Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы повреждений ДНК при хронических вирусных гепатитах (обзор литературы) 13
1.1 Общие сведения о механизмах повреждения ДНК 13
1.2 Состояние проблемы вирусных гепатитов В и С 18
1.3 Повреждения ДНК при вирусном гепатите В 20
1.4 Повреждения ДНК при вирусном гепатите С 27
1.5 Мутагенез ДНК клеток крови и печени при хронических вирусных гепатитах В и С 32
Глава 2. Направления, контингент, материалы и методы исследования 35
2.1 Направления и контингент исследования 35
2.2 Материалы и методы 39
2.2.1 Пробоподготовка 39
2.2.2 Биохимические исследования 41
2.2.2.1 Определение 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина 41
2.2.2.2 Определение 8-нитрогуанина 41
2.2.2.3 Определение общей антиоксидантной активности 41
2.2.2.4 Определение восстановленного глутатиона 41
2.2.2.5 Определение малонового диальдегида и 4-гидрокси-2,3 ноненаля 42
2.2.3 Метод ДНК-комет 42
2.2.4 Гистологические исследования 44
2.2.5 Методы статистического анализа 45
Глава 3. Клиническая характеристика пациентов с хроническими вирусными гепатитами В, С 46
3.1 Клиническая характеристика пациентов на стадии отсутствия фиброза печени (F0) и его начальных стадиях (F1-F2) 47
3.2 Клиническая характеристика больных на стадии «продвинутого» фиброза и цирроза печени (F3-F4) 50
3.3 Клинико-лабораторная характеристика больных 52
3.4 Клиническая характеристика умерших больных на разных стадиях фиброза печени 60
Глава 4. Повреждение ДНК под влиянием нитрозативного и оксидативного стрессов у пациентов с хроническими вирусными гепатитами 63
4.1 Содержание маркеров деструкции ДНК и параметров оксидативного и нитрозативного стрессов 63
4.2 Содержание маркеров деструкции ДНК и параметров оксидативного и нитрозативного стрессов у умерших пациентов 71
4.3 Сравнение клинико-лабораторных показателей сыворотки крови и печени для умерших пациентов 82
Глава 5. Предсказательная математическая модель для оценки стадии фиброза печени 90
5.1 Методология оценки порядковой логистической регрессии с регуляризацией 90
5.2 Результаты оценки порядковой логистической регрессии с регуляризацией 98
5.3 Клинические примеры расчета стадии фиброза печени 102
Заключение 105
Выводы 111
Рекомендации для внедрения в практическое здравоохранение 112
Список сокращений 113
Список литературы 115
- Общие сведения о механизмах повреждения ДНК
- Клинико-лабораторная характеристика больных
- Содержание маркеров деструкции ДНК и параметров оксидативного и нитрозативного стрессов у умерших пациентов
- Клинические примеры расчета стадии фиброза печени
Общие сведения о механизмах повреждения ДНК
ДНК ежесекундно подвергается повреждениям со стороны различных факторов (свободные радикалы, ионизирующее излучение, тяжелые металлы, вирусы, белки воспаления и др.) [22, 113]. Объемные повреждения ДНК вызывают ультрафиолет и мутагены окружающей среды, рентгеновское излучение — двойные разрывы ДНК [2, 11, 20]. Наиболее серьезным типом повреждения структуры ДНК считаются модификации азотистых оснований и разрывы цепей ДНК, вызванные эндогенными окислителями, поскольку это происходит не под действием внешних факторов, а в результате обменных процессов, идущих в самом организме [48].
