Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Рыбоводно-биологическая характеристика стерляди 11
1.2 Сравнительная характеристика адаптационных возможностей осетровых рыб
и других объектов рыбоводства при воздействии различных факторов среды 15
1.2.1 Влияние температуры 15
1.2.2 Влияние уровня насыщения воды кислородом 18
1.2.3 Влияние величины водородного показателя 20
1.2.4 Влияние солёности 21
1.2.5 Влияние уровня воды и водообмена
1.3 Морфофизиологические основы адаптации рыб 28
1.4 Гематологические основы адаптации рыб
1.4.1 Особенности функционирования системы красной крови 32
1.4.2 Сывороточный белок крови рыб 34
1.4.3 Особенности функционирования системы белой крови
1.5 Иммунологические основы адаптации рыб 38
1.6 Влияние биостимуляторов на организм рыб 41
1.7 Гидрологическая и гидробиологическая характеристика разнотипных водоёмов 46
1.7.1 Куршский залив 46
1.7.2 Карьер «Прибрежный» 50
1.7.3 РекаНемонин 54
Глава 2. Материал и методика 58
Глава 3. Адаптационные возможности молоди стерляди в условиях различных рыбоводных систем 69
3.1 Особенности роста и выживаемости молоди стерляди при выращивании в экспериментальных установках с замкнутым циклом водообеспечения (УЗВ) 69
3.2 Особенности роста и выживаемости молоди стерляди при выращивании в бассейнах и садках 79
3.3 Сравнительная характеристика роста и жизнестойкости молоди стерляди в различных условиях выращивания 95
3.4 Оценка роста и жизнестойкости сеголетков стерляди при содержании в зимний период в УЗВ и садках, установленных в водоёме с естественным температурным фоном воды 101
3.5 Влияние солёности на рост и жизнестойкость молоди стерляди 103
3.6 Влияние величины водородного показателя на рост и жизнестойкость молоди стерляди 111
Глава 4. Морфофизиологическая характеристика сеголетков стерляди 114
4.1 Органо-соматические индексы сеголетков стерляди 114
4.2 Влияние солёности на морфофизиологические показатели сеголетков стерляди 117
4.3 Влияние аскорбиновой кислоты на физиологическое состояние сеголетков стерляди 120
Глава 5. Физиологические показатели адаптации молоди стерляди 125
5.1 Гематологические показатели сеголетков стерляди, выращенных в различных рыбоводных системах 125
5.2 Влияние солёности на гематологические показатели сеголетков стерляди при кратковременном и длительном воздействии 133
5.3 Влияние различных значений водородного показателя (рН) на гематологические показатели сеголетков стерляди 139
5.4 Влияние аскорбиновой кислоты на гематологические показатели сеголетков стерляди 143
5.5 Иммунологические показатели сеголетков стерляди, выращенных в различных рыбоводных системах 146
5.5.1 Влияние условий выращивания на фагоцитарную активность лейкоцитов крови 146
5.5.2 Влияние условий выращивания на концентрацию у-глобулинов во внутренних органах сеголетков стерляди 148
5.6 Влияние солёности на иммунологические показатели сеголетков стерляди 158
5.6.1 Влияние солёности на фагоцитарную активность лейкоцитов крови 158
5.6.2 Влияние солёности на концентрацию углобулинов в организме сеголетков стерляди 160
5.6.3 Влияние солёности на концентрацию лизоцима во внутренних органах сеголетков стерляди 163
5.7 Влияние аскорбиновой кислоты на иммунологические показатели сеголетков стерляди 173
5.7.1 Влияние аскорбиновой кислоты на фагоцитарную активность лейкоцитов крови 173
5.7.2 Влияние аскорбиновой кислоты на концентрацию у-глобулинов 175
5.7.3 Влияние аскорбиновой кислоты на концентрацию лизоцима 178
Заключение 187
Выводы 188
Практические рекомендации 190
Список использованных источников 191
- Влияние величины водородного показателя
- Особенности роста и выживаемости молоди стерляди при выращивании в бассейнах и садках
- Влияние солёности на морфофизиологические показатели сеголетков стерляди
- Влияние солёности на гематологические показатели сеголетков стерляди при кратковременном и длительном воздействии
Введение к работе
Актуальность темы. Снижение в последние 30 лет вылова ценных видов рыб (угорь, рыбец, сиг, налим, щука, линь и др.) в весовом выражении более чем в 19, в стоимостном в 44 раза в основном рыбохозяйственном водоёме Калининградской области - Куршском заливе (площадь около 150 тыс. га.), слабое развитие аквакультуры (годовой объём выращивания товарной рыбы около 30 т) делают актуальным поиск решений проблемы низкорентабельного промысла и недостаточного потребления населением региона продукции из живой рыбы, учитывая физиологически обоснованную норму - 3-5 кг на душу населения в год [Хрусталёв, 2003; Воспроизводство … , 2008].
