Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Пигменты икры и их изменения в эмбриогенезе рыб 31
1.1. Визуальные различия цвета и спектральные характеристики живой икры рыб различных экологических групп по размножению 32
1.2. Изменения спектров поглощения света икринками в процессе эмбрионального развитии рыб 47
1.3. Разнообразие групп пигментов в икре рыб разных систематических групп 52
1.4. Классификация и физико-химические характеристики каротиноидов 74
Глава 2. Качественный и количественный состав каротиноидов и динамика этих показателей в раннем онтогенезе рыб 96
2.1. Содержание каротиноидов в икре рыб 96
2.2. Распределение каротиноидов и их состояние в различных структурах икры 111
2.3. Состав каротиноидов в икре и тканях рыб... 131
2.4. Изменения цветности каротиноидов в эмбриогенезе рыб 155
2.5. Причины изменения цветности каротиноидов в процессе эмбрионального развития рыб 182
Глава 3. Эколого-биохимические функции каротиноидов в эмбриогенезе рыб 193
3.1. Ранние исследования в области функциональной роли каротиноидов 193
3.2. Каротиноиды и окислительно-восстановительные процессы 210
3.3. Каротиноиды в качестве антиоксидантов перекисного окисления липидов 226
3.4. Роль каротиноидов в кальциевом обмене 231
Глава 4. Гемопротеиды в пигментации икры рыб 251
4.1. Гемопротеиды в икре различных видов рыб 251
4.2. Локализация и концентрация цитохрома Ьзбо в икринках и изменение его содержания в эмбриогенезе сиговых рыб 256
4.3. Функциональная роль цитохрома Ь56о в икре сиговых рыб 259
4.4. О систематическом ранге сиговых рыб 263
Глава 5. Пигменты и пигментация кожи рыб 265
5.1. Типы пигментных клеток, их дифференциация в онтогенезе и механизмы регуляции окраски рыб 265
5.2. Происхождение пигментации у рыб 283
5.3. Экологическое значение окраски для рыб 304
Приложение. Методы сохранения естественной окраски гидробионтов 313
Глава 6. Проблемы сохранения естественной окраскп рыб и других гидробионтов при создании музейных препаратов 313
6.1. Обзор методов изготовления музейных препаратов гидробионтов 314
6.2. Принципы создания фиксирующих смесей для сохранения естественной окраски рыб и других гидробионтов 317 Глава 7. Фиксация рыб по методу "Формик" 322
7.1. Условия подготовки рыбы к бальзамированию 322
7.2. Пищевая и гормональная регуляция окраски рыб 323
7.3. Способы, применяемые для быстрого изменения окраски рыб 324
7.4. Составы фиксаторов для метода "Формик" 328
Глава 8. Изготовление препаратов по методу "Пластик" 340
8.1. Растворы для метода "Пластик" 341
8.2. Методы фиксации икры и личинок рыб с сохранением их естественной окраски 354
Выводы 358
Список литературы
- Изменения спектров поглощения света икринками в процессе эмбрионального развитии рыб
- Распределение каротиноидов и их состояние в различных структурах икры
- Каротиноиды в качестве антиоксидантов перекисного окисления липидов
- Функциональная роль цитохрома Ь56о в икре сиговых рыб
Введение к работе
з .
Актуальность проблемы. Значение окраски рыб и отдельных пигментов, как в целом, так и на разных этапах их жизненного цикла интересовало ученых не одно столетие. Однако оставался неясным биологический смысл разнообразия окраски покровов взрослых рыб, а таюке функциональное значение пигментов в мышцах, других тканях, во внутренних органах и в икре.
Пигменты - окрашенные вещества, входящие в состав тканей организма, избирательно поглощающие свет в видимой части солнечного спектра. Из них объектами нашего исследования являлись только окрашенные соединения биологического происхождения, существенно влияющие на цвет икры и кожи рыб и представляющие интерес в плане изучения их функциональной роли.
Настоящее исследование связано с соединениями, традиционно относимыми к истинным пигментам, такими как птерины и каротиноиды, а также с бесцветными производными последних (витамины группы А), в силу их важности для понимания функциональной роли. В то же время, в числе окрашивающих рыб веществ нами рассматриваются меланины и гуанин, не являющиеся истинными пигментами, поскольку оіш поглощают или отражают свет во всем диапазоне видимой части спектра.
Более ста лет назад КСМережковский (1863), а вслед за ним и АЛрно (Arnaud, 1889 - цит. по Гудвину, 1954) высказали предположение о дыхательной роли отдельных пигментов в организме животных. Однако, несмотря на многочисленные исследования, до настоящего времени нет полной ясности в вопросе о функциональной роли пигментов на разных этапах онтогенеза рыб. Недостаточно изучены причины разнообразия содержания пигментов в икре разных видов рыб, их тканевая и внутриклеточная локализация. Неясно функциональное значение качественного разнообразия пигментов в организме рыб и их икре, а также метаболизма ряда пигментов в физиологических процессах организма. Фрагментарно исследовано участие различных групп пит-
4 ментов в биохимических и физиологических процессах на разных этапа? онтогенеза рыб.
