные кислоты. Спирты и органические кислоты при обонятельном тестировании и регистрации электрической активности с поверхности ОЛ не вызывают эффективных реакций (Нага, 1975). В контрольном обонятельном тесте с использованием фильтрата эмульсии химически чистых линолевой и линоленовой кислот (0,5 мл жирной кислоты на 100 мл воды) это подтвердилось. Так как линетол является не синтетическим, а натуральным продуктом, то скорее всего веществами, вызывающими эффективные реакции ОЛ в ответ на раздражение обонятельных рецепторов фильтратом его эмульсии, являются аминокислоты.
Степень сродства по обонятельному восприятию линетола и глутаминовой кислоты очень велика, если учесть, что: 1. Линетол является сложным веществом. 2. Перфузии глутаминовой кислоты на обонятельные рецепторы рыб снижают выраженность реакций ОЛ в ответ стимул фильтрата эмульсии линетола более, чем на 50% (перфузии других тестируемых аминокислот -менее, чем на 50%).
Так как глутаминовая кислота в качестве перфузии на обонятельные рецепторы слабо ингибирует реакции ОЛ в ответ на стимулы других аминокислот (Табл. 2; Ohno, Yoshii, Kurihara, 1984), то, по-видимому, именно она является эффективно действующим запаховым веществом в линетоле.
Таким образом, методика кросс-адаптации позволяет установить синтетический запаховый эквивалент к специфическому обонятельному стимулу для рыб в сложном субстрате природного происхождения. Попытки выделить эффективно действующие запаховые простые вещества из природных продуктов с помощью химического анализа и поведенческих опытов уже предпринимались (Ikeda Itaru et.al., 1988). Электрофизиологическая методика кросс-адаптации также может использоваться для определения набора синтетических веществ, эквивалентных эффективно действующему запаховому веществу, для проведения дальнейших поведенческих опытов. Преимуществом в этом случае является то, что для изучения на уровне поведения берется определенный набор химических веществ, а не все составляющие природный продукт простые вещества. При определении набора синтетических веществ для изучения их действия на уровне поведения должны учитываться выявленные особенности кросс-адаптации обонятельных рецепторов рыб.
После выявления синтетических запаховых веществ, эффективно воздействующих на поведение рыб (приманок, вызывающих реакцию избегания рыб препаратов), возможно их практическое использование в сочетании с наполнителями (омыленными жирами и другими веществами). При этом может быть получен хороший экономический эффект.