Очевидно, что в первом случае это возможно за счет искусственного воспроизводства ценных видов рыб и зарыбления рыбохозяйственных водоёмов, во втором, в результате увеличения объёмов выращивания товарной рыбы. При этом важно учитывать, что наибольшую перспективу представляют рыбы, которые могут выступать как объекты искусственного воспроизводства, так и товарного выращивания. Это согласуется с современными тенденциями, когда рыбоводные предприятия всех форм собственности и направлений своей деятельности, работают по принципу самоокупаемости и заинтересованы в разнообразии путей реализации своей продукции. К таким рыбам, прежде всего, относится стерлядь, западная граница ареала которой включает бассейн реки Неман, но которая никогда не была объектом промышленного рыболовства и рыбоводства не только в Калининградской области, но и в Прибалтике в целом [Скорняков, 1986; Обоснование сохранения … , 2004; Хрусталёв, Величко, 2006]. Обладая исключительными рыбоводно-биологическими и пищевыми особенностями, обеспечивающими её высокую стоимость, стерлядь может занять значимое место в пастбищном, товарном рыбоводстве и рекреационном рыболовстве на территории Калининградской области и стать, с одной стороны, одним из экономикообразующих объектов промысла, с другой, высокорентабельным объектом товарного выращивания.
Введение радужной форели в рыбохозяйственный оборот на территории Калининградской области началось в 70-х годах прошлого столетия, что было приурочено к освоению ресурсов пресноводных и солоноватоводных водоёмов. Накопленный опыт показал, что реальные достижения в товарном выращивании, формировании и эксплуатации маточных стад, стали возможными на базе правильной оценки адаптационных возможностей молоди на первом году жизни и создания эффективных технологий выращивания посадочного материала [Хрусталёв, 1986; Хрусталёв и др., 2007]. Это определяет актуальность и целесообразность установления адаптационных возможностей молоди стерляди, при выращивании в разнотипных рыбоводных системах, а также обоснования технологических схем выращивания посадочного материала, что позволит заложить основу для организации пастбищного и товарного выращивания стерляди на территории Калининградской области.
Цель и задачи работы. Целью данной работы была оценка адаптационных возможностей молоди стерляди при её выращивании в различных рыбоводных системах в условиях воздействия различных факторов абиотической и биотической природы. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
- выявить особенности роста и выживаемости молоди стерляди при выращивании в различных рыбоводных системах;
- оценить влияние температуры, солёности, величины водородного показателя (рН), аскорбиновой кислоты на рост и жизнестойкость молоди стерляди;
- определить морфофизиологический, гематологический и иммунологический статус сеголетков стерляди, выращенных в различных рыбоводных системах.
Научная новизна и теоретическое значение работы. Выявлены особенности роста, выживаемости и физиологического состояния молоди стерляди при выращивании в разнотипных рыбоводных системах. Оценено влияние солёности, величины водородного показателя (рН) и аскорбиновой кислоты на рост, жизнестойкость и физиологическое состояние сеголетков стерляди.
Впервые определён гематологический, иммунологический и морфофизиологический статус сеголетков стерляди при выращивании в разнотипных рыбоводных системах на территории Калининградской области. Раскрыты адаптивные возможности естественной резистентности молоди стерляди при влиянии различных факторов.
Практическое значение работы. Результаты проведённых исследований позволили выбрать наилучшие рыбоводные системы для получения посадочного материала стерляди в условиях Калининградской области. Результаты экспериментов прошли апробацию на предприятии ООО «КМП Аква» при формировании ремонтно-маточного стада и выращивании товарной стерляди и на нерестово-выростном хозяйстве ОАО «Калининградский Центр Аквакультуры» при выращивании товарной стерляди. Достижения работы использованы в разработанном в рамках проекта Тасис 2007/138-583 «Стимулирование использования ресурсов рыбного хозяйства в регионе Соседства» научно-техническом обосновании рыбоводного комплекса по выращиванию посадочного материала осетровых и угря на польдерных землях.
Создана электронная база гематологических, морфофизиологический и иммунологических показателей молоди стерляди для условий Калининградской области, которые могут быть использованы для сравнительной оценки посадочного материала, используемого в товарном рыбоводстве региона.
Материалы диссертации могут быть использованы в товарном рыбоводстве, а также в учебном процессе при подготовке в вузах бакалавров, дипломированных специалистов и магистров по направлению и специальности «Водные биоресурсы и аквакультура». Материалы диссертации применяются при подготовке в ФГОУ ВПО «КГТУ» бакалавров и магистров рыбного хозяйства по направлениям 110900.62 и 110900.68 - «Водные биоресурсы и аквакультура».