Знания функциональной роли пигментов рыб крайне интересны ні только в теоретическом плане, но и важны с практической точки зрения да оптимизации биотехнологий в аквакультуре, использования этих соединеїшй ] медицине и разработки превентивных противорадиационных мер.
Выявление функций пигментов более удобно проводить на низши: позвоночных, где они часто представлены в эволюционно исходных формах,; сами животные являются удобным объектом экспериментальных исследова ний. Однако, изучение пигментации гидробионтов, в том числе и рыб, в значи тельной степени затруднено из-за отсутствия методов сохранения их естествен ной окраски.
Цель исследования: изучить функциональную роль пигментов и шп ментации рыб в течение их онтогенеза.
Задачи исследования: 1) идентифицировать спектрофотометрическк ми методами типы пигментов в живой развивающейся икре рыб; 2) определит концентрации и качественный состав каротиноидов в икре рыб разных эколс гических групп; 3) исследовать распределение каротиноидов в различны структурах икры в процессе эмбрионального развития рыб; 4) изучит метаболизм каротиноидов в эмбриогенезе рыб в норме и при воздействи различных факторов среды; 5) исследовать роль каротиноидов в водно-солево: обмене рыб; 6) выяснить функциональную роль каротиноидов в различны структурных элементах икры в эмбриогенезе рыб и значение пигментации кожных покровах рыб; 7) проанализировать видовую специфику, локализаціп в структурах икры и функциональную роль цитохромов в икре рыб; 8) разр; ботать принципы создания фиксирующих смесей, позволяющих сохранят естественную окраску рыб.
Научная новизна. Автором впервые показано, что каротиноиды в икг рыб существуют в трех формах: в свободной, этерифицированной и в вщ белково-каротиноидных комплексов. Витальными спектрофотометрическим
5 исследованиями установлено, что цвет икры рыб не отражает содержание в ней каротиноидных пигментов. Впервые на видовом и межвидовом уровнях выявлена положительная корреляция между концентрацией каротиноидов в икре рыб и ее размерами, а также длительностью эмбрионального развития. На основании установленных автором особенностей внутриклеточной локализации различных биохимических форм каротиноидов у разных видов рыб показано их неодинаковое функциональное значение в различных структурах развивающегося зародыша. Автором установлено, что набор пигментов в икре рыб не является для вида строго закрепленным признаком, а зависит от состава пигментов, поступающих в организм самок с пищей, от метаболических процессов с их участием и особенностей перераспределения каротиноидных пигментов между различными органами и тканями, включая транспорт из печени в яйцеклетки. Показано, что в эмбриогенезе рыб окисление каротиноидов до кетоформ есть спонтанный процесс и не является обязательным для эмбрионов всех видов рыб.
Установленные автором межвидовые и на видовом уровне различия качественного состава каротиноидов икры рыб и выявленные им особенности структурной организации молекул каротиноидов позволили показать отсутствие каких-либо циклов их превращения с использованием в обменных процессах кислородсодержащих группировок иононовых колец каротиноидов и впервые доказать их неучастие в процессах дыхания с переносом кислорода за счет преобразования кислородсодержащих группировок этих пигментов.
Впервые показано, что основную функциональную нагрузку в структуре молекулы пигмента несет система сопряжения, имеющая не менее девяти двойных связей, благодаря которой каротиноиды участвуют в кальциевом обмене клетки, обусловливая изменение цвета икры и адгезивности клеточного материала.
С участием автора впервые в икре сиговых рыб идентифицирован ци-тохром Ь-типа, показана его роль в метаболизме икринок и установлено, что он является признаком-маркером семейства сиговых. Проведенный автором
сравнительный эволюционно-морфологический и физиолого-биохимический анализ функциональных возможностей пигментов кожи рыб и их икры, позволил констатировать, что в икре пигменты осуществляют ограниченные функции, характерные для пигментной системы кожи рыб.
