Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о клиническом течении рожи 12
Глава 2. Современные представления о микробном пейзаже местного воспалительного очага у больных рожей 22
Собственные исследования.
Глава 3. Общая характеристика обследованных больных рожей .30
Глава 4. Материалы и методы исследований 35
4.1. Бактериологическое исследование биопроб от больных рожей 35
4.2. Методика проведения ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в реальном времени 37
4.3. Электронно-микроскопическое исследование биоматериалов при различных формах рожи 39
4.4. Статистическая обработка 40
Глава 5. Подробная клинико-лабораторная характеристика заболевания у госпитализированных больных рожей 40
5.1. Клинико-лабораторная характеристика эритематозных и геморрагических форм рожи 40
5.2. Особенности клинического течения рожи у больных различных возрастных групп
5.2.1. Особенности клинического течения рожи у больных моложе 65 лет 44
5.2.2. Особенности клинического течения рожи у больных старше 65 лет 53
Глава 6. Выявление микроорганизмов в крови и в области местного воспалительного очага у больных рожей бактериологическим методом 60
6.1. Частота выявления микроорганизмов в разных биопробах и разные сроки заболевания 60
6.2. Частота выявления микроорганизмов при различных формах рожи 64
6.3. Клинико-лабораторные показатели у больных в зависимости от выявления S.aureus бактериологическим методом 64
6.4. Осложнения у больных рожей в зависимости от выявляемого микроорганизма.66
6.5 Диагностическая значимость бактериологического исследования 67
Глава 7. Выявление ДНК микроорганизмов методом ПЦР с гибридизационно -флуоресцентной детекцией в режиме реального времени у больных рожей нижних конечностей 70
7.1. Частота выявления микроорганизмов в различных биопробах больных рожей 70
7.2. Частота выявления ДНК микроорганизмов в различные сроки заболевания. 76
7.3. Частота выявления ДНК микроорганизмов у больных различными формами рожи
7.4. Клинико-лабораторные особенности рожи в зависимости от выявления ДНК S.aureus в ПЦР 78
7.5. Частота осложнений рожи при выявлении у больных ДНК разных микроорганизмов 79
7.6. Диагностическая значимость ПЦР у больных рожей 81
Глава 8. Значимость микробного пейзажа тканей местного воспалительного очага в формировании особенностей клинического течения рожи у госпитализированных больных 84
8.1. Сравнение бактериологического метода и ПЦР по выявлению микроорганизмов у больных рожей. 84
8.2. Характер течения рожи в зависимости от выявляемых у больных культивируемых микроорганизмов или их ДНК методом ПЦР 85
8.2.1. Клинико-лабораторные особенности рожи в зависимости от присутствия культивируемых форм или ДНК стафилококков в очаге местного воспаления 85
8.2.2. Клинико-лабораторные особенности течения рожи при моно- и микст инфекциях по совокупности данных бактериологического исследования и ПЦР 87
8.3. Возрастные особенности выявления микроорганизмов и характера течения рожи 90
8.3.1. Структура выявляемых микроорганизмов у больных рожей разных возрастных групп .90
8.3.2. Микробный пейзаж очага местного воспаления у больных рожей разного возраста по данным ПЦР-РВ и бактериологического исследования 92
Глава 9. Результаты изучения крови, мазков-отпечатков с поверхности очага, пунктата булл методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии 95
Заключение 102
Выводы 112
Практические рекомендации 113
Список литературы
- Методика проведения ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в реальном времени
- Особенности клинического течения рожи у больных различных возрастных групп
- Частота выявления микроорганизмов при различных формах рожи
- Частота выявления ДНК микроорганизмов у больных различными формами рожи
Введение к работе
Актуальность изучения рожи определяется склонностью заболевания к рецидивированию (25-30%), значительным увеличением в последние годы геморрагических форм рожи, протекающих длительно и тяжело, с замедленной репарацией тканей в очаге воспаления, частыми осложнениями, глубокими нарушениями лимфообращения, возникающими осложнениями и остаточными явлениями [Еровиченков А.А., 2003, 2015; Миноранская Н.С., 2005; Caban M., Hall L., 2015], а также недостаточной изученностью некоторых сторон иммунопатогенеза рожи.
Традиционный бактериологический метод позволяет выявить S.pyogenes у больных рожей всего в 5% случаев, и диагноз рожи ставится преимущественно по клинико-эпидемиологическим данным. В последние годы ведутся исследования, направленные на выявление патогенов, участвующих, наряду с S.pyogenes, в патогенезе воспалительного процесса при роже, с целью выявления микст-инфекций, течение которых, как известно, отличается от
моноинфекций, прежде всего, в сторону утяжеления заболевания, хронизации, сложности терапии [Gunderson C.G., Martinello R.A., 2012; Nair N. et al, 2014].
Можно полагать, что характер клинического течения рожи, в том числе характер местного воспалительного очага, зависит от совокупности патогенных свойств микробов, формирующих микробный пейзаж кожи и других биотопов, их содружественных или конкурентных взаимоотношений. В связи с этим, несомненный научный и практический интерес и актуальность представляет изучение состава микроорганизмов при определенных клинических формах рожи с использованием комплекса молекулярно-генетических, электронно-микроскопических и бактериологических методов исследования.
Цель работы - установить значение микробного пейзажа местного воспалительного очага и крови в формировании особенностей клинического течения рожи у госпитализированных больных.