Защищаемые положения:
- адаптационные возможности молоди стерляди, проявляющиеся в её росте и жизнестойкости, имеют различный уровень разрешения в условиях разнотипных рыбоводных систем;
- особенности адаптивной реакции молоди стерляди на температуру, солёность, величину водородного показателя (рН) воды, концентрацию аскорбиновой кислоты позволяют определить и рекомендовать предпочтительные режимы выращивания;
- связь величины органо-соматических индексов органов молоди стерляди с условиями выращивания позволяет выбрать наилучшие рыбоводные системы для получения посадочного материала;
- особенности гематологического и иммунологического статуса молоди стерляди при выращивании в различных рыбоводных системах.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на заседаниях и научно-методических семинарах кафедры аквакультуры ФГОУ ВПО «КГТУ» (2005-2008 гг.); на Международной научной конференции, посвящённой 75-летию основания КГТУ и 750-летию Кёнигсберга-Калининграда «Инновации в науке и образовании-2005» (Калининград 19-21 октября); на IV Международной научно-практической конференции «Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы развития» (Астрахань, 13-15 марта 2006 г.); на IV Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании-2006» (Калининград, 18-20 октября); на научно-практической конференции «Результаты и перспективы акклиматизационных работ» (Клязьма, 10-13 декабря 2007 г.); на Международном симпозиуме «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоёмов аридного климата» (Астрахань, 2007); на международных семинарах и учебном тренинге, проводимых в рамках проекта ТАСИС № 2007/138-583 (Калининград, 2007); на VI юбилейной Международной научной конференции, посвящённой 50-летию пребывания КГТУ на Калининградской земле «Инновации в науке и образовании-2008» (Калининград, 21-23 октября); на Международной научной конференции «Actual status and active protection of sturgeon fish populations endangered by extinction» (Olsztyn 5-7th March 2008). Основные положения диссертационной работы были представлены в номинации «У.М.Н.И.К. – 2007», проводимой в рамках V Международной научно-практической конференции «Инновации в науке и образовании – 2007» (Калининград-2007).
Декларация личного участия. Автор лично участвовал в сборе, обработке и анализе материалов в 2005-2007 гг. Дал оценку адаптационным возможностям естественной резистентности молоди стерляди при выращивании в различных условиях. Разработал схему исследования и провёл эксперименты по изучению влияния различных факторов на молодь стерляди, включая оценку её состояния по морфофизиологическим, гематологическим и иммунологическим показателям. Внедрил результаты исследований на предприятии ООО «КМП-Аква» при формировании ремонтно-маточного стада и выращивании товарной стерляди.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них две в издании, рекомендованном ВАК.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 209 страницах, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 253 работ, включая 23 иностранных, содержит 35 таблиц и 87 рисунков.
Влияние величины водородного показателя
Но влияние солёности на рыб следует рассматривать не только с позиции оценки ростового эффекта, но и учета жизнестойкости. Только в этом случае можно предполагать конкретную реакцию адаптационной системы рыб на воздействие той или иной солёности.
В вопросе оценки влияния солёности на жизнестойкость рыб также просматривается неоднозначная ситуация. Так, ряд авторов отмечает, что, например, у радужной форели на первом году жизни выживаемость при повышении солёности выше 6%о снижается [Alabaster, 1967; Potts, 1969; Otto, 1971; Zeitoun, 1974]. В то же время другие допускают, что это может иметь место на эмбриональных, личиночных и части мальковых этапах развития. Но в дальнейшем у молоди развивается адаптационная система, позволяющая ей приспосабливаться к солёности до 10%о. Рыбы же массой более 50 г способны жить при солёности 20-25%о и даже океанической (35-37%о). При этом в первую очередь выделяют ростостимулирующий эффект солёности [Мс Кеоп, 1972; Zeitoun, 1974; Хоар, 1983].
Интерес представляют также данные о снижении выживаемости в солоноватой воде (до 6%о) у двух-трёхлетков радужной форели [Романычева, 1983; Teskeredzic, 1984]. В качестве обоснования этого рассматривается очевидная связь смолтификационных и десмолтификационных изменений, наблюдаемых у форели с годовалого возраста в апреле-июне. Суть их такова, что солёность, даже если она низкая, стимулирует у форели весной смолтификационные изменения, связанные с перестройкой физиолого-биохимических процессов в организме [Zaugg, 1972; Effects of dietary ... , 1975]. Но они находят окончательное разрешение, если солёность поднимается выше 7-10%о. Если же, как в рассматриваемом случае, солёность остается ниже 7%о, то на смену смолтификационным идут десмолтификационные изменения, действие которых преследует обратную цель - восстановление физиолого-биохимического статуса, что в дальнейшем будет способствовать разрешению биологического потенциала рыб при жизни в пресной воде. Поэтому, именно на период май-июнь, несмотря на стабильный в это время гидрологический режим, у форели в возрасте годовиков и старше отмечаются наибольшие в сезоне потери поголовья.
Из отмеченного можно заключить, что у лососевых (на примере радужной форели) на первом году жизни в условиях солёности до 6%о сохраняется высокая жизнеспособность, при дальнейшем повышении солёности она снижается. У форели старшего возраста в условиях солёности до 7%о жизнестойкость ниже, чем в пресной воде. Но очевидно, что у многих представителей лососевых ввиду различной экологии не столь однозначные реакции на действие солёности как во временном плане, так и в степени её восприятия на различных этапах онтогенеза.
