Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные взгляды на этиологию, патогенез, диагностику и лечение токсоплазмоза, особенности токсоплазмоза у беременных женщин 12
1.1. Этиология, эпидемиология и патогенез токсоплазмоза 12
1.2. Противопаразитарный иммунный ответ и клиника токсоплазмоза 17
1.3. Лабораторная диагностика токсоплазмоза 22
1.4. Лечение токсоплазмоза 26
1.5. Особенности патогенеза и клиники токсоплазмоза у беременных женщин 28
1.6. Особенности диагностики и лечения токсоплазмоза у беременных женщин 32
Глава 2. Материал и методы исследования 37
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Схема лечения токсоплазмоза 40
2.3. Методы исследования 40
2.4. Статистическая и математическая обработка данных 43
Глава 3. Оценка значения эпидемиологических, клинико лабораторных и серологических признаков токсоплазмоза у беременных женщин 45
3.1. Эпидемиологический анализ возможных источников токсоплазмоза у беременных женщин 45
3.2. Клинико-лабораторная характеристика беременных женщин с подозрением на токсоплазмоз 47
3.3. Серологическая диагностика токсоплазмоза у беременных женщин 54
3.4. Серологическая характеристика инаппарантного токсоплазмоза 64
Глава 4. Серологическая оценка эффективности лечения острого и инаппарантного токсоплазмоза у беременных женщин 73
4.1. Серологическая оценка эффективности лечения острого токсоплазмоза у беременных женщин 73
4.2. Серологическая оценка эффективности лечения инаппарантного токсоплазмоза у беременных женщин 78
4.3. Серологическая оценка эффективности лечения различных форм токсоплазмоза у беременных женщин перед родами 84
Глава 5. Серологическая оценка эффективности лечения токсоплазмоза у женщин в послеродовом периоде и у рожденных ими детей 96
5.1. Отдаленные результаты серологической оценки различных форм токсоплазмоза у женщин в послеродовом периоде 96
5.2. Результаты определения антител в крови детей, рожденных матерями с различными формами токсоплазмоза 101
Заключение и обсуждение 107 выводы 118
Практические рекомендации 121
Список сокращений и условных обозначений 123
Список иллюстративного материала 125
Список литературы 130
- Лабораторная диагностика токсоплазмоза
- Методы исследования
- Серологическая диагностика токсоплазмоза у беременных женщин
- Серологическая оценка эффективности лечения инаппарантного токсоплазмоза у беременных женщин
Введение к работе
Актуальность темы. Токсоплазмоз остается одной из актуальных
проблем современной инфекционной патологии и включен в программу ВОЗ
по изучению зоонозов, что вызвано широким повсеместным
распространением заболевания и многообразием клинических форм его
проявления от здорового бессимптомного носительства до тяжелых,
летальных форм болезни [М. Г. Авдеева, А. А. Кончакова, 2012;
Н. М. Беляева и др., 2014; Ф. К. Дзуцева и др., 2011]. В 95–99% случаев это заболевание протекает бессимптомно и остается не диагностированным ввиду отсутствия патогномоничных признаков [Д. Б. Гончаров, 2005].
Токсоплазмоз – зоонозная инфекция, а возбудитель попадает в
организм человека через загрязненные пищевые продукты и воду, реже –
контактным путем [J. P. Dubey, E. G. Lago, S. M. Gennary et al., 2012]. Однако
существует способ передачи возбудителя и от человека к человеку, которым
является трансплацентарный путь от матери к плоду, в связи с чем
токсоплазмоз представляет особую опасность для беременных женщин
[О. А. Землянский, 2004; Н .А. Матвиенко, 2007; M. H. Bessieres, A. Berrebi,
S. Cassaing et al., 2009]. Он вызывает прерывание беременности в ранние
сроки, мертворождение, рождение детей с аномалиями развития и
поражением ЦНС и других органов. Примерно 5–7% женщин впервые
инфицируются в период беременности, в этом случае около 39% детей
рождается с признаками тяжелейшей патологии – врожденным
токсоплазмозом [Т. И. Долгих, 2011].