Задачи работы:
1. Провести клинико-эпидемиологический анализ современного течения
рожи у госпитализированных больных;
2. Оценить роль р-гемолитических стрептококков, стафилококков и других
микроорганизмов при различных клинических формах рожи на основании
выявления при бактериологическом исследовании культивируемых
микроорганизмов в крови больных и тканях местного воспалительного очага;
-
Установить возможность выявления ДНК микроорганизмов в тканях местного воспалительного очага и крови у больных рожей методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени;
-
Провести электронно-микроскопическое исследование пунктатов из области местного воспалительного очага и крови с целью характеристики состава, морфологии микробов и структурной организации выявляемых сообществ микроорганизмов у больных рожей;
-
Сравнить возможности методов - современного бактериологического исследования, ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени, сканирующей и трансмиссионной электронной
микроскопии, - в выявлении пейзажа микробной флоры местного воспалительного очага и крови у больных рожей;
6. Определить клинико-диагностическую значимость микробного пейзажа тканей местного воспалительного очага в формировании особенностей клинического течения рожи.
Научная новизна. Впервые с использованием современного
бактериологического метода, полимеразной цепной реакции с
гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии изучен пейзаж микробной флоры в крови и местном воспалительном очаге у больных рожей. Впервые показано, что на особенности клинической картины заболевания у больных рожей - выраженность общей интоксикации и воспаления в области местного воспалительного очага, скорость репарации, возникновение осложнений и исходы болезни, - в значительной степени оказывает влияние состав микробной флоры в области местного воспалительного очага.
Впервые установлено, что в структуре выявленных у больных рожей культивируемых микроорганизмов ведущее место занимают стафилококки -63,27% (S.aureus - 20,45% S.epidermidis – 28,57% и S.saprophyticus – 2,25%), затем - стрептококки, до 9% (S.pyogenes, S.pneumoniae и S.dysgalactiae подтип equisimilis), редко - в сочетании, остальные микроорганизмы выявляются в единичных случаях.
Впервые показано, что присутствие культивируемых S.aureus в смывах с поверхности кожи местного воспалительного очага встречается чаще при буллезно-геморрагической роже, чем при эритематозной, сопровождается более высокой интоксикацией и показателями воспаления (высокая лихорадка, лейкоцитоз, повышение лейкоцитарного индекса интоксикации, СОЭ, моноцитов, АЛТ, ЩФ, снижение лимфоцитов в крови), а также возникновением гнойных осложнений. Впервые установлено, что высев с поверхности кожи воспалительного очага S.aureus соответствует более частому
обнаружению ДНК бактерий методом ПЦР в очаге в сравнении с больными, у которых S.aureus с поверхности кожи не высеяны.
Впервые среди стафилококков, выявляемых в области местного
воспалительного очага у больных рожей, установлено присутствие MRSA и MRCoNS штаммов, а также MSSA штаммов, что имеет важное клиническое значение, так как может обусловливать более тяжелое течение заболевания и трудности терапии.
Впервые показана высокая информативность ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени в выявлении стафилококков у больных рожей в крови, пунктатах в области очага местного воспаления, вне очага и в пунктатах булл у больных рожей, при буллезно-геморрагической форме роже, и более высокая чувствительность ПЦР по сравнению с бактериологическим исследованием в выявлении S.pyogenes.
В результате проведения сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии пунктатов в области очага, буллах и крови впервые у больных рожей выявлены группы бактерий (кокки, палочки, грибы), как в монокультуре, так и в сочетании (микст-инфекции), в том числе покрытые экстрацеллюлярным матриксом, что свидетельствует о формировании биопленок, способных защищать микроорганизмы от внешних воздействий, включая антибактериальные препараты.
Сравнение результатов современного бактериологического метода и
ПЦР позволило впервые комплексно оценить структуру, качественные и
количественные характеристики микробной флоры очага, выявить сочетанное
присутствие микробов (микст-инфекции), что дает возможность
целенаправленной коррекции антибактериальной терапии в зависимости от выявляемых микроорганизмов и их свойств.
В результате подробного клинико-эпидемиологического анализа
современного течение рожи подтверждено, что в настоящее время среди госпитализированных больных рожей преобладают женщины, лица старших
возрастных групп, с преимущественным расположением очага на коже нижних конечностей с геморрагическими проявлениями.
Практическая значимость работы. Полученные данные дают
представление о пейзаже микробной флоры в области очага местного
воспаления и в крови у больных рожей, о составе, распределении в очаге и
жизнеспособности микроорганизмов в различных участках воспалительного
очага у госпитализированных больных. Данные о числе выявляемых в ПЦР
метициллинрезистентных штаммов имеют большое значение для клиники,
так как свидетельствуют о пока умеренном их распространении у
госпитализированных больных рожей, что позволяет прогнозировать расход
антибактериальных препаратов и проводить эмпирическую терапию в
неосложненных случаях заболевания.
При проведении сравнительных исследований с использованием
бактериологического метода и ПЦР (выявление культивируемых микро
организмов или их ДНК) показаны дополнительные возможности этих
методов - так, установлено, что высев стафилококков с поверхности кожи в
области местного воспалительного очага имеет большое клиническое и
диагностическое значение, служит маркером присутствия большого числа
ДНК микроорганизмов в глубине очага, в первую очередь, стафилококков и
некоторых других микроорганизмов, в отличие от случаев высева с
поверхности очага S.epidermidis и/или S.saprophyticus, или без высева
стафилококков с кожи.