Как только был открыт универсальный механизм повреждения биологических молекул посредством окислительного стресса, сразу же стали изучаться его свойства, повреждающие ДНК [72]. АФК рассматривались в качестве центрального звена данного процесса, и было показано их прямое повреждающее ДНК действие [71]. Однако несколько позже ученые заговорили о новом механизме окислительных повреждений биомолекул и ДНК (в частности, посредством АФА, что получило название нитрозативного стресса) [155]. Главным представителем АФА является оксид азота II (NO), который синтезируется NO-синтазами [156]. Существует три изоформы данного фермента: нейрональная NO-синтаза (nNOS, также известная как NOS1), индуцибельная NO-синтаза (iNOS или NOS2) и эндотелиальная NO-синтаза (eNOS или NOS3) [148]. iNOS активируется, чтобы интенсивно генерировать NO в воспалительных и эпителиальных клетках в воспалительных условиях, тогда как eNOS и nNOS постоянно экспрессируются и производят относительно небольшое количество NO [97, 154]. Как известно, АФК и АФА продуцируются в норме внутримитохондриально в ходе транспорта электронов на дыхательной цепи и экстрацеллюлярно за счет специфических ферментов. Длительное время стоял вопрос: каким образом высокореакционные молекулы достигают ядерного ДНК? К настоящему времени известно несколько механизмов.
Первый объясняет повреждения ДНК посредством активации ПОЛ и накоплением токсичных продуктов этого процесса в виде малонового диальдегида (МДА) [155], перекисей, гидроперекисей, 16-ненасыщенных жирных кислот и алкенов. Данные вещества и оказывают прямой генотоксический эффект. Также было показано ранее, что усиление спонтанных мутаций ДНК часто сопровождается избыточным образованием АФК и АФА и продуктов ПОЛ [139].
Второй вероятный механизм предполагает, что эффект АФК и АФА может быть опосредован через гидропероксид водорода (Н2О2), образующийся в ходе свободнорадикальных реакций, и его разложение посредством супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и других пероксидаз в непосредственной близости к ДНК на сайтах, хелатированных металлами переменной валентности [3]. Образующийся активный ион гидроксония и свободные радикалы могут взаимодействовать с данными металлами по типу реакции Фентона: Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH При этом продуцируется еще большее количество АФК и наносятся прямые повреждения самой молекуле ДНК. Ионы железа, хелатированные нуклеотидами, способны восстанавливаться мембранными редокс-цепями.
Такого рода хелатные комплексы вызывают окислительное повреждение ядерной ДНК при функционировании ядерных мембран [12]. Большинство авторов предписывают эту способность гидроксильному радикалу (ОН), другие допускают, что аналогичными свойствами могут обладать супероксид анион радикал (О2–) и / или вторичные радикалы, возникающие в результате взаимодействия гидроксильного радикала с низкомолекулярными эндогенными соединениями [1]. Окончательно этот вопрос не разрешен, однако однозначно доказано, что окислительный стресс всегда сопровождается повреждениями ДНК [24]. При строгом подходе, в отсутствие методов, позволяющих отслеживать динамику образования АФК и АФА и их взаимодействия с макромолекулами в живом организме, окислительные повреждения ДНК рассматриваются как основной, если не единственный реальный биомаркер окислительного стресса in vivo [75].
АФК легко нарушают ионный гомеостаз и приводят к увеличению внутриклеточной концентрации Са2+, что влечет за собой активацию ядерных нуклеаз, эндопептидаз, рестриктаз и других ферментов, запуская механизмы деградации ДНК по типу апоптоза. Одновременно с этим Са2+ является важным внутриклеточным сигнальным катионом, который активирует выработку провоспалительных цитокинов и приводит к окислению кардиолипина мембран митохондрий [178], что, в свою очередь, является дополнительным пусковым фактором апоптоза [49, 176, 200].
На рисунке 1.1.1 показано образование 8-оксо-7,8-дигидро-2 -дезоксигуанозина (8-OHdG) и 8-нитрогуанина (8-NO2G) в воспалительных состояниях и в результате мутации [132]. NO реагирует с супероксидом (O2–) с образованием пероксинитрита (ONOO–), высокореакционноспособного вида, вызывающего 8-OHdG и 8-NO2G. Реакция гуанина с ONOO– образует 8-NO2G в качестве основного соединения, тогда как нитрование аденина незначительно по сравнению с его окислением С8 атома. Гликозидная связь между 8-NO2G и дезоксирибозой является химически нестабильной, и это повреждение ДНК может быть самопроизвольно высвобождено, что приводит к образованию апуринового сайта. Апуриновый сайт может образовывать пару с аденином во время синтеза ДНК, что приводит к перекрестьям G: C к T: A [135].