Существует единое мнение об угрожающем влиянии на беременность острой формы токсоплазмоза [Е. А. Андреева, 2006; Ю. В. Лобзин, В. В. Васильев, 2001; R. Gilbert, H. K. Tan, S. Cliffe et al., 2006]. Тем не менее, было установлено, что и при бессимптомном (инаппарантном) течении инфекции, часто встречающемся у беременных, поражение плода происходит с такой же частотой, как и при манифестном токсоплазмозе [Т. И. Долгих, 2011]. В связи с этим наличие указанных форм токсоплазмоза у беременных женщин служит показанием для проведения соответствующего лечения [D. R. Schmidt, B. Hogh, O. Andersen et al., 2006; M. Soheilian, M.-M. Sadoughi, M. Ghajarnia et al., 2005] и должно быть хорошо обосновано диагностическими исследованиями [J. Bortoletti Filho, E. Araujo Junior, S. Carvalho Nda et al., 2013].
Особое значение имеет врожденный токсоплазмоз. В частности, говоря о риске инфицирования плода в процессе вынашивания беременности, следует подчеркнуть, что заражение обычно происходит, если инфекция у
матери свежая, при этом вероятность заражения зависит от срока инфицирования матери во время беременности: в первом триместре — вероятность 10-25%, во втором – 30-50%, в третьем— 60-90%. В настоящее время частота встречаемости врожденного токсоплазмоза составляет от 1 до 8 на 1000 новорожденных.
Степень разработанности проблемы. Диагноз токсоплазмоза
ставится на основании клинических данных и результатов функциональных
исследований при решающем значении лабораторных данных,
преимущественно основанных на оценке специфического иммунитета [Т. И. Долгих, 2011]. Дело в том, что в лабораторной диагностике токсоплазмоза у беременных женщин, как и в остальных случаях, используют ПЦР и серодиагностику [J. G. Montoya, J. S. Remington, 2008; J. S. Remington, 2006], однако только серологические методы позволяют в той или иной степени определить форму инфекционного процесса [O. Liesenfeld, J. G. Montoya, S. Kinney et al., 2001; J. G. Montoya, 2002]. К сожалению, примерно в 8% случаев серологические реакции бывают ложноположительными или ложноотрицательными [Т. И. Дмитриченко, В. М. Семенов, В. Ю. Найденов и др., 2008; C. Chemla, I. Villena, D. Aubert et al., 2002].
Вместе с тем, несмотря на значимость серологических исследований в
диагностике токсоплазмоза, эта проблема в настоящее время разработана
недостаточно, так как не уточнена значимость используемых серологических
исследований в диагностике острых или бессимптомных форм
токсоплазмоза, их роль в решении вопроса о необходимости проведения противопротозойной терапии и в контроле эффективности терапии токсоплазмоза у беременных женщин.
Решение этих вопросов приобретает особую ценность при диагностике токсоплазмоза у беременных женщин, что и явилось целью настоящей работы.
Таким образом, инфицирование токсоплазмозом во время
беременности чрезвычайно ответственно в связи с высоким риском развития тяжелых полиорганных поражений у плода и диктует необходимость совершенствования критериев диагностики и ведения данной категории пациентов.
Цель исследования: разработать систему оценки серологических реакций при диагностике различных форм токсоплазмоза у беременных женщин как основы для назначения лечения и контроля эффективности стандартной противопротозойной терапии.
Задачи исследования:
-
Оценить значение эпидемиологических и рутинных клинико-лабораторных данных для подтверждения диагноза токсоплазмоза в целом и диагностики различных клинических вариантов течения токсоплазмоза у беременных женщин.
-
Уточнить значение серологических реакций (реакции непрямой иммунофлуоресценции, иммуноферментного определения уровней IgM и IgG антител в парных сыворотках, авидности IgG антител) в диагностике различных форм токсоплазмоза у беременных женщин на основании наблюдения их динамики.
-
Разработать систему оценки серологических реакций при различных формах токсоплазмоза у женщин в соответствии с триместром беременности как показания к назначению противопротозойной терапии.
-
Подтвердить соответствие данных по оценке и характеристике антител к токсоплазмам, полученных в ходе беременности, отдаленным результатам серологического обследования женщин после родов.
-
Подтвердить соответствие данных по оценке и характеристике антител к токсоплазмам, полученных в ходе беременности, отдаленным результатам серологического обследования детей, рожденных женщинами с различными формами токсоплазмоза.
Научная новизна.
Выделены серологические критерии для назначения
противопротозойной терапии и определены наиболее информативные серологические тесты для контроля эффективности противопротозойного лечения при остром и инаппарантном токсоплазмозе в соответствии со сроками его проведения.
Проведена работа по оптимизации оценки серологических реакций у беременных женщин с токсоплазмозом на разных сроках беременности.