Показаны различия в диагностических возможностях примененных
методов. Так, при оценке особенностей клинической картины, выраженности
интоксикации и необходимости прогноза длительности заболевания большую
информативность имеет выявление культивируемых микробов
бактериологическим методом, в первую очередь, с поверхности кожи над очагом, в то время как при выборе антибактериального препарата важнее результаты ПЦР, позволяющие в режиме реального времени определить не только вид микроорганизма по его ДНК, но и его чувствительность к
антибактериальным препаратам. В то же время, СЭМ и ТЭМ позволяют получить данные о составе, состоянии и ультраструктурной организации микробного пейзажа в очаге местного воспаления и в крови, выявить миксты, присутствие фагов и состав биопленок.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Микробный пейзаж в области местного воспалительного очага в
значительной степени определяет особенности клинической картины
заболевания у больных рожей - выраженность общей интоксикации и
воспаления в области местного воспалительного очага, скорость репарации и
возникновение осложнений.
2. Среди выявляемых у госпитализированных больных рожей
микроорганизмов ведущее место занимают стафилококки - 63,27% (S.aureus,
S..epidermidis и S.saprophyticus), в том числе MRSA и MRCoNS, а также
стрептококки, до 9% (S.pyogenes, S.pneumoniae и S.dysgalactiae подтип
equisimilis), остальные микроорганизмы выявляются в единичных случаях.
Присутствие S.aureus в смывах с поверхности кожи местного воспалительного
очага при буллезно-геморрагической роже, сопровождается высокой
интоксикацией, воспалением, и частым обнаружением ДНК бактерий методом
ПЦР в тканях очага.
Внедрение полученных результатов в практику. Рекомендации, полученные в результате исследования, используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней МПФ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова МЗ РФ.
Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании сотрудников кафедры инфекционных болезней МПФ и лаборатории по изучению токсических и септических состояний НИЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова МЗ РФ (зав.кафедрой – д.м.н., профессор Е.В. Волчкова; зав. лаборатории - д.м.н., профессор О.Ф. Белая) 23 июня 2015 года. Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы НИР Первого МГМУ им.И.М.Сеченова «Совершенствование методов профилактики,
диагностики, лечения и эпидемиологического надзора за паразитарными и инфекционными заболеваниями», номер Госрегистрации 01200907149.
Материалы диссертационной работы были представлены и доложены на V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 25-27 марта 2013г.); Выездном Пленуме Правления Национального научного общества инфекционистов, IV Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей: актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики», посвященной памяти Н.Р. Иванова (Саратов, 26-27 сентября 2013г.); XI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 1-2 октября 2013г.); VI Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 24-26 марта 2014г.).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.09 - «инфекционные болезни». Результаты проведенных исследований соответствуют области исследований специальности, конкретно - пунктам 2 и 3 паспорта специальности «инфекционные болезни».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах, состоит из введения, двух глав обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Библиография включает 117 отечественных и 211 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 14 рисунками.
Методика проведения ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в реальном времени
Рожа – антропонозное инфекционно-аллергическое заболевание, вызываемое гемолитическим стрептококком группы А, которое характеризуется большим разнообразием клинических форм и частым рецидивированием. Заболевание проявляется очаговым серозным или серозно-геморрагическим воспалением кожи и сопровождается общетоксическими проявлениями [8, 44, 89, 104, 107, 109, 114, 130]. Рожа занимает четвертое место в структуре общей инфекционной заболеваемости, уступая острым респираторным и кишечным инфекциям, а также вирусным гепатитам [40, 45, 49, 139, 145, 162]. В структуре стрептококковых инфекций рожа занимает одно из ведущих мест [104, 107, 138, 145].
С позиций концепции персистирующих инфекций рожа - это эндогенная стрептококковая инфекция, развитие которой сопровождается сбоем клеточного и гуморального иммунного ответа организма и нарушением естественных механизмов резистентности, рожа практически всегда сочетается с соматической патологией. [43, 113, 316]. Как следствие, развивается состояние универсального иммунодефицита с вовлечением в него всех звеньев и факторов иммунной системы [3, 13, 29, 95, 116]. Схематично патогенез рожи может быть представлен в виде переходящих друг в друга стадий: повреждение целостности кожного покрова, наличие предрасполагающих факторов (лимфедемы, венозной недостаточности, микоза, экземы, очагов хронической инфекции, сахарного диабета и ожирения) на фоне эмоциональных стрессов, инсоляции[40, 162]. К наиболее актуальным провоцирующим факторам относят микозы стоп, ангину, переохлаждение, хроническую инфекцию ЛОР-органов. В работах последних лет особое внимание уделяется лимфатической дисфункции как основному фактор риска развития рожи. Было доказано, что лимфоотток значительно снижается не только в пораженной, но и в здоровой конечности [176].
Однако, главным фактором риска остается индивидуальная предрасположенность, что объясняет наследственный характер заболевания у многих пациентов [105, 107, 201, 248, 272]. Чаще болеют люди с III(В) группой крови, у которых имеются следующие маркеры системы HLA: А2,А3, В5,В12, Вw35, Cw4 [104]. Отмечено, что антигены А1, А10, Аw19, B7, B8, напротив, выполняют защитную функцию.