Среди осетровых также большинство составляют проходные виды рыб (белуга, калуга, русский, сибирский, сахалинский, и атлантический осетр, севрюга и т.д.), хотя некоторые из них эволюционно, в значительной части популяций, привязаны к жизни в пресной воде (ленский, байкальский и амурский осетр). А стерлядь признается единственным типичным пресноводным объектом среди осетровых. Хотя в отдельных источниках отмечается присутствие её в уловах в Каспийском и Азовском морях [Васильева, [27,28] 2000]. Это не следует рассматривать как нечто неординарное. Во многих морях в эстуарных и лиманных опресненных водах нагуливаются многие пресноводные рыбы (судак, лещ, вобла, тарань, карась, чехонь и др.), а на большей части прибрежной зоны Балтийского моря с солёностью до 7-9%о постоянно нагуливаются судак, лещ, окунь, угорь и другие, чисто пресноводные рыбы, а на зимовку и нерест они возвращаются в пресные, или распресненные до 2-3 %о, воды заливов и рек [Хрусталёв, 1986; Хлопников, 1994].
У проходных осетровых пресноводный период жизни молоди сравним с таковым у кеты и горбуши. Но основные различия проявляются в размерном составе скатывающейся в море молоди и степени развитости осморегуляторной системы. Очевидно, что она у кеты и горбуши в возрасте 2-4 месяцев, несмотря на малые размеры (0,3-1 г) более развита, поскольку позволяет быстро, в течение нескольких недель преодолеть барьер (градиент) солёности от 0 до 25-37%о.
Осетровые, нерестящиеся в более кормных водоёмах, чем лососевые, имеют возможность в период ската интенсивно кормиться и ко времени попадания в море молодь набирает массу 3-7 г [Воспроизводство осетровых ... , 1992]. Но осморегуляторный механизм не позволяет им приспособиться к солёности выше 18-20%о [Мильштейн, 1972; Иванов, 2003]. Это правило относится к осетровым азово-черноморского, каспийского бассейнов (до 70-х годов - Аральского моря) и р. Амур, которые в силу эволюционных особенностей не смогли приспособиться к жизни в более солёной воде. Но, с другой стороны, пример атлантического, сахалинского, некоторых представителей североамериканских осетров показывает, что они по степени проявления имеют осморегуляторную систему сравнимую с лососями, что позволяет им совершать длительные миграции в градиенте солёности 0-37%о [Моисеев, 1981; Кольман, 2006; Kolman, 2006].
Интересно и то, что в возрасте 1-2 месяцев искусственно выращенная молодь белуги, осетра, севрюги по достижении массы 3-7 г предпочитает солёность 10%о более низким значениям [Поддубный, 1988]. А это даёт основание полагать, что к этому моменту у молоди достигается пик смолтификации и при подтверждении соответствующими экологическими условиями она может осваивать нагульный биотоп в пределах ареала. Очевидным представляется, что на данном примере подтверждается решающее влияние размера молоди, а значит уровня развития жизненных систем, на готовность её к жизни в море.
Относительно стерляди стоит отметить, что если учитывать чисто пресноводный её статус, то к ней применимы положения о стимулирующем влиянии солёности в диапазоне значений 0 - 4(6)%о. А для Азовского и Каспийского морей, в воде которых ионный (хлорный) коэффициент выше, чем в других морях, в том числе в Балтийском (1,91 против 1,85), допустим диапазон 0-7(9)%о [Барсуков, 1959]. Это имеет отношение к многочисленным пресноводным рыбам, в том числе постоянно или эпизодически на период нагула населяющим солоноватоводные районы морей.
Но если стерлядь эволюционно рассматривают как жилую форму некогда имевшейся проходной, то в этом случае её реакция на солёность должна раскрываться в большем диапазоне и степени проявления. Но до настоящего времени этот вопрос изучен слабо.
В заключение следует отметить, что своеобразие действия солёности на рыб в пределах их приспособляемости, когда она оказывает стимулирующее влияние, основано не только на возбуждении нейро-гуморальной системы, но и увеличении количества хлоридных клеток в эпителии жабр, ротовой полости, пищевода, что усиливает минеральный обмен. Одновременно происходит разрастание эпителия слизистой оболочки кишечника, что способствует не только всасыванию воды, но и усилению пищеварения.
Особенности роста и выживаемости молоди стерляди при выращивании в бассейнах и садках
Для оценки роста и жизнестойкости сеголетков стерляди в зимний период, в том числе рассматривая перспективу использования выращенного посадочного материала для целей формирования ремонтно-маточного стада, часть рыб, была переведена на содержание в бассейны, установленные в лаборатории кафедры аквакультуры и садки НВХ «Прибрежное». Бассейны УЗВ имели размеры 1 х 1 х 0,4 м, с уровнем воды 0,3 м.
В течение августа-апреля в бассейнах УЗВ поддерживалась относительно высокая температура воды (табл. 18). Контрольные обловы в бассейнах и садках проводили раз в месяц, результаты фиксировались в рыбоводных журналах. По данным контрольных обловов рассчитывали величину относительного среднесуточного прироста и общего продукционного коэффициента массонакопления.
В 2006 г. молодь стерляди, средней массой 1 г, после завершения периода адаптации, была разделена на несколько групп и помещена в экспериментальные УЗВ для проведения серий экспериментов по изучению её адаптационных возможностей. Для этого были поставлены эксперименты по влиянию различных уровней солёности, величины водородного показателя, а так же различных концентраций аскорбиновой кислоты при кратковременном и длительном воздействии на её рост и физиологическое состояние. Все эксперименты были проведены в двойной повторносте.