Практическая значимость. На основании исследования свойств и функций пигментов, определяющих окраску рыб, автором сформулированы теоретические основы методов длительного сохранения окраски рыб и других гидробионтов при их фиксации. Для этих целей предложены: оригинальный способ искусственной регуляции контракции и экспансии пигментных клеток кожи, хелаторы двухвалентных ионов, антиоксиданты, приемы стабилизации мембранных структур клеток. Созданы методы фиксации с сохранением естественной окраски для различных групп рыб и других гидробионтов, что нашло практическое применение при создании музейных экспозиций.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на коллоквиумах кафедры ихтиологии биологического факультета МГУ (1973, 1977), института биофизики РАН (1974), Всесоюзного научно-исследовательского института морского рыбного хозяйства и океанографии (ВНИРО) (1976), на Всесоюзных конференциях: "Биология промысловых рыб и беспозвоночных на ранних стадиях развития" (1974), "Вопросы раннего онтогенеза рыб" (1978), IV - VI Всесоюзных конференциях по "Экологической физиологии и биохимии рыб" (Астрахань, 1979; Киев, 1982; Вильнюс, 1985), на 3-ем Всесоюзном совещании "Проблемы раннего онтогенеза рыб" (Калининград, 1983), на 3-ем Всесоюзном совещании по лососевидным рыбам. (Тольятти, 1988), VI Конгрессе европейских ихтиологов (Budapest, 1988), на научной конференции Всесоюзного заочного института пищевой промышленности (ВЗИПП) (1988), Международном симпозиуме по биологии и разведению сиговых рыб (Cuebec, 1990), Международной научной конференции "Размножение рыб-92" (Vodnany, 1992), на 1 Конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), на международной научно-технической конференции Московского государственного заочного института пищевой промыпшен-
7 гости (МГЗИПП) "Приоритетные технологии в пищевой промышленности" 1998), на Всероссийском симпозиуме "Возрастная и экологическая физиология рыб" (Борок, 1998), на совместном заседании кафедры ихтиологии и рыбо-юдства Московского государственного заочного института пищевой промышленности (МГЗИПП), сотрудников кафедры ихтиологии Биологического факультета МГУ, Института проблем экологии и эволюции (ИПЭЭ РАН) и їсероссийского научно-исследовательского института морского рыбного хо-іяйства и океанографии (ВНИРО) (1998).
Публикации. По теме диссертации автором опубликовано 32 работы.
Структура и объем диссертации. Рукопись состоит из введения, мате-шала и методов исследования, 5 глав основной части и 3 глав приложения, іьіводов и списка литературы. Работа изложена на 458 машинописных траницах и содержит 24 таблицы, 65 рисунков. В списке литературы 870 юточников.
Изменения спектров поглощения света икринками в процессе эмбрионального развитии рыб
При выяснении функционального значения пигментов и пигментации в онтогенезе рыб в первую очередь нас интересовала физиологическая и биохимическая роль пигментов кожи взрослых рыб. Мы полагаем, что участие пигментов кожи в окраске рыб является их вторичной функцией. Высокое разнообразие групп пигментов в коже, сложность организации пигментов в пигментных клетках, способных изменять свой цвет в ответ на нервное или гуморальное воздействие едва ли могло возникнуть само по себе только лишь по причине необходимости тому или иному организму иметь определенный цвет. На наш взгляд, участию пигментов в окраске кожи предшествовали какие-то иные функции пигментов, обеспечивавшие физиологические особенности взаимодействия организма со средой, благодаря чему они собственно и были выведены на поверхность тела. Именно выяснению этих функций пигментов в физиологических отправлениях организма и посвящена данная работа.
Однако, выяснению эволюционно исходных биохимических возможностей и физиологических проявлений пигментов у взрослых рыб мешает их участие во вторичной функции, то есть в окраске, используемой разными видами в мимикрии, а также в территориальном, нерестовом и стайном поведении. Более того, часть из этих пигментов синтезируется в организме рыб, часть - попадает в организм только с пищей, что ставит содержание последних в зависимость от их наличия в пище и затрудняет изучение их функциональных возможностей.
Более ранние в филогенетическом плане функции пигментов, по нашему мнению, могут проявляться на более ранних этапах онтогенеза рыб, где их значение не связано с участием в покровительственной окраске. На ранних
этапах онтогенеза икринка, в отношении пигментов, является замкнутой системой. В ооцитах количество тех пигментов, которые поступают у взрослых рыб с пищей, зависит лишь от поступления их из тела самки в процессе оогенеза и имеет видовую специфику. Это позволяет оценить содержание пигментов и их качественный состав в икре в зависимости внутренних процессов, специфичных для разных видов рыб в их эмбриональном развитии, а также от внешних факторов среды. Именно по этим причинам мы изначально приступили к исследованию функционального значения пигментов в онтогенезе рыб на эмбриологическом материале.
Визуальные различия цвета и спектральные характеристики живой икры рыб различных экологических групп по размножению.
Визуальные различия цвета икры рыб. Икра рыб, относящихся к различным систематическим категориям и экологическим группам, также как и икра, полученная от разных самок в пределах одного вида, существенно различается по окраске.
Так, зародышевый диск яиц хрящевых рыб выделяется своей окраской: у японской рогатой акулы Heterodontus japonicus он красный, у других видов - оранжевый или ярко-желтый. Остальная часть яйца окрашена более бледно: у рогатой акулы и пилохвоста Pristiurus melanostomus в зеленовато-желтый, у электрического ската Torpedo ocellata - в бледно-желтый и у плащеносной акулы Chlamydoselachus anguineus - в розовый цвет (Nishikawa, 1898; Ruckert, 1899; Dean, 1901; Gudger, 1940; Smith, 1942).