Достоверно установлена связь HLA-Bw35 и уровня магния в сыворотке крови. Гипомагниемия обусловливает снижение выработки защитных интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2) и тормозит активность факторов системы комплемента, что в конечном итоге приводит к резкому падению активности иммунной системы и неполной элиминации возбудителя. Кроме того, к факторам, способствующим рецидивированию заболевания, исследователи относят нарушение в работе антиоксидантной системы, усиление перекисного окисления липидов, сдвиги рН кожи [9, 14, 55, 68, 118].
Предложен прогностический критерий оценки риска развития тяжелых геморрагических форм – оксидантно-антиоксидантный коэффициент, который отражает отношение параметров обеих систем (гидроперекиси липидов плазмы, МДА сыворотки и общей пероксидантной активности сыворотки к супероксиддисмутазе плазмы и каталазе сыворотки, соответственно). Так, при значении ОАК более 2 у.е. в первые двое суток заболевания высок риск развития геморрагических форм. Метод показал высокую чувствительность и специфичность (96,9% и 98,0%) [7].
В патогенезе рожи важными этапами являются: проникновение ГСА в кожу и размножение в дермальных лимфатических капиллярах, чему способствует угнетение фагоцитарной активности тканевых макрофагов по отношению к -ГСА. Доказано, что пирогенные токсины стрептококка обладают свойствами суперантигенов [230, 246, 270, 286], кроме того особенности строения капсулы стрептококка, в частности, содержание в ней гиалуроновой кислоты и наличие специфического М-протеина, достоверно снижают активность фагоцитарной системы [54, 123, 127, 137, 284, 295]; развитие интоксикационного синдрома, связанного с бактериемией и токсемией [32]; расстройство дермального лимфообращения на капиллярном уровне с формированием лимфостаза, геморрагий и булл с различным содержимым (серозным, геморрагическим); скорость и эффективность элиминации бактериальных форм посредством фагоцитоза; формирование хронических очагов инфекции непосредственно в макрофагах дермы и в регионарных лимфоузлах, что часто связано с трансформацией ГСА в L-формы, фиксация фермента -ГСА фосфопируватгидратазы на поверхности клеток человека с возможным развитием аутоиммунных реакций [74, 69, 98, 266].
В патогенезе заболевания присутствует аллергическое и инфекционно-токсическое звено, поскольку при развитии рожи имеется сенсибилизация как к экзо- , так и к эндоаллергенам. Персистенция стрептококка ведет к развитию реакции гиперчувствительности замедленного типа, при этом выраженная сенсибилизация обнаруживается уже с первых дней болезни как у пациентов с первичной, так и с рецидивирующей рожей [115].
Установлено, что ГЗТ играет существенную роль в элиминации внутриклеточных микроорганизмов, однако, при гиперергическом развитии реакции осложняет течение болезни и является одной из причин затяжного течения и рецидивирования. Сенсибилизированные лимфоциты, находясь под воздействием антигенов стрептококка, выделяют интерлейкины, макрофаг-ингибирующий фактор, фактор активации макрофагов, факторы проницаемости, лимфотоксин и др. Основную роль в регуляции ответа организма играет МИФ, так как, выполняя функцию гормона и цитокина и оказывая влияние одновременно на эндокринную, иммунную систему и силу воспалительного ответа. Не менее важным фактором признается миграционная активность лейкоцитов (МАЛ). Установлен циклический характер изменения МАЛ в динамике заболевания, связанный со стимуляцией антигенами стрептококка: МАЛ значительноу скоряется в острую фазу заболевании и тормозится во время реконвалесценции. Кроме того, доказано, что данный признак коррелирует с кратностью заболевания, и особенности динамики МАЛ значительно различаются при первичных и рецидивирующих формах рожи в ответ на стимуляцию порциальными антигенами S.pyogenes. [115].
Не подвергается сомнению роль цитокинов в развитии болезни. В частности, доказано, что при повторной буллезно-геморрагической форме концентрация ИЛ-1 и ФНО- повышена в сравнении с первичной формой, тогда как при эритематозных формах наблюдается обратная закономерность, что исследователь связывает с влиянием характера местного очага, формы и кратности рожи на функциональную активность моноцитарно-макрофагальной системы [67]. Продукция провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-) является индуктором усиления миграции в очаг воспаления и накопления там лейкоцитов, что приводит к значительному изменению лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии и гиперкоагуляции [25, 39, 66].
Особенности клинического течения рожи у больных различных возрастных групп
Серологическая классификация микроорганизма основана на антигенном разнообразии полисахарида, входящего в состав клеточной стенки: в 1933 г. Р.Ленсфильд разработана классификация, согласно которой было выделено 20 серогрупп, в пределах каждой из которых по типоспецифическому антигену выделены серотипы [226].
В серогруппе А выделяют 100 серотипов на основании антигенных свойств М протеина (он является важным фактором вирулентности) и 20 – на основании антигенных свойств Т-протеина [8, 104]. В последнее время все большее распространение приобретают ранее исчезнувшие из циркуляции М1, М3, М5 и М8 серотипы стрептококка, которые обусловливают увеличение количества тяжелых геморрагических форм за счет своей вирулентности и произошедшего снижения специфического популяционного иммунитета (за время их отсутствия в циркуляции) [185, 291]. S.pyogenes найден в ротоглотке в 10% общей популяции населения, и лишь 1% лиц имеют его на нормальной коже [177]. S.pyogenes, наряду с S.aureus, составляют основу транзиентной флоры на поверхности кожи. Эти бактерии, попадающие на кожу из окружающей среды, реализуют свою патогенность при повреждении кожного покрова [142].