Влияние солёности изучали в эксперименте в течении 14 и 100 суток. Солёность создавали в рыбоводных ёмкостях экспериментальных УЗВ в концентрациях 3 и 6%о. Для этого, как и в предыдущем году, солёность создавали путем разведения морской соли в маточные растворы заданных концентраций. Далее при помощи откалиброванных ареометров путем прибавления маточного раствора в рыбоводные ёмкости поддерживали необходимый уровень солёности. Уровень солёности контролировали ежедневно и доводили необходимых значений нормы после чистки и замены части воды в УЗВ.
Влияние на молодь стерляди аскорбиновой кислоты как биостимулятора при добавлении её в воду изучалось в концентрации 2 и 5 мг/л воды рыбоводной ёмкости. Аскорбиновую кислоту вносили после чистки рыбоводных ёмкостей. На 30 мин выключали аэрацию, вносили рассчитанную дозу и затемняли рыбоводную ёмкость. Изучали кратковременное (14 суток) и долговременное (100 суток) влияние аскорбиновой кислоты.
В 2007 г. молодь стерляди средней массой 2 г была доставлена из НПЦ «БИОС» (г. Астрахань). Эксперименты с этой молодью были направлены на установление адаптационных возможностей в условиях воздействия водородного показателя (рН) в диапазоне значений 7-9 в течение 100 суток. Эксперимент проводился в экспериментальных УЗВ смонтированных как и для предыдущих опытов в аквариальной кафедры аквакультуры ФГОУ ВПО «КГТУ».
Для оценки влияния различных уровней водородного показателя (рН 7, 8 и 9) были выбраны природные значения не летальные для рыб, которые так же соответствуют естественному уровню показателя в разное время года в Куршском заливе и реке Немонин. Контролем являлась слабокислая среда (естественная для УЗВ от 6,0 до 6,7). Для создания и поддержания соответствующего уровня рН в рыбоводных ёмкостях первоначально создавался маточный раствор с соответствующим значением, при помощи 2% раствора NaOH. Далее из маточного раствора в специальной ёмкости создавался рабочий раствор, которым и поддерживали соответствующий уровень рН в экспериментальных УЗВ. Измерения рН проводили два раза в сутки и при необходимости корректировали величину показателя до нужного значения. Аналогично поступали после чистки рыбоводных ёмкостей и биофильтров. Измерения уровня водородного показателя проводили до десятых при помощи рН-метра «Экотест-2000». Эксперимент продолжался 100 суток.
В 2007 г. аналогично заданному в 2006 г. алгоритму провели на той же экспериментальной базе опыт по влиянию солёности на рост и жизнестойкость молоди стерляди, доставленной из НПЦ «БИОС», предполагая возможность наличия солоноватоводной популяции стерляди в южной части р. Волга. Соответственно этому преследовалась цель проанализировать данные экспериментов, проведённых в течение 3 лет.
При проведении всех экспериментов раз в декаду проводили контрольные взвешивания, отлавливали рыбу и взвешивали её на электронных весах. Все данные заносились в рыбоводный журнал. На основании полученных данных рассчитывали показатели темпа роста по величине относительного среднесуточного прироста и коэффициента массонакопления (формулы 1 и 2).
По истечении срока всех запланированных экспериментов изучали физиологические показатели молоди стерляди. Изучение физиологического статуса проводили в три этапа. Первым этапом было прижизненное взятие крови и проведение гематологического анализа, вторым этапом являлось изучение морфофизиологических показателей молоди стерляди, третьим заключительным этапом исследований было исследование иммунологических показателей.
Важнейшими показателями, позволяющими определить физиологический статус выращенных сеголетков стерляди, являются гематологические. Кровь для анализа брали из хвостового гемального канала с помощью шприца. Для гематологических исследований брали клинически здоровых рыб. Стерлядь отлавливали непосредственно перед проведением исследования. Все исследованные рыбы были активные, после взятия крови отхода не зафиксировано. Кожные покровы рыб были в норме, мускулатура упругая, жабры полнокровные, ало-красного цвета, жаберные лепестки лежали параллельно, роговица глаз прозрачная. Гематологические исследования проводили по известным отработанным методикам. Для определения концентрации эритроцитов использовали консервирующий раствор Хендрикса. Концентрацию эритроцитов определяли под микроскопом в камере Горяева, лейкоцитов - косвенным методом на 500 эритроцитов [Серпунин, Савина, 2005].
Концентрацию гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом с использованием спектромома, концентрацию общего белка в сыворотке крови - по коэффициенту преломления сыворотки, который измеряли на рефрактометре [Серпунин, Савина, 2005].
Подсчет лейкоцитарной формулы крови на окрашенных препаратах проводили с использованием светового микроскопа с применением иммерсии (увеличение 100x15). На мазках подсчитывали 200 лейкоцитов по общепринятой методике. При идентификации лейкоцитов использовали классификацию клеток крови рыб Н.Т. Ивановой [62].