Икра разных видов двоякодышащих отличается по окраске. У рогозуба, или австралийского чешуйчатника Neoceratodus forsteri яйца зеленовато-серые и анимальная область окрашена темнее вегетативной (Semon, 1903), у Lepidosiren paradoxa, напротив, анимальная область светлее - она почти белая, а вегетативная розовато-оранжевая, в соответствии с цветом желточных гранул (Kerr, 1900).
Икра хрящевых ганоидов окрашена в серо-коричневый или черный цвет, у многоперов - также сильно пигментирована, с зеленоватым оттенком (Semon, 1893; Kerr, 1900; Кочетов, 1991).
У ильной рыбы Amia calva окраска яиц серовато-коричневая, у панцирной щуки Lepisosteus osseus - желтоватая, у других видов - зеленоватая (Nelsen, 1953; Ballard, 1986; Кочетов, 1991), причем, анимальная часть имеет значительно более светлую пигментацию, чем богатая желтком вегетативная (Dean, 1896 а, 1896 Ь; Whitman, Eycleshymer, 1897). Зрелые яйцеклетки латиме-рии темно-красного цвета (Макушок, 1983; Baln, 1994).
У русского осетра из Черного и Азовского морей яйца, как правило, более интенсивно пигментированы, чем у особей из Северного Каспия и Куры. У альбиносов икра имеет бледно-желтую окраску. Черный пигмент неравномерно распределен по объему икры. Анимальная область обладает своеобразным рисунком со светлым полярным пятном в центре, окруженным скоплением пигментных зерен в виде кольца, другое пигментное кольцо находится на границе с вегетативной областью. У некоторых яиц между этими двумя кольцами имеется еще одно, промежуточное. Диаметр пятна, ширина и интенсивность пигментации концентрических темных и светлых колец варьирует в широких пределах не только в икре разных самок, но и в одной партии икры. Обычно анимальная область, в целом, бывает светлее равномерно окрашенной вегетативной, однако иногда она пигментируется настолько сильно, что становится темнее вегетативной, причем отдельные пигментные кольца оказываются неразличимыми и только в центре сохраняется светлое пятно. Индивидуальные различия в окраске яиц осетровых рыб не сказываются на их оплодотворяемости (Гинзбург, Детлаф, 1975).
Среди Араванообразных {Osteoglossiformes) икра гетеротиса Heterotis niloticus оранжевого цвета, рыб-ножей {Notopteridae) - желтоватая, в то время как у рыб-бабочек (Pantodontidae) - коричневая (Кочетов, 1991).
Икра костистых рыб в большинстве случаев пигментирована. Она может быть различных тонов и оттенков - от желтоватого и бледно-оранжевого (многие карповые) до малиново-красного (лососевые) цвета (Крыжановский, 1948, 1949; Соин, 1968а). Икра различных видов лососевых рыб имеет цвет от лимонно-желтого до оранжево-красного (Соин, 1954а,б, 1956, 19636, 1964а, 1980), а икра пелагических рыб обычно бывает от слабо-желтой до совершенно бесцветной (сайка - Boreogadus saidaдов бычков. Так икра из различных кладок байкальских Cottidae родов Cottocomephorus, Paracott). Особенно большое разнообразие окраски икры и ее оттенков наблюдается у различных ви us имеет самые различные оттенкж - коричневатый, желтый и даже зеленоватый (Соин 1962). Зеленоватый цвет характерен для икры некоторых видов карповых относящихся к (ЬитосЬильной группе рыб а также для иКРы некоторых видов сомовых, относящихся к фитофильно-гнездующим рыбам (Крыжановский, 1949;
Крыжановский и др., 1951). Особым разнообразием цвета икры обладают различные виды литофильно-охраняющей группы по размножению отряда Скорпе-нообразных (Соин, 1962; Соин, Микулин, 1974; Микулин, 1978; Микулин, Герасимчук, Дубровин, 1978; Микулин, 19816).
Икра сиговых рыб также окрашена весьма разнообразно: у ряпушки она имеет цвет от слабо-лимонного до ярко-оранжевого, у рипуса - от желтого до розового, у пеляди - от лимонного до ярко-оранжевого, у чудского сига - от желтого до почти коричневого, у муксуна - от слабо-желтого (почти белого) до ярко-оранжевого, у чира - от молочно-белого до слабо-желтого, у байкальского омуля - от светло-желтого до темно-оранжевого, почти вишневого (Лебедева, 1974; Черняев, 1982).
Таким образом, окраска икры разных видов рыб весьма разнообразна, что требует своего объяснения. Несомненный интерес представляет изучение пигментного состава икры рыб, обусловливающего столь высокое разнообразие ее цвета.
Спектральные характеристики живой икры рыб, относящихся по размножению к разным экологическим группам. Большое разнообразие окраски икры различных видов рыб трудно объяснить наличием только 2 основных групп пигментов - меланиновых, обусловливающих черный цвет икры осетровых, и каротиноидных, которые, находясь в свободном виде, обусловливают желтый и красный цвет икры некоторых видов рыб.