В то же время резидентная флора кожи состоит преимущественно из комменсалов Грам-положительных кокков (S.epidermidis), дифтероидов (Corynebacterium,
Brevibacterium) и анаэробов (Propionibacterium). Резидентная флора противостоит колонизации кожи патогенными бактериями путем гидролиза липидов и продукции свободных жирных кислот, которые являются токсичными для многих бактерий [177].
S.epidermidis является основным компонентом резидентной микрофлоры кожи. В нескольких исследованиях показано, что S.epidermidis обычно колонизирует кожу здоровых людей [191]. Антимикробные пептиды критически важны для защиты хозяина против инфекции.
Недавно показано, что фенол-растворимые модулины S.epid. взаимодействует с липидными мембранами, формируя комплексы, и проявляют антимикробную активность. -токсин S.epidermidis обычно присутствует в дерме и частично в дерме человеческой кожи, как показано иммуногистохимическим методом [150]. Антимикробный эффект -токсина на патогены кожи подчеркивает роль S.epidermidis в естественном иммунитете кожи [150,151]. -токсин напрямую связывается с антимикробными пептидами хозяина LL-37, CRAMP, hBD2, hBD3 и оказывает бактериостатический эффект на стрептококки группы А, снижает их выживаемость, при этом снижается уровень Mip-2 цитокина.
Полученные данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи хозяина и бактерии. Различные нарушения микробиоценоза кожи играют не последнюю роль в развитии рожи. Нарушения нормального состава микрофлоры кожи в виде снижения или полного отсутствия микрококков и/или коринебактерий возникают у больных рожей с первых часов болезни, и такой дисбиотический сдвиг лишь усугубляется на фоне антибактериального лечения, подготавливая почву для возникновения рецидивов рожи [4-6].
Дисбиотический сдвиг характеризуется увеличением численности стафилококков, уменьшением количества кислотопродуцирующих коринебактерий и присутствием L-форм р-ГСА у больных рожей, а у больных с рецидивами рожи в мазках отпечатках с ранее пораженной кожи в 3 раза чаще обнаруживаются L-формы -гемолитического стрептококка, чем у пациентов с первичной рожей [85].
У больных первичной рожей голеней дисбиотические изменения не ограничиваются только зоной локального воспалительного очага на пораженной конечности, но присутствуют и в симметричной зоне непораженной конечности.
Преобладание среди условно-патогенных симбионтов культур с высокой антилизоцимной активностью не только утяжеляет течение болезни, но и способствует удлинению ее сроков, замедляя репарацию в местном очаге [6].
Дисбиоз кожи, обусловленный различными факторами, в том числе воздействием патогенных стрепто- и стафилококков на нормальную флору кожи, особенно на фоне применения антибактериальных препаратов, отражается и на микробиоценозе кишечника.
Так, у больных рожей выявлены изменения, свойственные дисбиотическому состоянию кишечника, в виде наличия в копрофильтратах пациентов антигенов токсинов А и В Clostridium difficile, О-антигенов возбудителей кишечных инфекций (шигелл,сальмонелл, йерсиний, кампилобактерий), причем на фоне лечения рожи антибактериальными препаратами дисбиоз кишечника становился более выраженным [115].
Наиболее тяжелое течение рожи с развитием буллезных и геморрагических форм, с выраженным интоксикационным синдромом и со значительными деструктивными изменениями в локальном воспалительном очаге было характерно для пациентов со значительными нарушениями микробиоценоза кожи, кишечника, носо- и ротоглотки [10].
Как известно, диагноз рожи ставится на основании клинико-эпидемиологических данных, при этом бактериологическое обследование больных не проводится [41,44]. Ранее при попытках проведения бактериологического исследования у больных рожей всего в 4,6% случаях удавалось выделить микроорганизмы из крови: из числа положительных культур 46% составляли S.pyogenes, а в 29% - другие -ГСА [41, 44, 89, 101, 194]. Вопрос об участии других микроорганизмов в возникновении рожи, особенно тяжелых ее форм, сопровождающихся развитием осложнений и хронизацией в последнее время все больше обсуждается [150, 177, 227, 252, 255, 276].
Наряду с S.pyogenes, Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis группы С и G недавно был охарактеризован в качестве важного патогена, способного вызывать заболевания кожи и мягких тканей различной тяжести, – рожу (высев в 29%), целлюлиты, некротизирующие фасцииты, по клинической картине сходные с заболеваниями, вызываемыми S.pyogenes [152, 175, 241, 276].
Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis также проявляют сильную -гемолитическую активность, стрептокиназную активность по отношению к человеческому плазминогену и протеолитическую активность к человеческому фибрину. Подобно S.pyogenes, они имеют вирулентные факторы – стрептолизины O и S, стрептокиназу, гиалуронидазу, М-протеин, С5а-пептидазу и др. Эти возбудители могут существовать в составе нормальной флоры кожи, носоглотки, желудочно-кишечного и урогенитального тракта [122, 143, 163,195, 207, 278, 299, 306, 325].
Кроме S.dysgalactiae spp. еquisimilis, в группу G гемолитических стрептококков входят S.milleri, S.canis и S.intestinalis. Резервуаром S.dysgalactiae и S.milleri является человек, но выделение последнего у больных рожей не описано [325].