Вторым этапом исследований было изучение морфофизиологических показателей. Изучение изменчивости индексов проводили у одновозрастных, одноразмерных сеголетков стерляди, выращенных в бассейнах инкубационного цеха рыболовецкого колхоза «им. Матросова», экспериментальных УЗВ и садках НВХ «Прибрежное», а так же у рыб, выращиваемых в экспериментах по влиянию различных уровней солёности, водородного показателя и аскорбиновой кислоты по известной методике [Шварц, 1968; Применение ... , 1972], которая определяет индекс органа как отношение его массы к массе порки рыбы. В качестве показателей были использованы индексы печени, почки и селезёнки и жабр.
Последним этапом исследований было изучение влияния условий выращивания, солёности и аскорбиновой кислоты на некоторые иммунологические показатели. В качестве иммунологических параметров были исследованы - клеточный (фагоцитарная активность лейкоцитов крови) и гуморальный иммунитет (концентрация и активности лизоцима, концентрация у-глобулинов). Исследования проводили по стандартным и модифицированным стандартным методикам [Пучков, 1962; Бухарин, 1974; Методические указания ..., 1999].
Для определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови использовали суспензию кармина. Экспозицию проводили в течение 1 часа 30 мин при постоянной температуре 20С. По истечении срока фагоцитоза пробы центрифугировали и из осевших клеток делали мазок. Подсчет фагоцитирующих и нефагоцитирующих лейкоцитов проводили на окрашенных препаратах с использованием светового микроскопа с применением иммерсии [Пучков, 1962].
На основании анализа фагоцитарной активности лейкоцитов крови стерляди вычисляли: 1) фагоцитарный индекс Гамбургера - долю фагоцирующих от общего числа лейкоцитов; 2) фагоцитарное число Ройта (ФЧ) - показатель активности фагоцитирующих лейкоцитов [Ройт, 2000] доля фагоцитированных частиц на один фагоцит.
Для проведения исследований по активности и концентрации лизоцима использовали гомогенаты внутренних органов - печени, почки, селезёнки и жабр, приготовленные по стандартной методике на фосфатном буфере. Исследования проводили по модифицированной стандартной методике с использованием стандартизированной взвеси лиофилизированной сорцины и с параллельным приготовлением контрольной пробы (в которой вместо гомогената внутренних органов использовалась стерильная дистиллированная вода). Приготовленные пробы инкубировали при температуре 20С, после чего измеряли её оптическую плотность на ФЭК в кювете № 2 с использованием зелёного светофильтра. Модификация стандартной методики О.В. Бухарина [25] состояла в том, что инкубацию проводили при температуре 20С (что согласно рекомендации Н.В. Пучкова [158], является оптимальной температурой для рыб северо-запада); для выявления динамики активности лизоцима длительность исследования увеличивали до 60 мин для сыворотки крови и до 90 мин для вытяжек из внутренних органов.
Индекс лизиса определяли как разницу между изменением экстинкции за время инкубирования в опытной и контрольной пробах. Для количественной характеристики лизоцима в растворах строили калибровочную кривую исходя из концентраций лизоцима 2, 4, 6 и 8 мкг в пробе [Бухарин, 1974].
Определение уровня — глобулина проводили по изменению оптической плотности проб на ФЭКе. Поскольку с насыщенными растворами фосфатов определённой концентрации у-глобулины осаждаются, изменяя тем самым оптическую плотность исследуемого образца [Методические указания ..., 1999
Влияние солёности на морфофизиологические показатели сеголетков стерляди
Таким образом, в долговременном опыте значение индекса печени в опытных группах было ниже, чем в контрольной. В кратковременном опыте наблюдалась обратная картина. Однако, отсутствие статистически достоверных различий указывает на незначительное влияния солёности на этот орган.
Если сравнивать полученные результаты с литературными данными, касающимися морфофизиологических показателей осетровых рыб, то можно отметить, что полученные нами в ходе исследований индексы находятся в диапазоне оптимальных значений для выращиваемых в индустриальных условиях осетровых рыб [Федосеева, Астафьева, 2006; Федосеева, и др., 2006].
Индекс селезёнки. За время проведения кратковременного опыта максимальное значение индекса селезёнки наблюдалось в контрольной группе - 0,26±0,07%, а минимальное в опытной группе 1 - 0,17±0,03, в опытной группе 2 индекс селезёнки имел промежуточное значение - 0,22±0,06%.
За время проведения долговременного опыта максимальное значение индекса селезёнки отмечали в контроле и опытной группе 3 где он составил 0,20±0,04%, в опытной группе 4 значение индекса было ниже и составляло 0,10±0,02%.
Проведенный корреляционный анализ выявил, сильную положительную связь индекса селезёнки с длительным воздействием солёности (г = 0,99±0,006), при кратковременном воздействии эта связь не была обнаружена. Очевидно, выявленная корреляционная связь отражает участие селезёнки в иммунных реакциях (селезёнка относится к иммунокомпетентным органам) и адаптационных механизмах организма.
Сравнивая полученные результаты с литературными данными [Распопов, Федосеева, 1989], можно отметить, что полученные нами в ходе кратковременного опыта значения, находятся в диапазоне оптимальных значений для молоди осетровых рыб, а данные, полученные в опытной группе 4 в долговременном опыте, были ниже, что, очевидно, связано с более интенсивным темпом роста тела.