Распределение каротиноидов и их состояние в различных структурах икры
На основании комплексных исследований содержания каротиноидных пигментов в различных структурных элементах икринок рыб, относящихся к разным экологическим группам, мы пришли к следующим заключениям. У разных видов рыб каротиноидные пигменты находятся в различных структурах икринки, в неодинаковом количественном соотношении. В структурах развивающегося эмбриона они находятся в трех состояниях: в свободном виде или в этерифицированной форме, растворенные в жировых включениях или в мембранных структурах; в виде белково-каротиноидных комплексов. Эти данные указывают на различное функциональное значение каротиноидов в разных структурах икры.
Результаты исследований показали, что различия в распределении каротиноидов между структурными элементами икринок у разных видов рыб обусловлены как систематическим положением рыб (в желтке карповых рыб отсутствуют свободные жировые капли), так и экологическими условиями их развития. Наличие каротиноидов в плазменной части икринки в той или иной степени характерно для всех видов рыб. Содержание каротиноидов в собственно желтке находится в обратной зависимости от кислородных условий и величины омываемости водой икринок на нерестилищах, а также от уровня инсоляции в процессе развития рыб. Степень пигментации свободных жировых капель желтка находится в прямой зависимости от кислородных условий развития рыб а также от длительности эмбрионального развития.
131 2.3. Состав каротиноидов в икре и тканях рыб.
Каротиноиды - одна из наиболее распространенных групп пигментов среди живых организмов. Это весьма разнообразная группа веществ. К концу 70 годов она уже насчитывала свыше 400 природных каротиноидов с известной структурой (Isler, 1977). С развитием новых методов исследования количество вновь открываемых каротиновдов с неизвестной ранее структурой молекулы продолжает расти (Goodwin, 1984). Эта зависимость увеличения с годами числа свободных каротиноидов с известной структурой на фоне прогресса методической базы их изучения хорошо отражена в работе В.Н.Карнаухова (1988). Следует отметить, что в последние десятилетия помимо свободных каротиноидов в живых клетках обнаружены их гликозиды, а также соединения с жирными кислотами и белками (Физер, Физер, 1949; Троицкий, 1950, 1958; Троицкий, Тарасова, 1955; Lee, 1966; Cheesman et al., 1967; Zagalsky, Cheesman, Ceccaldi, 1967; Zagalsky, Ceccaldi, Daumas, 1970; Herring, 1971; Thommen, 1971; Nakagawa, Kayama, Asakawa, 1971, 1972, 1973, 1975; Gilchrist, Lee, 1972; Zagalsky, Herring, 1972; Fox, 1973; Феофилова, 1974; Микулин, Соин, 1975; Zagalsky, 1976; Мику-лин, 1978, 1993а; Микулин, Герасимчук, Дубровин, 1978; Чернухина и др., 1979).
Каротиноиды не синтезируются в организме животных (Sumner, Fox, 1933, 1935, цит. по Гудвину, 1953; Steven, 1949), но их молекулы в животном организме могут видоизменяться в процессе окисления или этерификации (Гудвин, 1953, 1954). Все разнообразие каротиноидов обеспечивается за счет их синтеза и преобразования в растительных клетках, грибах и бактериях (Чичестер, Накаяма, 1965; Феофилова, 1974; Воробьева, 1982; Goodwin, 1980).
В этом разделе мы попытаемся ответить на ряд вопросов, связанных с особенностями качественного состава каротиноидов в икре и теле рыб (табл. 12). Так не ясно, в чем причины различий качественного состава каротиноидов икры разных видов рыб? Почему набор каротиноидов в икре ниже, чем он представлен в природе? Каковы пути поступления и преобразования каротиноидов из пищи в тело рыб? Играет ли качественный состав каротиноидов и каждый пигмент в отдельности какую-либо функциональную роль? Качественный состав каротиноидов в икре рыб. Сравнивая качественный состав каротиноидов икры разных видов рыб (табл. 13, рис. 36) с использованием литературных данных (Glover et al., 1952; Czeczuga, 1971, 1979a, 1982a; Jutariu et al., 1978), следует отметить, что в икре встречается всего лищь около 40 каротиноидных пигментов из более чем 400 известных в природе (Isler, 1977), причем их состав в икре разных видов рыб существенным образом различается. Их количество у разных видов может быть от 1 до 13. В икры рыб из каротиноидов явно преобладают ксантофиллы. Из каротинов в основном встречается Р-каротин, из ксантофиллов - лютеин, зеаксантин, кантаксантин, астаксантин и тараксантин.