Трудности диагностики S.dysgalactiae и других -гемолитических стрептококков группы G у больных рожей и другими заболеваниями кожи и мягких тканей обусловлены тем, что обычно использующиеся для микробной идентификации коммерческие Vitek system, API system и ATB – Expression system (bioMerieux Vitek) не содержат в базе данных все четыре микроорганизма группы G стрептококков [325].
Схожие с рожей поражения отмечены при инфицировании также S.agalactiae (гр.В стрептококков) и S.aureus [120, 132, 172, 174, 216, 227, 232, 238, 247, 289, 317].
У здоровых лиц колонизация стафилококком различных участков тела, особенно в области подмышечных впадин, промежности, глотки, рук и носа, периодически выявляется в 60% случаев. Условиями, предрасполагающими к снижению резистентности к микробу, является сахарный диабет, дисфункция печени, ВИЧ-инфекция, атопический дерматит, диализ, внутривенная терапия [177].
Частота выявления микроорганизмов при различных формах рожи
Всего бактериологическое исследование было проведено у 50 больных с документированным диагнозом рожи нижних конечностей, давших информированное согласие на обследование. Всего бактериологическим методом исследовано 50 проб венозной крови, 49 проб смывов с поверхности кожи в области местного воспалительного очага и 32 пробы содержимого булл (суммарно - 131 проба биоматериала).
Методики взятия и обработки биопроб для проведения бактериологического исследования.
Материалами для исследования служили кровь, мазки с кожи в области очага заболевания и пунктаты булл. Взятие биологического материала осуществляли у больных при поступлении больного в стационар до начала применения антибиотикотерапии. Сбор и транспортировка биоматериалов в лабораторию проводили в соответствии с методическими указаниями [69].
Кровь для исследования отбирали во время подъема температуры путем пункции кубитальной вены. Участок кожи над выбранным сосудом дезинфицировали тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, затем другим тампоном, смоченным 5% раствором йода, круговыми движениями, начиная от центра, в течение 30 сек. После высыхания обработанного участка кожи стерильным шприцем отбирали кровь в объеме 10-15 мл. После венопункции для предотвращения возможного раздражения (ожога) участка кожи пациента снимали остатки йода с помощью тампона, смоченного 70% этиловым спиртом.
Отделяемое с раневой поверхности отбирали с помощью 2 ватных стерильных тампонов, извлеченных из одноразовых тупферов с транспортной средой Amies (Sarstedt, Германия). Один тампон использовался для микроскопии, а другой - для посева. Перед отбором материала кожу вокруг раны предварительно обрабатывали 70% этиловым спиртом, затем сухой стерильной салфеткой удаляли с поверхности раны некротические массы, детрит, гной, затем проводили забор материала 2 тампонами круговыми вращательными движениями от центра к периферии, плотно прижимая тампоны к поверхности раны, стараясь добиться максимальной нагрузки тампонов материалом, вплоть до полного его насыщения. Далее тампоны помещались в емкости со средой Amies, из которых они были извлечены. Пункцию булл и аспирацию их содержимого проводили после предварительной дезинфекции поверхности кожи 70% этиловым спиртом и 5% раствором перманганата калия. Аспирировали самую глубокую область очага, стараясь не загрязнить пробу поверхностной микрофлорой. После пункции кожу повторно обрабатывали 5% раствором перманганата калия. Аспирированную жидкость доставляли в лабораторию в шприце, плотно закрытом стерильной силиконовой пробкой.
Отобранные биоматериалы не позднее 1-2 ч. с соблюдением температурного режима (в термоконтейнерах) доставлялись в бактериологическую лабораторию.
Микробиологические исследования выполняли в соответствии с приказами и методическими указаниями [71, 83] на базе бактериологической лаборатории 2 КИБ ДЗ г.Москвы (зав.лаб. – к.м.н. Свистунова Т.С).
Посевы крови. Для посевов крови использовали флаконы с двухфазной средой для аэробных - Haemoline Performance Diphasic и анаэробных - Haemoline Performance Anaerobic микроорганизмов (bioMerieux, Франция). Посев крови проводили следующим образом: над пламенем спиртовки открывали защитный колпачок флакона, обрабатывали резиновую пробку 70% спиртом, вносили кровь из шприца во флакон, предварительно поменяв иглу, вновь обрабатывали 70% спиртом пробку флакона и защитный колпачок, закрывали последним флакон и осторожно, чтобы не замочить пробку, перемешивали круговыми движениями содержимое флакона. Флаконы с засеянной кровью инкубировали в течение 6 недель в термостате при 370 С. Посевы просматривали ежедневно в течение первых 8 дней. При выявлении видимого роста делали мазки с окраской по Граму, и в соответствии с данными микроскопии идентифицировали выделенные микроорганизмы.
При отсутствии роста на 3, 5, 8 день проводили высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром и мазки на стеклах с последующей окраской по Граму. Посевы на чашках инкубировали в термостате при 37 С. В случае выделения культур проводили их идентификацию по вышеописанной схеме.
При отсутствии роста на 9-10 день давали отрицательный ответ. Однако, флаконы с посевами крови не утилизировали, а продолжали выдерживать в термостате при 37 С в течение 4-6 недель, проверяя наличие роста 2-3 раза в неделю. Это проводили с целью выявления медленнорастущих видов микроорганизмов и микрофлоры в L-форме.