Сформирована система серологических маркеров острого,
инаппарантного и латентного токсоплазмоза, имеющих диагностическое значение у беременных и новорожденных.
Создана модель диагностического процесса при токсоплазмозе у беременных женщин.
Выявлена корреляция между содержанием IgG антител к токсоплазмам в организме матери и рожденного ею ребенка при остром токсоплазмозе в период родов.
Предложен алгоритм использования серологических маркеров в диагностике токсоплазмоза в целом и в дифференциальной диагностике острого, инаппарантного и латентного токсоплазмоза.
Подтверждена целесообразность трехкурсового лечения спирамицином и фолиевой кислотой и его эффективность не только в отношении самой беременной женщины, но и для предотвращения врожденного токсоплазмоза у рожденного ею ребенка;
Теоретическая и практическая значимость.
Теоретическая значимость проведенного исследования подтверждается тем, что клинико-эпидемиологический анамнез у беременных женщин позволяет сформировать концепцию оценки серологических реакций для проведения ранней диагностики токсоплазмоза на разных сроках беременности, что создает возможность профилактики внутриутробного поражения плода. Наличие признаков острого инфекционного процесса у беременных женщин требует детального обследования с обязательным включением диагностических маркеров токсоплазмоза.
Практическая значимость определяется тем, что полученные данные
позволяют своевременно выявить наличие токсоплазмоза на разных сроках
беременности, тем самым предотвратить заражение плода и определить четкие
серологические маркеры острого, инаппарантного и латентного токсоплазма,
показать роль вспомогательных клинико-лабораторных показателей,
разработать комплекс серологических признаков для назначения
противопротозойной терапии беременным женщинам и контроля ее эффективности. Использование этого диагностического комплекса позволит уточнить наиболее рациональные подходы к срокам назначения стандартной схемы лечения токсоплазмоза как для успешной терапии беременных женщин, так и для профилактики врожденного токсоплазмоза у новорожденных.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Доказано, что выявление у беременных женщин при
эпидемиологическом исследовании сведений о возможном заражении
токсоплазмозом, и при клинико-лабораторном - признаков острого
инфекционного процесса, требует обязательного проведения серологической
диагностики токсоплазмоза, что позволяет верифицировать диагноз
токсоплазмоза, дифференцировать первичную инаппарантную и латентную
формы заболевания.
2. Доказано, что предложенная система критериальной оценки
серологических реакций, включающая РНИФ, ИФА с определением уровней
IgG и IgM, авидность IgG в динамике, позволяет с высокой степенью
достоверности получить панель серологических критериев: положительная
РНИФ в разведении сыворотки, равном или превышающем диагностический титр (1:320); уровень IgM антител к токсоплазмам 2,4 МЕ/мл, уровень IgG антител к токсоплазмам > 250 МЕ/мл, индекс авидности IgG антител < 25%, свидетельствуют об остром токсоплазмозе; положительная РНИФ в разведении сыворотки, равном или превышающем диагностический титр (1:320); уровень IgM антител к токсоплазмам в диапазоне 1,7-2,2 МЕ/мл, уровень IgG антител к токсоплазмам > 300 МЕ/мл, индекс авидности IgG антител 30%., свидетельствует о наличии инаппарантной формы токсоплазмоза; положительная РНИФ в разведении сыворотки, равном или превышающем диагностический титр (1:320); уровень IgM антител к токсоплазмам в диапазоне 0,3-0,5 МЕ/мл, уровень IgG антител к токсоплазмам > 300 МЕ/мл, индекс авидности IgG антител > 40%, являются серологическими маркерами латентного токсоплазмоза, что позволяет дифференцировать различные формы токсоплазмоза у беременных женщин, наметить объем лечения с последующей профилактикой врожденной инфекции у плода.
3. Доказано, что трехкурсовая противопротозойная терапия с применением спирамицина (ровамицина) 3 млн. МЕ (1таб.) 3 раза в день и фолиевой кислоты 1г. (1 таб.) 3 раза в день при 10-дневном курсе высокоэффективна на разных сроках беременности, что позволяет предотвратить развитие врожденного токсоплазмоза у новорожденного.
Соответствие диссертации Паспорту научной специальности.