Следует отметить, что в более поздних работах обнаруживается большее разнообразие пигментов, чем в более ранних, что, по-видимому, отражает прогресс в методах выделения, разделения и идентификации каротиноидов. Поэтому мы провели исследования качественного состава каротиноидов икры рыб, относящихся к разным систематическим группам, по единой стандартной методике. Результаты показали (рис. 37), что в составе икры нет ни одного каротиноидного пигмента общего для икры всех исследованных видов рыб.
Каротиноиды в качестве антиоксидантов перекисного окисления липидов
Определение сырой массы икринок пинагора в процессе эмбрионального развития пинагора показало, что эта величина подвержена определенным изменениям. Сухая масса икринок сравнительно постоянна, поэтому изменения сырой массы почти целиком связаны с изменением содержания в икре воды.
Как видно на рисунке 40, после оплодотворения наблюдается уменьшение сырой массы икринок на 8-12%, что указывает на потерю икрой воды. По-видимому, происходит выход воды из желтка в образующееся перивителлиновое пространство, а затем во внешнюю среду. Образование перивителлинового пространства за счет воды желтка было отмечено у рыб (Соин, 1975). Изменение объема собственно яйца в процессе развития было показано у Fundulus hetero-clitus (на 40%), беломорской сельди (на 12-35%), балтийской трески (на 5-8%) (Зотин, 1961). Потеря воды икрой, по нашим наблюдениям, у пинагора продолжается до стадии 8 бластомеров после которой происходит довольно резкое увеличение содержания воды до стадии мелкоклеточной морулы или стадии кольтта а сырая масса иКРИНОК пРИ ЭТОм увеличивается на 9-19%) по стэавнению со стадией 8 бластомеров.
В опытах, проведенных на икре лосося, форели и сига, обнаружено (Зотин, 1955), что потребление воды из окружающей среды происходит только на первых стадиях развития, когда образуется перивителлиновое пространство. Мы установили, что сырая масса икринок пинагора меняется в процессе всего эмбрионального развития. Так, весь процесс эпиболии, который у пинагора продолжается до стадии образования глазных пузырей, характеризуется выходом воды из икринок, в результате этого сырая масса икринок становится приблизительно такой же, как и на стадии начала дробления. Дальнейшее развитие характеризуется увеличением сырой массы икры, то есть происходит поступление воды из окружающей среды в икринку. Оводненность при этом увеличивается на 13-20% по сравнению с концом этапа эпиболии, максимальная масса икринки достигается на стадии мощного развития кровеносной системы желточного мешка. К вылупленною эмбриона из оболочюи сырая масса икринки пинагора вновь уменьшается.
На рисунке 40 видно, что диапазон колебаний сырой массы икры пинагора значительно меньше (10-30% от максимальной массы), чем диапазон колебаний (рис. 39) содержания каротиноидов в икре (в расчете на сырую массу) во всех сериях опытов. Более того, сопоставляя степень оводненности икры с содержанием в ней каротиноидов, мы обнаружили прямую зависимость между этими величинами, то есть, чем больше оводненность икры, тем выше в ней концентрация каротиноидов. Следовательно, изменения сырой массы икры не могут являться причиной изменения концентрации каротиноидов в икре.
Описанные выше результаты показывают, что изменения сырой массы могут вносить ошибку (до 30%) в определение динамики содержания каротиноидов в икре. Учитывая это, мы измерили содержание каротиноидов в икре пинагора на разных стадиях развития в пересчете на одну икринку. Было установлено, что исходное количество каротиноидов в одной неоплодотворенной икринке в 5 сериях опытов находится в пределах от 1,44-10-5до6,26-10-5 мг. Как показано на рисунке 41 содержание каротиноидов в икринке не является постоянным в процессе эмбриогенеза а подвергается определенным изменениям. Интервал
Изменение концентрации цветных каротиноидов в икринке пинагора в процессе эмбрионального развития. Серия икры от самки; а, б - 1; в - 2; г - 3; д - 5; е - 4; ж - 6. а - каротиноиды экстрагированы ацетоном без предварительного обезвоживания икры; в-ж - каротиноиды экстрагированы ацетоном с предварительным обезвоживанием икры. Цифры на кривых - стадии развития (см. табл. 2). изменений количества каротиноидов, приходящихся на одну икринку, составляет в разных сериях опытов от 15 до 60% от максимального содержания.
Сразу после оплодотворения, в процессе набухания икры и первых стадий дробления до стадии 8 бластомеров наблюдается уменьшение (на 16-22%) количества каротиноидов, содержащихся в одной икринке. На последующих стадиях этапа дробления происходит постепенное увеличение содержания пигмента, которое становится максимальным к стадии мелкоклеточной морулы. В это время количество каротиноидов в икринке возрастает на 57-60% по сравнению со стадией 8 бластомеров. При переходе от мелкоклеточной морулы к бластуле содержание каротиноидов снова уменьшается, а затем к переходу от бластулы к эпиболии повышается до прежнего уровня. В процессе эпиболии вновь наблюдается уменьшение, а с переходом икры на этап органогенеза -увеличение содержания каротиноидов в икринке, которое продолжается до начала формирования кровеносной системы зародыша. С развитием кровеносной системы зародыша увеличение количества каротиноидов в икринке прекращается; в дальнейшем содержание каротиноидов начинает уменьшаться вплоть до вылупления предличинки из оболочки.