Посевы мазков с кожи и аспиратов из булл проводили параллельно на триптиказо-соевый агар с 5% дефибринированной кровью барана и селективно дифференциальные среды: маннит-солевой агар, среду Эндо и агар Сабуро (все среды производства bioMerieux, Франция) методом "истощающего" посева для получения изолированных колоний. Посевы инкубировали в термостате при 37о С в течение 18-24 ч. При отсутствии роста в первые сутки посевы оставляли для дальнейшего подращивания в термостате до 5 сут. с ежедневным визуальным просмотром посевов. Отрицательный результат выдавался после 5 сут. безрезультатной инкубации.
При обнаружении "подозрительных" колоний проводили их идентификацию с помощью коммерческих тест-систем производства фирмы bioMerieux (Франция). Для идентификации стрептококков и родственных им микроорганизмов использовали тест-систему Rapid ID 32Strep, стафилококков, микрококков и родственных им микроорганизмов - ID 32Staph, Enterobacteriaceae и других грамотрицательных палочек -ID 32E, неферментирующих микроорганизмов - ID 32 GN. Идентификацию грибов проводили с помощью тест-системы ID 32C.
Оценку полученных результатов проводили на полуавтоматическом бактериологическом анализаторе ATB Expression (bioMerieux, Франция). Иммунологическая идентификация культур стрептококков и стафилококков. Иммунологическая идентификация выделенных культур осуществлялась с помощью метода латекс-агглютинации. Для идентификации стрептококков групп A, B, C, D, F, G по Lancefield использовали Pastorex Strep, стафилококков - Pastorex Staph Plus (Bio-Rad, Франция) по инструкциям к тест-системам. 4.1.2.4. Определение чувствительности культур к антибиотикам. Все выделенные культуры проверяли на чувствительность к антибактериальным препаратам. Антибиотикограммы cчитывали на полуавтоматическом бактериологическом анализаторе ATB Expression со стрипов АТВ (bioMerieux, Франция), предназначенных для полуколичественного определения чувствительности к антибиотикам. Определение антибиотикочувствительности стрептококков проводили на стрипах ATB Strep 5, стафилококков - ATB Staph 5, Enterobacteriaceae - ATB G-5, неферментирующих микроорганизмов - ATB PSE 5.
Частота выявления ДНК микроорганизмов у больных различными формами рожи
Однако, учитывая, что не у всех больных протекает в виде буллезных форм, наиболее информативным является исследование крови в сочетании с пунктатами очага (+ пунктатами вне очага ) Таким образом, анализ данных, полученных при изучении различного биологического материала (пунктатов из местного воспалительного очага и на расстоянии от него, содержимого булл, крови) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, подтвердил ведущую роль -ГСА в развитии полимикробного инфицирования при буллезно-геморрагической роже. Наряду с гемолитическим стрептококком в развитии инфекционного процесса в ряде случаев, вероятно, участвуют и другие микроорганизмы, такие как S.aureus (MSSA, MRSA), MRCoNS, S.dysgalactiae subspp. equisimilis, S.pneumoniae, S.epidermidis, S.saprophyticus, S.hominis, S.capitis. В редких случаях обнаруживаются C.normanense, C.mucifaciens, P.aeruginosa, Klebsiella spp., Proteus spp.
Наибольшее число микст-инфицирования выявлено у больных при осложненном течении заболевания (56,3%) в виде формирование абсцессов (44%), гнойно-некротических ран (44%), острых флебитов (22%).
Полученные нами данные частично согласуются с данными литературы о выявлении у больных рожей S.aureus и других стафилококков, а также возбудителей других видов (единичные наблюдения) [194,221, 281, 304, 305, 325].
Наибольшее число осложнений, в основном, гнойные отмечены при обнаружении в тканях местного воспалительного очага сочетаний стафилококков с другими микроорганизмами (микстинфекция) или (меньшее число осложнений) при обнаружении ДНК стрептококков. При отсутствии ДНК микроорганизмов из числа тестированных гнойных осложнений не отмечено. Это подчеркивает важность микробного пейзажа в очага местного воспаления в формировании характера течения заболевания и последствий.
Результаты бактериологического исследования свидетельствуют о более скудном составе и количестве выявляемых микроорганизмов, в сравнении с ПЦР. Однако, чистота выявления стрептококков, в том числе S.pyogenes, в очаге была достоверна выше при использовании ПЦР, чем бактериологического метода (40,82% и 2,04%, р = 0,00), а разных стафилококков - достоверно выше при использовании бактериологического метода, чем ПЦР (63,27% и 16,33%, р 0,05), хотя частота выявления S.aureus не различалась. Бактериологическим методом значительно реже выявлены микст, только в смывах с поверхности очага, и не выявлены микст в крови и буллах. Совпадение результатов этих двух методов по виду выявляемого микроорганизма отмечено, в целом, у 36,67% больных.
В области местного воспалительного очага совпадения в выявляемом микроорганизме отмечено в 25,64% случаев. Несовпадение результатов бактериологического метода и ПЦР отмечены за счет высева S.epidermidis и S.saprophyticus с кожи в области очага (приблизительно половина всех несовпадающих результатов - 38,46%) при отсутствии их ДНК в пробах, исследованных ПЦР. Остальные случаи несовпадения - за счет выявления в ПЦР, в основном, ДНК Streptococcus (в т.ч. S.pyogenes). ГЛАВА 8. Значимость микробного пейзажа тканей местного воспалительного очага в формировании особенностей клинического течения рожи у госпитализированных больных
Как представлено выше, частота выявления различных микроорганизмов значительно различалась при использовании бактериологического метода и ПЦР.