Известно, что в ядросодержащих клетках существует ДНК-полимераза, которая участвует в процессе репарации поврежденной различными способами ДНК и тем самым играет важную роль в процессе репродукции генома и сохранения его первичной информации [147]. Известно несколько изоформ данного фермента, и общая их задача заключается в катализе синтеза ДНК, однако каждый из изоферментов имеет свои особенности, связанные с его конкретной молекулярной структурой [5]. В настоящее время описано 16 видов ДНК-полимераз из разных семейств [85]. Так, в В-семейство полимераз входят , , (принимают участие в репликации хромосом) [127, 190]. -ДНК-полимераза входит в А-семейство и участвует в репарации и репликации митохондриальной ДНК, а -ДНК-полимераза нужна для репарации повреждений ядерной ДНК. Оставшиеся 11 полимераз обеспечивают стабильность генетической информации, включаются в процесс репарации и мутагенез [21, 74, 196]. После открытия основных функций ДНК-полимераз было установлено, что не все ферменты одинаково хорошо справляются со своими задачами. Так, выделены высокоошибочные ДНК-полимеразы в X-, B- и Y-семействах. Все ферменты этих семейств показывают высокую склонность к ошибкам, особенно среди Y-ДНК-полимераз [184]. У человека найдено четыре ДНК-полимеразы Y-семейства: , , [149]. ДНК-полимераза- состоит из нескольких субъединиц — Rev1 и Rev3, — дефицит которых приводит к высокой чувствительности ДНК к нитративному стрессу и обширным точечным мутациям ядерной ДНК за счет большого количества ошибок при репарации, опосредованной данным ферментом. Также установлено, что -ДНК-полимераза при повреждении ДНК и нарушении комплементарности оснований А: G предпочтительно к A включает 8-NO2G в процессе синтеза ДНК, катализируемого данным ферментом [91].
Нитративные и окислительные стрессы вызывают повреждение ДНК, способствуя накоплению мутаций в тканях во всём канцерогенном процессе. Говоря о специфических продуктах повреждения ДНК АФК и АФА, нужно отметить, что 8-OHdG и 8-NO2G считаются не только маркерами воспаления, но и потенциальными мутагенными молекулами, участвующими в канцерогенезе, в качестве общего механизма [61, 64]. Поэтому 8-OHdG и 8-NO2G можно использовать в качестве потенциальных биомаркеров канцерогенеза, связанного с воспалением [71].
Под действием АФК и АФА возникают более 20 химически модифицированных азотистых оснований ДНК [131], в том числе строго специфичные продукты, свидетельствующие об окислительном повреждении ДНК. Однако модификация оснований — далеко не единственный повреждающий эффект окислительного стресса на ДНК. Под действием АФК и АФА возникают одиночные и парные разрывы цепей ДНК, апуриновые и апиримидиновые сайты, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок [146]. Иными словами, практически весь спектр известных сегодня первичных повреждений ДНК рассматривается как предмутационные события [143].
Клинико-лабораторная характеристика больных
Мы проводили статистический анализ полученных результатов стандартного общеклинического обследования больного, который включал в себя клинический анализ крови, биохимический анализ крови, анализ свертывающей и антисвертывающей системы крови, белковые фракции крови, общий анализ мочи, гормоны щитовидной железы. Сразу заметим, что тиреоидная функция у всех пациентов на момент исследования — эутиреоз.
В общем анализе мочи значения не выходили за рамки референсных.
Результаты остальных исследований представлены в таблице 3.3.1.
По результатам тестов на сравнение средних значений показателей между различными группами можно условно разделить имеющиеся показатели, кроме возраста, на несколько категорий:
1. Нет значимых различий в зависимости ни от этиологии гепатита для пациентов с одинаковой стадией фиброза, ни от стадии фиброза для пациентов с одинаковой этиологией гепатита:
- эозинофилы;
- лимфоциты;
- моноциты;
- ЩФ;
- глюкоза;
- железо;
- креатинин;
- мочевина;
- альбумин.