Надо отметить, что в процессе развития икры, полученной от разных самок, первые максимумы содержания каротиноидов в икринке приурочены к одним и тем же стадиям: конец дробления и бластула, в то время как следующий максимум содержания каротиноидов в икринке в икре от разных самок приходится на разные стадии: образования глазных бокалов, начала пульсации сердца, закладки печеночно-желточной вены.
Следует отметить, что во всех сериях опытов содержание каротино идов, в одной икринке, достигающее максимапьного значения на стадиях мелкоклеточной морулы и стадии закладки кровеносной системы, имеет весьма близкие значения.
Во всех сериях опытов наблюдается прямая зависимость между содержанием каротиноидов в икринке и оводненностью последней в процессе эмбрионального развития (см. рис. 40 и 41), то есть, чем выше оводненность икринки, тем выше в ней концентрация каротиноидов. При исследовании икры, полученной от разных самок, с целью выяснения изменения ее сырой массы и содержания в ней каротиноидов обнаруживается прямая корреляция между пределами изменения сырого веса икры и пределами изменений в ней концентрации каротиновдов.
Сравнение динамики содержания каротиноидов в одной икринке пинагора с перераспределением каротиноидов между желтком и плазменной частью (в %) икры показало, что изменение содержания каротиноидов на ранних стадиях развития до этапа эпиболии происходит, по-видимому, исключительно за счет пигментов белково-каротиноидных комплексов желтка, в то время как на последующих стадиях оно, вероятно, определяется как пигментами желтка, так и пигментами тела зародыша.
Содержание каротиноидов в жировых каплях икры пинагора на всем протяжении развития остается постоянным и, следовательно, не оказывает влияния на общую динамику содержания каротиноидов.
Одной из возможных причин изменения количества каротиноидов в икре может также быть их различная экстрагируемость на разных стадиях разви 164 тия икры. Для выяснения этого вопроса мы провели экстрагирование каротино идов из икры пинагора на стадии глазных пузырей несколькими методами (стадия глазных пузырей характеризуется низким содержанием каротиноидов при экстрагировании их ацетоном). Равные навески икры экстрагировали ацетоном, смесями хлороформ-метанол (2:1), ацетон - петролейный эфир (1:1), а также ацетоном с предварительной фиксацией икры глютаральдегидом, ацетоном с предварительным обезвоживанием икры самим ацетоном в течение 1 ч. Полученные результаты показали, что каротиноиды наиболее легко экстрагируются ацетоном при условии предварительного обезвоживания икры самим ацетоном; минимальная экстракция отмечена при обработке ацетоном без предварительного обезвоживания икры. Остальные способы экстрагирования дают промежуточные результаты.
Изменение содержания каротиноидов в процессе развития икры пинагора выявляется как при обычном способе их экстрагирования ацетоном (растирание икры в ступке с последующим добавлением к икре ацетона), так и при экстрагировании ацетоном с предварительным обезвоживанием икры самим ацетоном (икру выдерживали около 1 ч в ацетоне и затем растирали). Эти данные показывают (рис. 41 а б) что выявленная нами динамика содержания каротиноидов в икре обнаруживается при любом способе экстрагирования хотя различные способы экстрагирования каротиноидов из икры приводят к несколько различающимся по абсолютным значениям результатам.
Функциональная роль цитохрома Ь56о в икре сиговых рыб
Меланины являются полимерами хиноидных соединений. Классическая структура меланина - это длинноцепочечный полимер, состоящий из индо-лил-5,6-хиноновых единиц или его восстановленных производных. В составе эумеланина может присутствовать небольшое число пиррольных мономеров, образующихся, по-видимому, из индольных предшественников. Исследования с помощью электронного парамагнитного резонанса указывает на присутствие небольшого количества свободных радикалов, возможно, полухиноновых структур. С эумеланином могут быть связаны тяжелые металлы: медь, цинк или железо. Полимерная цепь меланина бывает разветвленной. В меланофоре меланины связаны с белком, возможно, через сульфгидрильную группу цистеина (Thomson, 1962;Nicolaus, 1968; Swan, 1974; Бриттон, 1986).
Меланофоры и эритрофоры имеют звездчатую форму, ксантофоры -округлую, часто с амебовидными выростами. Меланофоры в коже рыб располагаются в верхнем слое собственно дермы, около эпвдермиса, иногда - и в верхнем, и нижнем слое дермы. По мнению В.В.Васнецова (1934) пигментные клетки у высших позвоночных могут находиться и в эпидермисе но у рыб это явление встречается редко. У двоякодышащих - Neoceratodus forsteri меланофоры располагаются как в эпидермисе, так и в дерме (Imaki, Chavin, 1975a,b). Эритрофоры и ксантофоры обычно расположены в собственно дерме и редко бывают в верхнем, попэаничном с эпидермисом слое (Frisch 1912).