В смывах с поверхности местного воспалительного очага наибольшей информативностью обладал бактериологический метод, который позволял выявлять живые культивируемые микроорганизмы, в то время как в пунктатах очага, вне его и буллах, при невысокой высеваемости микроорганизмов, тем не менее, с высокой частотой обнаруживались ДНК стафилококков, стрептококков и некоторых других микроорганизмов. Это свидетельствовало, о том, что в целом ПЦР является более чувствительным методом, позволяющим выявлять ДНК микроорганизмов в тех субстратах, где культивируемые микроорганизмы трудно или невозможно обнаружить (ткани воспалительного очага, детриты тканей и др.)
Совпадение положительных и отрицательных результатов бактериологического исследования и ПЦР по виду выявляемого микроорганизма отмечено в четверти случаев (26%). Еще в 38% случаев были получены положительные результаты только в ПЦР (при отсутствии высева из пробы микроорганизмов), а в 36% - только высев исследования 8.2. Характер течения рожи в зависимости от выявляемых у больных культивируемых микроорганизмов или их ДНК методом ПЦР.
Клинико-лабораторные особенности рожи в зависимости от присутствия культивируемых форм или ДНК стафилококков в очаге местного воспаления
При сравнении частоты обнаружения у больных рожей в различных биосредах стафилококков бактериологическим методом и их ДНК методом ПЦР были выявлены определенные особенности в характере течения заболевания (Таблица 38 ).
В подгруппе больных, у которых стафилококки не были выявлены ни одним из методов, эритематозные и буллезно-геморрагические формы рожи встречались с одинаковой частотой, причем буллезно-геморрагические формы - достоверно реже, чем в 1 и 2 подгруппах. Первичная рожи преобладала над повторной во всех подгруппах, независимо от высева стафилококков, однако, рецидивирующая рожа отмечена только у больных с обнаружением стафилококков.
Достоверно более выраженная лихорадочная реакция, как один из показателей интоксикационного синдрома, была отмечена у больных именно при высеве стафилококков (1 подгруппа), что свидетельствовало о важности присутствии жизнеспособных микроорганизмов, обладающих возможностью продуцировать токсины, в сравнении с 2 (выявление ДНК стафилококов в ПЦР) и 3 подгруппами (без выявления стафилококков любым методом). Также в 1 подгруппе (с высевом стафилококков) отмечено достоверно более раннее начало развития эритемы.
Из остаточных явлений рожи при обнаружении культивируемых стафилококков бактериологическим методом отмечено достоверно большее число больных с явлениями застойной гиперемии в области очага рожи, и в три раза больше случаев с затяжной репарацией очага, трофическими язвами и сохраняющимися ранами (к моменту выписки больных из стационара), чем в подгруппе 3 - без выявления стафилококков.
Как показано в Главе 6, на поверхности кожи местного воспалительного очага у больных рожей часто бактериологическим методом обнаруживались стафилококки -S.aureus и S.epidermidis и/или S.saprophyticus. Представляло интерес изучить состав микроорганизмов, присутствующих непосредственно в очаге (в пунктатах из очага, вне очага и в буллах) в случае высева с поверхности кожи определенных видов стафилококков.
Было установлено, что, в случаях присутствия на поверхности кожи культивируемых S.aureus, в это время непосредственно в очаге определяется значительное число ДНК стафилококков и стрептококков (в 83,87% проб), что достоверно превышает частоту выявления ДНК микроорганизмов в очаге (47,06 %) при высеве с поверхности очага других видов стафилококков (в первую очередь, S.epidermidis и S.saprophyticus), а также число ДНК (47,69%) у больных без высева микроорганизмов с поверхности кожи. Учитывая ранее представленные в главах данные о частом обнаружении у больных рожей культивируемых форм стафилококков (бактериологическим методом) или их ДНК (в ПЦР), мы провели анализ особенностей клинического течения рожи и некоторых клинико-лабораторных показателей раздельно у больных моно-инфекциями (принимая во внимание S.pyogenes в качестве доказанного этиологического агента рожи, вне зависимости от того, был ли этот возбудитель обнаружен бактериологически или по ДНК) и микстинфекциями с участием стафилококков и других микроорганизмов (Таблица 39). Как представлено в таблице, лихорадочная реакций организма присутствовала у больных всех групп, высота лихорадки не различалась по группам, как и частота выявления остаточных явлений и умеренного количества осложнений. Однако, при моноинфекции S.pyogenes и микст-инфекции с участием стафилококков отмечалось более раннее развитие эритемы, более частое формирование застойной гиперемии кожи в области местного воспалительного очага, достоверное увеличение койко-дней в сравнении с больными без высева стафилококков с кожи.
При этом частота осложнений, в том числе гнойных, при моноинфекции и микст-инфекции с участием S.aureus была одинаковой, а при выявлении S.epidermidis и/или S.saprophyticus была ниже. Лейкоцитоз в крови был наиболее высоким в группе больных с присутствием S.aureus на коже в области очага местного воспаления -достоверно выше, чем при моноинфекции или при обнаружении на коже S.epidermidis