Диссертационное исследование Зембатовой С.Х. включает изучение особенностей эпидемиологического и клинического течения токсоплазмоза у беременных женщин в разных триместрах беременности, а так же особенностей комплексной серологической диагностики для оценки влияния острой и инаппарантной формы токсоплазмоза на плод, направленную на повышение эффективности лечения и профилактики, что соответствует паспорту специальности 14.01.09. - Инфекционные болезни. Медицинские науки и областям исследования: п.2 «Клинические проявления инфекционного процесса, повреждения и нарушения функции различных органов и систем, особенности течения заболевания во всех возрастных группах, в различных условиях окружающей среды и в сочетании с другими болезнями. Прогнозирование течения инфекционного заболевания и его исходов», п.3 «Диагностика инфекционных болезней с использованием клинических, микробиологических, генетических, иммунологических, биохимических, инструментальных и других методов исследования, дифференциальная диагностика с другими болезнями инфекционной и неинфекционной природы» и п.4 «Лечение инфекционных болезней: этиотропная, патогенетическая
генотерапия, диетотерапия, санаторно-курортное лечение, терапия последствий болезни и реабилитация».
Внедрение результатов исследования в практику. Научные положения и рекомендации, содержащиеся в диссертации, включены в лекционный курс «Инфекционные болезни» основной образовательной программы и в учебные планы циклов повышения квалификации врачей-инфекционистов на кафедре инфекционных болезней ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России. Результаты диссертационной работы используются в практической работе городского Центра по токсоплазмозу городской клинической больницы им. С.П.Боткина ДЗ г. Москвы.
Апробация работы. Апробация работы состоялась 10 марта 2016 года (протокол №5) на расширенном заседании кафедры инфекционных болезней ГБОУ ДПО РМАПО, при участии кафедр: тропических и паразитарных болезней, акушерства и гинекологии ГБОУ ДПО РМАПО, кафедры аллергологии и иммунологии факультета повышения квалификации медработников Медицинского института ФБГОУ ВПО РУДН Министерства образования и науки РФ, врачей-инфекционистов ГБУЗ ИКБ №1 и ГУЗ ГКБ им. С.П. Боткина г. Москвы. Тема диссертации утверждена на заседании Совета терапевтического факультета ГОУ ДПО РМАПО 14 апреля 2011г., (протокол №4.) Проведение диссертационного исследования одобрено Комитетом по этике научных исследований ГБОУ ДПО РМАПО, протокол № 2 от 03 марта 2014 года.
Личное участие автора. Автором лично проведено обследование 515 беременных женщин: изучены анамнестические, эпидемиологические, гинекологические данные, особенности клинической картины заболевания, назначены необходимые серологические и инструментальные исследования. Автором разработан алгоритм проведения и оценки серологических тестов, включающего определение показаний для назначения лечения. Автор участвовала в проведении серологических тестов: иммуноферментный анализ IgG, IgM, реакция непрямой иммунофлуоресценции, авидность IgG сыворотки крови. Анализ, обобщение материалов, статистическая обработка результатов по всем направлениям исследования проведены лично автором.
Публикации и участие в научных конференциях.
По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ -3 статьи. Материалы диссертации доложены и обсуждены на II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 29-31 марта 2010 г.), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г.Москва, 28-30 марта 2011 г.), IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по
инфекционным болезням (г. Москва, 26-28 марта 2012 г.), V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 25-27 марта 2013 г.), международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии» (Москва, 17-19 ноября 2015 г.).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, трёх глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 28 рисунками. Список литературы содержит 238 источников, из них 52 отечественных и 186 зарубежных авторов.
Лабораторная диагностика токсоплазмоза
Возбудитель токсоплазмоза Toxoplasma gondii относится к царству простейших (Protozoa), классу Coccidia, отряду Eucoccidiorida, типу Apicomplexa [60]. Этот условно патогенный облигатный внутриклеточный паразит был открыт около 100 лет назад [98; 99], его первое описание у Северо-Африканских грызунов Ctenodactylus gondii дали в 1908 году C.Nicolle & L.Manceaux [166], а при заболевании кроликов в Бразилии – в том же году A.Splendore [206].
Впоследствии было установлено, что Toxoplasma gondii поражает многих теплокровных животных (птиц, млекопитающих), в том числе человека [95; 216]. Этим довольно успешным паразитом в настоящее время инфицировано около 2 миллионов человек [116]. Врожденный токсоплазмоз, проявляющийся гидроцефалией, ретинохориоидитом, энцефалитом, был описан в 1920 году, а в 1980 году Toxoplasma gondii была признана одним из главных возбудителей оппортунистических инфекций, развивающихся у больных ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД с частотой встречаемости 18–20% [59; 145; 151; 179], а также при иммуносупрессии, сопровождающей лечение онкологических больных, трансплантацию органов [116; 222]. Период с 1983 по 2008 годы признан самым плодотворным в изучении этой инфекции [95].