В ксантофорах и эритрофорах преобладающими пигментами являются каротиноиды, растворенные в жирах. Ксантофоры преимущественно содержат лютеин, а эритрофоры - астаксантин (Яржомбек, 1970; Fox, 1957). В состав жировых включений этих пигментных клеток входят каротиноиды в свободном и этерифицированном виде. Кроме них в этих клетках могут находиться птерины, как без каротиноидов, так и в комбинации с ними. Птерины в этих клетках локализованы в специализированных небольших органеллах, называемых птериносо-мами, которые расположены по всей цитоплазме. Даже у видов, которые окрашены главным образом каротиноидами, в развивающихся ксантофорах и эритрофо-рах сначала синтезируются и становятся видимыми птерины, тогда как каротиноиды, которые должны быть получены из пищи, выявляются лишь позднее.
Птерины или 2-амино-4-гидроксиптеридин обеспечивает желтую, оранжевую или красную окраску у ряда групп рыб, а также у амфибий и рептилий. Наиболее часто встречаемые птерины у рыб это сепиаптерин (рис. 17, в) и димеры дрозоптеринового типа (рис. 17, б). Интересно отметить, что биоптерин является кофактором при гидроксилировании фенилаланина с образованием тирозина - предшественника меланина.
Птерины - амфотерные молекулы со слабыми кислотными и основными свойствами. Они плохо растворимы в воде, хорошо растворимы в разбавленных щелочах и кислотах, умеренно растворимы в полярных органических растворителях и нерастворимы в неполярных. Большинство птеринов являются потенциальными окислительно-восстановительными агентами, однако, при физиологических парциальных давлениях кислорода они полностью окислены. Птерины в целом отличаются фотолабильностью. Максимум поглощения света птерином в значительной степени зависит от рН окружающей среды (рис.18) хотя сдвиги максимумов обычно не превышают 40 нм в диапазоне pH от 1 до 13. В хроматофорах птерины обычно поглощают свет в более длинноволновой части спектра, чем птерины в растворе. Это видимо, связано с тем, что в клетке они или связаны с белком или чем-то стабилизированы в кетохино-идной таутомерной форме (рис. 17, г). Большинство птеринов флюоресцируют в УФ-свете, причем их полосы испускания сдвинуты на 150-200 нм в длинноволновую область по сравнению с соответствующими полосами поглощения. Птерины, связанные с белками, не флюоресцируют (Ziegler, 1961, 1965; Ziegler, Harm-sen, 1969; Brown, 1971;Pfleiderer, 1975; Kisliuk, Brown, 1979; Бриттон, 1986).
Синтез птеринов происходит через пуриновые (гуанин) промежуточные продукты (Мецлер, 1980).
Гуанофоры (иридофоры) по форме и размерам весьма разнообразны. Они располагаются в особом нижнем слое дермы, называемом аргентеум или сразу под ним. В состав гуанофоров входят кристаллы гуанина. Гуанин относится к пуриновым основаниям. В присутствии азотистой кислоты гуанин превращается в ксантин. Структура молекулы гуанина в кислой, нейтральной и щелочной средах существенно изменяется (рис. 62).
Гуанин не поглощает видимый свет, о для него характерно сильное поглощение в УФ-свете (Бриттон, 1986). Шестигранные кристаллы гуанина располагаются в плазме гуанофоров и, благодаря токам плазмы, могут концентрироваться или распределяться по клетке. Это обстоятельство, с учетом угла падения света, приводит к изменению цвета покровов рыбы от серебристо-белого до синевато-фиолетового и сине-зеленого. Так, по нашим данным, блестящая сине-зеленая полоса обыкновенного неона Paracheirodon innesi под действием электрического тока приобретает блеск красного цвета, подобно эритрозонусам
У различных рыб голубая и синяя окраска поверхности тела достигается разными способами. Так, у рыбы-хирурга Paracanthurus hepatus голубая окрас-ка обусловлена расположением в коже округлых гуанофоров (иридофоров) с подстилающим их слоем меланофоров, причем, голубая окраска возникает за счет интерференции света в многослойных тонких пластинках кристаллов гуанина в гуанофорах, а синяя окраска обеспечивается меньшим количеством гуанофоров (Fox 1953; Makoto, Toyohara et al., 1994). Однако, у представителей рода Synehiropus (Callionymidae) голубой цвет кожи обеспечивается особыми хроматофорами - "цианофорами", по структуре клеток похожими на меланофоры, но имеющими меньшее количество дендритных отростков. Многочисленные пигментные органоиды - "цианосомы" этих клеток содержат волокнистый материал, отражающий голубой цвет (Goda, Fujii, 1995; Makoto, Fujii, 1995).