Индекс почки. За время проведения кратковременного опыта максимальное значение индекса почки наблюдалось в контрольной группе - 0,20±0,06, а минимальное значение индекса было в опытной группе 2 - 0,11±0,05, в опытной группе 1 индекс имел промежуточное значение - 0,12±0,04%.
За время проведения долговременного опыта максимальное значение индекса почки наблюдалось в контрольной и опытной группе 4, где он составил 0,80±0,09%, в опытной группе 3 значение индекса почки было несколько ниже и составило 0,60±0,07%.
Проведенный корреляционный анализ выявил сильные положительные связи с солёностью индекса почки (г = 0,75±0,126 при кратковременном (14 суток) и г = 0,81±0,099 долговременном (100 суток) воздействии, что подтверждается данными об осморегуляторной функции почек в организме [Аминева, 1984]. Индекс жабр. За время проведения кратковременного опыта максимальное значение индекса жабр наблюдалось в контроле - 2,67±0,73 (р 0,05), минимальное значение индекса бьшо в опытной группе 1 — 1,94±0,17, в опытной группе 2 индекс жабр имел промежуточное значение - 2,16±0,58%.
За время проведения долговременного опыта максимальное значение индекса жабр наблюдалось в опытной группе 3, где он составил 2,30±0,28, в опытной группе 4 значение индекса жабр было минимальным (р 0,01), и составило 1,20±0,13, в контроле индекс жабр имел промежуточное значение - 2,00±0,22%. Достоверными были различия по величине индекса жабр между рыбами в контроле и опыте 4 (р 0,05) и рыбами из опытных групп (р 0,01). Изменение индекса жабр следует рассматривать как адаптивную реакцию организма на воздействие среды.
Проведенный нами корреляционный анализ показал сильную отрицательную корреляционную связь с длительным воздействием солёности индекса жабр (г = -0,99±0,006).
Таким образом, независимо от длительности воздействия солёность в диапазоне от 3 до 6%о отражается на изменении индекса жабр и селезёнки сеголетков стерляди. При кратковременном воздействии индекс жабр достоверно ниже у молоди стерляди выращенной при 3%о, что по нашему мнению связано с более интенсивным ростом рыб. При длительном воздействии солёности 6%о ЭТОТ показатель достоверно снижается, что является результатом проявления адаптационных механизмов, происходящих у типично пресноводного организма в диапазоне не оптимальных значений солёности.
Для проведения исследований по влиянию аскорбиновой кислоты на морфофизиологические показатели сеголетков стерляди были сформированы следующие группы: кратковременное воздействие (14 сут) - контроль - 0 мг/л, опыт 8 - доза аскорбиновой кислоты 2 мг/л, опыт 9 - доза витамина с 5 мг/л; долговременное воздействие (100 сут.) — контроль - 0,мг/л, опыт 10 - доза аскорбиновой кислоты 2 мг/л, опыт 11 - доза витамина с 5 мг/л. По результатам эксперимента было отмечено, что при воздействии аскорбиновой кислоты при долговременном и кратковременном воздействии произошло изменение всех исследованных индексов.
Индекс печени. За время проведения кратковременного опыта максимальное значение индекса печени наблюдалось в опытной группе 9, где оно составило 3,06±0,66, минимальное значение индекса печени наблюдалось в контроле, где оно составило 1,93±0,53, в опытной группе 8, индекс печени имел промежуточное значение -1,99±0,56%(табл.20).
1Д-различия дос товерны при р 0,0 и 0,001, соответственно За время проведения долговременного опыта максимальное значение индекса печени наблюдалось в контрольной группе, где он составил 1,20±0,13, в опытной группе 11, при концентрации аскорбиновой кислоты 5 мг/л значение индекса было минимальным - 0,30±0,03%, в опытной группе 10, при концентрации аскорбиновой кислоты 2 мг/л значение индекса имело промежуточное значение, и составило 0,60±0,07%. Достоверные различия были получены при сравнении данных в контроле и опыте 10 (р 0,001), контроле и опыте 11 (р 0,01), а также между контрольными группами (р 0,01). Полученные различия, по нашему мнению, являются результатом более интенсивного темпа роста в опытных группах (рис. 49).
В долговременном опыте значение индекса печени в опытных группах было ниже, чем в контроле, что по нашему мнению, связано с более интенсивным темпом роста (рис. 49). В кратковременном опыте наблюдалась обратная картина, здесь индекс печени в опытных группах был выше, чем в контроле, что очевидно связано с тем, что аскорбиновая кислота способствует усилению обменных процессов в печени.
Влияние солёности на гематологические показатели сеголетков стерляди при кратковременном и длительном воздействии
Концентрация лизоцима в почках осетровых рыб имеет максимальные значения, но она неодинакова в разных отделах почек. По данным В.И. Лукьяненко [108], концентрация лизоцима в почках стерляди варьирует от 0,09 до 0,31 мкг/г в головном, туловищном и хвостовом отделах, что связано с синтезом лизоцима в головном отделе и депонированием его в паренхиматозной ткани туловищного и хвостового отделов, а также выделением лизоцима с мочой из хвостового отдела почек. У стерляди в среднем концентрация лизоцима во всей почке составляет 0,34 мкг/г, что является максимальным показателем среди вышеуказанных видов осетровых рыб [Лукьяненко, 1971].