При этом по эозинофилам, лимфоцитам и ЩФ есть значимые различия между контрольной группой и хотя бы одной подгруппой с гепатитом и определенной стадией фиброза печени: для эозинофилов — только по сравнению с пациентами с гепатитом С и F3-4, для лимфоцитов — по сравнению со всеми подгруппами, кроме имеющих гепатит В и F1-2, для ЩФ — по сравнению со всеми подгруппами.
2. По следующим показателям крови есть различия в зависимости от стадии фиброза для пациентов с одинаковой этиологией гепатита, но нет различий между группами с гепатитом В и с гепатитом С при одинаковой стадии фиброза:
- гемоглобин (F3-4 существенно отличается от всех остальных групп; F1-2 — только в группе с гепатитом С от контрольной группы и F3-4);
- тромбоциты (F3-4 существенно отличается от всех остальных групп);
- сегментоядерные нейтрофилы (аналогично);
- СОЭ (аналогично);
- АЛТ (аналогично);
- ПТИ (аналогично);
- палочкоядерные нейтрофилы (статистически значимы только различия в группе пациентов с гепатитом С между F3-4 и F1-2);
- лейкоциты (в группе пациентов с гепатитом С F3-4 существенно отличается от всех остальных групп, включая контрольную; в группе пациентов с гепатитом В F3-4 существенно отличается от F1-2 и F0);
- общий билирубин (в группе пациентов с гепатитом С F3-4 существенно отличается от всех остальных групп, включая контрольную; в группе пациентов с гепатитом В F3-4 существенно отличается от контрольной группы);
- общий белок (аналогично);
- ГГТП (аналогично);
- глобулины (в группе пациентов с гепатитом С F3-4 существенно отличается от F0 и F1-2);
Иными словами, можно предположить, что эти показатели связаны со стадией фиброза, но не связаны с этиологией гепатита. Для перечисленных выше показателей, по которым наблюдаются статистически значимые различия между контрольной группой и F0 (палочкоядерные нейтрофилы, АЛТ, ГГТП (только гепатит В), ПТИ), а также по ЩФ и лимфоцитам из первой категории показателей можно сделать вывод, что изменения наступают еще на стадии F0, то есть связаны с наличием у пациента гепатита как такового. В остальных случаях — на стадии F1-2 или F3-4.
3. По следующим показателям есть значимые различия между группами пациентов с одинаковой стадией фиброза, но разной этиологией гепатита: - эритроциты, ВН (для всех стадий фиброза);
- АСТ (только для стадии F3-4).
То есть значения этих показателей предположительно связаны не только с наличием гепатита и стадией фиброза, но и с этиологией гепатита. По остальным показателям из данной категории изменения в обеих группах по гепатиту изменения наступают уже на стадии F0.
В целом, внутри группы пациентов с гепатитом В со стадией фиброза связаны следующие показатели1 (по остальным связи со стадией не обнаружено):
- ВН (значимы различия между всеми парами стадий фиброза);
- гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, сегментоядерные нейтрофилы, СОЭ, АЛТ, АСТ, ПТИ (существенные изменения наступают на стадии F3-4: значения этих показателей в группе F3-4 существенно отличаются как от F0, так и от F1-2, в то время как различия между F1-2 и F0 статистически незначимы);
- лимфоциты, общий билирубин (значимы только различия между F3-4 и FI-2);
- моноциты (значимы только различия между F1-2 и F0).
В целом, внутри группы пациентов с гепатитом С со стадией фиброза связаны следующие показатели (по остальным связи со стадией не обнаружено):
- АЛТ, глобулины (значимы различия между всеми парами стадий фиброза);
- гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, сегментоядерные нейтрофилы, СОЭ, общий билирубин, общий белок, АСТ, ГГТП, ПТИ (существенные изменения наступают на стадии F3-4: значения этих показателей в группе F3-4 существенно отличаются как от F0, так и от F1-2, в то время как различия между F1-2 и F0 статистически незначимы);
- палочкоядерные нейтрофилы (значимы различия между F3-4 и F1-2, а также между F1-2 и F0).