В настоящее время не вызывает сомнений, что токсоплазмоз — широко распространенная зоонозная паразитарная инфекция, характеризующаяся полиморфизмом клинических проявлений и значительной вариабельностью течения процесса: от здорового, бессимптомного носительства до тяжелых, летальных форм болезни [8; 20; 38]. Предполагают, что во всём мире до 65% всего человечества заражено паразитами Toxoplasma gondii. Но при этом процент заражения сильно различается на разных континентах и в разных странах. Так, у 33,1% жителей США старше 12 лет были найдены специфичные для токсоплазмы антитела IgG, указывающие на то, что они были когда-либо заражены токсоплазмой [132]. В Швейцарии также около трети населения имеет антитела к токсоплазмам [135]. Исследование, проведенное среди беременных женщин в Австрии, показало, что около 35% из них являются носителями антител к токсоплазмам [93]. В Китае число серопозитивных беременных женщин не превышает 10% [107]. В Мексике частота встречаемости токсоплазмоза колеблется от 15% до 50%, в наибольшей степени заболевание проявляется в таких группах риска как женщины с самопроизвольными выкидышами (36%), у иммунокомпроментированных пациентов (28%), у больных с психическими расстройствами (38%) [106]. Очень широкое распространение, особенно среди детей и беременных женщин, токсоплазмоз имеет в странах Африки [89; 95] или, например, в Бразилии [87]. В целом отмечают явное преобладание токсоплазмоза в Европе, Южной Америке, Африке [174].
Инфицированность токсоплазмами населения Российской Федерации в среднем составляет около 20–30%. Показатели пораженности выше в регионах с теплым климатом, а также среди лиц ряда профессиональных групп: рабочих мясокомбинатов и звероводческих ферм, животноводов, ветеринарных работников и др. Инфицированность женщин, как правило, в 2–3 раза выше, чем у мужчин. При этом заболеваемость токсоплазмозом во много раз ниже показателей инфицированности, однако трудности диагностики, несмотря на обязательную регистрацию данного заболевания, не позволяют судить об истинном уровне распространения инфекции [1; 20; 51].
Долгое время считалось, что при сохранности иммунной системы токсоплазмоз всегда асимптоматичен, однако ассоциация этой инфекции с нейропсихиатрическими заболеваниями привела к предположению, что латентная инфекция может проявляться неврологическими эффектами [116], что значительно повышает актуальность проблемы.
Жизненный цикл Toxoplasma gondii включает несколько основных стадий: спорозоиты, тахизоиты, брадизоиты [88]. Кошки и другие представители семейства кошачьих являются основным хозяином, в организме которых может осуществляться как бесполое (шизогония), так и половое размножение (гаметогония) паразита. Первыми формируются брадизоиты (в течение 3–10 дней), затем тахизоиты (13 дней), затем половые формы – ооцисты (после 18 дней) [86].
В настоящее время известно, что около 10% кошек контаминированы токсоплазмами [67]. Образование ооцист происходит в стенке тонкой кишки кошачьих, употребляющих в пищу сырое мясо в домашних условиях или, например, во время охоты на мышей и крыс, а затем они вместе с испражнениями выделяются в окружающую среду, где сохраняют жизнеспособность около 1 года [64; 67]. При этом очень важным является попадание ооцист в организм человека через пищевые продукты преимущественно растительного происхождения, контактирующие с загрязненной водой и почвой, в то время как прямой контакт человека, например, с домашними кошками, не столь опасен [95]. Большое значение как фактор передачи токсоплазмоза имеет вода [60; 80; 156].
У ооцист при попадании в пищеварительный тракт других теплокровных животных (промежуточных хозяев) под влиянием пищеварительных ферментов истончается оболочка с высвобождением спорозоитов. Спорозоиты проникают через эпителиальный барьер слизистой оболочки кишечника, через сосудистую стенку и на этой стадии приобретают способность трансформироваться в тахизоиты [67; 116].