Если оценивать полученные нами результаты, то следует отметить, что в садках в связи с более напряженными условиями обитания, в организме стерляди произошла активизация неспецифического фактора иммунной защиты - лизоцима на всех трёх уровнях. Увеличение концентрации лизоцима в почках является показателем его активного синтеза, а максимальные значения, регистрируемые в селезёнке, свидетельствуют об активном синтезе лизоцима в В-лимфоцитах.
Следующим этапом исследований было изучение динамики концентрации лизоцима при подготовке организма стерляди к зимовке.
В коже сеголетков стерляди к осени концентрация лизоцима статистически достоверно снизилась (р 0,001) с 20,25±0,94 до 10,40±0,68 мкг/г. При оценке динамики концентрации отмечали, что осенью она возрастала с 10,40±0,68 до 26,05±1,08 мкг/г. Полученные различия, очевидно, связаны с понижением температуры воды, а значит со снижением количества патогенных микроорганизмов, что и отражается на снижении концентрации лизоцима в коже. Высокая концентрация лизоцима за период исследований является проявлением компенсаторного механизма защиты организма от патогенных агентов, когда низкие начальные значения компенсируются резким увеличением активности.
В селезёнке сеголетков стерляди концентрация лизоцима снизилась с 31,78±1,21 до 8,78±0,62 мкг/г (р 0,001), что является результатом снижения синтеза лизоцима в В-лимфоцитах. Активность (динамика концентрации) лизоцима в селезёнке имела аналогичную тенденцию, описанную выше для кожи, и увеличивалась с 8,78±0,62 до 21,90 ±1,09 мкг/г.
В почке сеголетков стерляди концентрация лизоцима к осени снизилась с 20,00±1,00 до б,37±0,55 мкг/г (р 0,001), что является показателем снижения синтеза лизоцима лимфоидной тканью почек. Динамика концентрации лизоцима в почках имела сходную картину с печенью и кожей. В осенний период динамика концентрации (активность) лизоцима в почке увеличивалась с 6,37±0,55 до 10,93±0,93 мкг/г. Данные отличия, по нашему мнению, являются результатом, того, что почка является основным органом, синтезирующим лизоцим.
В печени сеголетков стерляди концентрация лизоцима от лета к осени снизилась с 19,97±0,95 до б,02±0,47 мкг/г (р 0,001). Летом динамика концентрации незначительно снижалась с 19,97±0,95 до 17,41 ±0,89 мкг/г, а осенью увеличивалась с 6,02±0,47 до 20,35±0,91 мкг/г (р 0,001).
Таким образом, концентрация лизоцима и его активность зависят от условий обитания и направлены на обеспечение постоянства внутренний среды, что можно рассматривать как адаптационный механизм, направленный на установление динамического равновесия организма и постоянно меняющейся среды обитания.
Резюмируя полученные результаты по влиянию условий выращиванию на иммунологические показатели сеголетков стерляди, следует отметить, что рыба, выращенная в УЗВ, имела самые низкие значения исследованных показателей -фагоцитарной активности лейкоцитов крови, концентрации у-глобулинов (как фактора специфического иммунной реакции) и концентрации лизоцима (как фактора неспецифической иммунной реакции), что по нашему мнению является результатом более благополучных условий выращивания. В садках и бассейнах условия были более напряженными, что и отразилось на активизации факторов иммунной защиты увеличении концентрации у-глобулинов и лизоцима. Однако если сопоставить все данные по темпу роста и выживаемости рыб в садках и бассейнах, то необходимо отметить, что функционирование организма происходило в нормальном режиме и не привело к истощению иммунологического потенциала, отражающегося на снижении резистентности организма и развитии патологии.
При подготовке организма к зимовке в открытом водоёме, по нашим данным, происходит перераспределение факторов специфической и неспецифической иммунной защиты — возрастает роль у-глобулинов (состоящих на 95 -98% из иммуно-глобулинов) и снижается концентрация лизоцима, как фактора неспецифического иммунитета, но резко увеличивается его активность (увеличение концентрации лизоцима во времени).
Следующим этапом исследований было изучение влияния солёности на иммунологические показатели сеголетков стерляди.
У сеголетков стерляди изучали влияние солёности 3 и 6%о на концентрацию у-глобулинов, фагоцитарную активность лейкоцитов крови, а также концентрацию и активность лизоцима в гомогенатах внутренних органов, кожи и жабр. Исследования проводили при кратковременном воздействии (14 сут) и в течение 100 сут (долговременный опыт). При проведении исследований рыб разделили на группы: контроль, опыт 1 - солёность 3%о, опыт 2 - солёность 6%о (при кратковременном воздействии) и опыт 3 - солёность 3%о, опыт 4 - солёность 6%о (при длительном воздействии).
Похожие диссертации на Адаптационные возможности молоди стерляди (Acipenser ruthenus linnaeus, 1758) при выращивании в различных рыбоводных системах