Содержание маркеров деструкции ДНК и параметров оксидативного и нитрозативного стрессов у умерших пациентов
По умершим пациентам был проведен дескриптивный анализ, аналогичный тому, результаты которого были представлены выше для живых пациентов. В таблице 4.2.1 содержатся результаты парных тестов Манна — Уитни с коррекцией Холма на сравнение средних значений показателей между группами умерших пациентов по этиологии гепатита и стадии фиброза печени.
По аналогии с анализом параметров живых пациентов, по результатам тестов на сравнение средних значений показателей между различными группами умерших можно условно разделить имеющиеся показатели, кроме возраста, на несколько категорий. При этом, говоря о статистической значимости различий, из-за маленького размера выборки умерших пациентов мы будем использовать значение в 10% (вместо 5%) в качестве порогового уровня значимости.
1. Нет значимых различий в зависимости ни от этиологии гепатита для пациентов с одинаковой стадией фиброза, ни от стадии фиброза для пациентов с одинаковой этиологией гепатита:
- 4-HNE в сыворотке крови. При этом по данному показателю есть значимые различия между контрольной группой и подгруппами с гепатитом В F3-4 и гепатитом С F3-4.
2. Есть различия в зависимости от стадии фиброза для пациентов с одинаковой этиологией гепатита, но нет различий между группами с гепатитом В и с гепатитом С при одинаковой стадии фиброза:
- ОАА в сыворотке крови (для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 по сравнению с F0 и контрольной группой);
- GSH в сыворотке крови (для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 и F0);
- МДА в сыворотке крови (для пациентов с ХВГВ и ХВГС значимые различия между F3-4 по сравнению с F0 и контрольной группой);
- МДА в ткани печени (для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 и остальными группами, включая контрольную; для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 по сравнению с F0 и контрольной группой);
- 8-NO2G в ткани печени (для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 и остальными группами, включая контрольную; для пациентов с гепатитом С значимые различия между F3-4 по сравнению с F0 и F1-2);
- %ДНК в хвосте кометы гепатоцитов (Рисунок 4.2.1) (для пациентов с ХВГВ и ХВГС значимые различия между всеми парами стадий фиброза печени, а также в парах отдельных стадий с контрольной группой).
То есть можно предположить, что эти показатели связаны со стадией фиброза, но не с этиологией гепатита. Для перечисленных выше показателей, по которым наблюдаются статистически значимые различия между контрольной группой и F0 (МДА кровь, МДА печень, %ДНК в хвосте гепатоцитов (только гепатит В)), можно предположить, что изменения наступают еще на стадии F0, то есть связаны с наличием у пациента гепатита как такового.
3. По следующим показателям есть значимые различия между группами пациентов с одинаковой стадией фиброза, но разной этиологией гепатита:
- 8-OHdG в сыворотке крови, %ДНК в хвосте лимфоцитов (для всех степеней фиброза печени);
- 8-N02G в сыворотке крови (только для стадии F3-4);
- ОАА в ткани печени, 8-OHdG в ткани печени, GSH в ткани печени, 4-HNE в ткани печени (только для стадии F0).
То есть значения этих показателей предположительно связаны не только с наличием гепатита и стадией фиброза, но и с этиологией гепатита.
В целом, внутри группы пациентов с гепатитом В со стадией фиброза связаны следующие показатели (по остальным связи со стадией не обнаружено):
- 8-N02G в сыворотке крови, 8-OHdG в сыворотке крови, GSH в ткани печени, 4-HNE в ткани печени, %ДНК в хвосте лимфоцитов, %ДНК в хвосте гепатоцитов (значимы различия между всеми парами стадий фиброза);
- 4-HNE в сыворотке крови, 8-N02G в ткани печени, МДА в ткани печени (значимы только различия между F3-4 по сравнению с F0 и F1-2);
- МДА в сыворотке крови (значимы только различия между F0 по сравнению с F1-2 и F3-4);
- ОАА в ткани печени (значимы различия между F0 и F1-2, а также междуРЗ-4 иР1-2);
- 8-OHdG в ткани печени (значимы различия только между F3-4 и F0).