Тахизоиты – высоко репликативные формы токсоплазм, способные к широкому распространению по организму промежуточного хозяина и внутриклеточному размножению практически во всех типах ядерных клеток. Их присутствие в организме, как правило, сопряжено с острым токсоплазмозом, а заражение промежуточных хозяев этими формами может происходить, например, при переливании крови и других инвазивных процедурах [116; 161]. Тахизоиты способны к быстрой диссеминации на зараженном организме, они успешно распространяются по всему организму, избирательно поражая головной мозг, глаза, плаценту [117], преодолевая гематоэнцефалический, гематоглазной, плацентарный бaрьеры [100; 186]. Оседая в органах, тахизоиты трансформируются в брадизоиты [67]. Распространению тахизоитов способствует их свойство поражать макрофаги, при этом, проникая в макрофаги в процессе фагоцитоза, тахизоиты изменяют структуру окружающих их клеточных мембран путем встраивания в их состав собственный белков [7]. В результате фагосома становится неузнаваемой для лизосом, и тахизоиты становятся недосягаемыми для гидролитических ферментов лизосом [16]. Кроме того, тахизоиты блокируют апоптоз зараженных клеток, ингибируя процессы их активации и увеличивая экспрессию антиапоптозных молекул, активность АДФ-рибозы. В результате макрофаги, зараженные токсоплазмами, становятся более устойчивыми к различным индукторам апоптоза и живут намного дольше не зараженных [109]. Показано также, что подавление апоптоза является одним из механизмов персистенции, в первую очередь, низковирулентных штаммов паразита [140], а высоковирулентные штаммы, наоборот, стимулируют апоптоз [109]. Брадизоиты – медленно реплицирующая форма, образующаяся из тахизоитов, они более характерны для хронического токсоплазмоза. Внутриклеточная репликация брадизоитов не приводит к разрыву клетки, а наоборот, из клеточных вакуолей, в которых размножаются брадизоиты, формируются цисты, содержащие до 1000 брадизоитов [161]. Цисты имеют плотную оболочку, защищающую паразита от иммунных реакций, хранятся годами, придавая инфекции латентное течение. Располагаются цисты обычно в мышцах и головном мозге промежуточных хозяев, хотя описаны и в почках, печени, легких. Цисты могут содержаться в мясных пищевых продуктах и обеспечивать заражение токсоплазмами [116; 236].
Методы исследования
Гемометрия. Общий анализ крови проводился на гематологическом анализаторе фирмы “BECMAN-COULTER” (США) в соответствии с инструкцией по применению данного прибора. Анализу подвергались: число эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, число тромбоцитов, число лейкоцитов, процентное соотношение в крови базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, СОЭ.
Биохимическое исследование. Биохимические исследования крови осуществлялись на биохимических анализаторах Hitachi Roche – 902 Automatic analyzer (Япония), Erba XL-600 (Германия), A-25 Bio Systems (Испания) в соответствии с инструкциями по применению приборов. Анализировались уровни общего, прямого и непрямого билирубина, глюкозы, холестерина, общего белка, мочевины, креатинина, активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ), cодержание ионов натрия, калия, железа.
Иммуноферментный анализ для определения уровней IgM и IgG в сыворотке крови. Исследования проводились с использованием микропланшетного ридера Sunrise Tecan (Швейцария) и наборов реагентов «Toxoplasma IgM EIA» и «Toxoplasma IgG EIA» в соответствии с инструкциями по применению прибора и наборов реагентов. Определение IgM- и IgG-антител к антигенам Toxoplasma spp. основано на использовании «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, при котором на внутренней поверхности лунок планшета находится иммобилизованный антиген Toxoplasma gondii. Антитела из исследуемого образца крови связываются с антигеном на поверхности лунки. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата поликлональных антител к IgM или IgG человека с пероксидазой хрена. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски, определяемая впоследствии прибором, прямо пропорциональна концентрации специфических IgM или IgG антител к антигенам Toxoplasma spp. Результат теста выражается в условных единицах – МЕ/мл.