В целом внутри группы пациентов с гепатитом С со стадией фиброза связаны следующие показатели (по остальным связи со стадией не обнаружено):
- 8-N02G в сыворотке крови, МДА в сыворотке крови, ОАА в ткани печени, 8-N02G в ткани печени, 8-OHdG в ткани печени, 4-HNE в ткани печени, МДА в ткани печени, %ДНК в хвосте лимфоцитов, %ДНК в хвосте гепатоцитов (значимы различия между всеми парами стадий фиброза); - GSH в сыворотке крови (значимы только различия между F3-4 по сравнению с F0 и F1-2);
- GSH в ткани печени (значимы только различия между F0 по сравнению с F1-2 и F3-4);
- ОАА в сыворотке крови, 8-OHdG в сыворотке крови, 4-FINE в сыворотке крови (значимы различия только между F3-4 и F0).
Клинические примеры расчета стадии фиброза печени
Пример № 1.
Пациент И. (45 лет) обратился на прием по поводу положительного анализа крови на aHCV и положительной ПЦР РНК ВГС (качественно). В результатах обследований (значимых для расчета стадии фиброза):
1) Подставляем данные значения в формулы для es1 и es2:
es1 = exp(–0,933 – 0,049 45 + 0,410 3,6 – 0,012 108 – 0,014 95 – 0,053 41,5 — 0,023 18,83 + 0,027 90) = exp(–4,49059) = 0,011214026;
es2 = exp(–6,497 – 0,043 45 + 2,417 3,6 – 0,012 108 – 0,014 95 – 0,053 41,5 – 0,023 18,83 + 0,027 90) = exp(–2,55939) = 0,077351911.
2) Полученные значения es1 и es2 используем, чтобы посчитать вероятности по формулам 4, 5 и 6. Оцениваем, какое значение из них максимальное, — по нему и определяем предсказанную стадию фиброза.
Вероятность F0:
Вероятность F1-2:
Вероятность F3-4:
Значение, полученное по формуле 6 для данного случая, — наибольшее. Следовательно, у данного пациента стадия фиброза соответствует F3-F4.
Фактическая стадия фиброза печени у данного пациента по результатам эластометрии — F4.
Пример № 2.
Пациент Ж. (40 лет) обратился на прием по поводу положительного анализа крови на HBsAg и положительной ПЦР ДНК ВГВ (качественно). В результатах обследований (значимых для расчета стадии фиброза)8:
1) Подставляем данные значения в формулы для es1 и es2:
es1 = exp(6,354 – 0,019 40 – 0,096 5,2 – 0,066 7 – 0,770 10,35) = 0,037165302;
es2 = exp(11,944 – 0,019 40 – 0,096 5,2 – 0,066 7 – 0,770 10,35) = 9,950475267.
2) Полученные значения es1 и es2 используем, чтобы посчитать вероятности по формулам 4, 5 и 6. Оцениваем, какое значение из них максимальное, — по нему и определяем предсказанную стадию фиброза.
Вероятность F0:
Вероятность F1-2:
Вероятность F3-4:
Значение, полученное по формуле 5 для данного случая, — наибольшее. Следовательно, у данного пациента стадия фиброза соответствует F1-F2.
Таким образом, анализ прогностической значимости показателей, полученных от пациентов с ХВГВ и ХВГС, показал, что существенный информативный вклад в диагностику стадии фиброза печени вносит степень одно- и двунитевых разрывов ДНК, которая выражается в виде %ДНК в хвосте кометы. Причем информация, полученная о стадии повреждений ДНК в лимфоцитах периферической крови, коррелирует с таковой в гепатоцитах и может быть использована в качестве главного интегративного показателя для оценки стадии фиброза с вероятностью 86%.