Иммуноферментный анализ для определения авидности IgG сыворотки крови. Как и в предыдущем случае, исследования осуществлялись с использованием микропланшетного ридера Sunrise Tecan (Швейцария) на основе набора реагентов «ВектоТоксо-IgG-авидность» в соответствии с инструкциями по применению прибора и наборов реагентов. Метод определения основан на трехстадийном твердофазном иммуноферментном анализе. На первой стадии исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках параллельных рядов с иммобилизованным антигеном Toxoplasma gondii. Имеющиеся в сыворотке специфические антитела к токсоплазмам связываются с антигеном. На второй стадии после внесения белок-диссоциирующего агента в один из параллельных рядов происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело», включающего IgG с более низкими константами связывания (низкой авидностью). На третьей стадии связавшиеся антитела взаимодействуют с конъюгатом моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена. Комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству IgG, связанных в комплекс с антигенами токсоплазм. Индекс авидности рассчитывается как отношение оптической плотности, полученной в лунках в присутствии диссоциирующего агента, к оптической плотности, полученной при анализе без диссоциирующего агента и выражается в %. Если индекс авидности ниже 30%, то сыворотка содержит низкоавидные антитела, если выше 40% – высокоавидные антитела.
Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Исследования осуществлялись с использованием люминесцентного микроскопа ЕС ЛЮМАМ РПО11 и светофильтра БС8-3. Тест для выявления IgG антител к антигенам Toxoplasma gondii основан на реакции непрямой иммунофлюоресценции, проводимой на предметных 18-луночных стеклах с сорбированными на них целыми клетками токсоплазм. Исследуемую сыворотку крови добавляют в лунку с антигеном. Если в сыворотке крови есть антитела, они соединяются с антигеном. Сыворотку удаляют отмыванием и в лунку добавляют иммуноглобулины к IgG человека, меченные флюорохромом, которые присоединяются к имеющемуся комплексу «антиген-антитело». Стекла отмывают, подсушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Обработанный антителами ФИТЦ комплекс антигена с антителами исследуемой сыворотки приобретает способность светиться. Интенсивность свечения прямо пропорциональна содержанию антител к токсоплазмам в исследуемой сыворотке. Исследовались различные кратные 20 разведения сыворотки беременных женщин. Диагноз токсоплазмоза устанавливался при положительной реакции, начиная с разведения 1:320 (диагностический титр).
В процессе проведения исследований проводилось определение коэффициента отклонения от контроля (КО) по формуле 1: Показатель больного - Показатель здорового КО = х 100% Показатель здорового (1) Для статистической обработки данных применялись методы дескриптивной статистики, сравнение величин выполнялось приемами непараметрической статистики с использованием критериев Манна - Уитни для количественных показателей и критерия %2 для частотных показателей в соответствии с распределением данных.
Определение влияния отдельных факторов на расхождение данных в группах больных для разработанных критериальных значений проводилось на основе метода однофакторного дисперсионного анализа ONE-WAY-ANOVA с определением критерия Фишера (F) и степени его достоверности (р 0,05). Для выявления соответствия серологических данных у детей и матерей осуществлялся корреляционный анализ с оценкой коэффициента корреляции Спирмена.
Проверка положения о соответствии полученных данных разработанным критериям иммунодиагностики осуществлялась на основе расчета 95%-ного доверительного интервала количественных показателей. Для анализа диагностического значения данных определялась их диагностическая точность путем последующего построения ROC-кривых (линейная регрессия чувствительности и специфичности теста) и расчетом площади под кривой -AUROC.
Статистическая обработка данных проводилась на основе пакета статистических программ SPSS, версия 21 (допустимая ошибка Е=5%) в соответствии с инструкцией по проведению статистических исследований в системе SPSS и существующими рекомендациями [238].
Серологическая диагностика токсоплазмоза у беременных женщин
Как показывают результаты статистической обработки на рисунке 9, уровень IgM наиболее информативен для выявления принадлежности к группе 3 и к контрольной группе. Так, значения показателя выше 1,5 МЕ/мл регистрируются только у беременных женщин в группе с предположительно острым токсоплазмозом (№ 3) и в полной мере подтверждают этот диагноз. Диагностическая точность такого определения очень высока, как показывают результаты построения ROC-кривой, поскольку AUROC при сопоставлении группы 3 со всеми остальными группами составляет 0,949. Значения уровня IgM 0,3 МЕ/мл характерны для контрольной группы, которая при величине AUROC=0,761 с высокой диагностической точностью отличает контроль (беременные женщины с отсутствием токсоплазмоза) от любых других серологически позитивных групп. Однако уровень IgM, по нашим данным, не позволяет дифференцировать между собой группы 1 и 2 (AUROC=0,581) и не дает возможности определить первичный инаппарантный токсоплазмоз, что очень важно с точки зрения назначения противопротозойной терапии.
Аналогичным образом с помощью 95%-х доверительных интервалов и ROC-кривых был проанализирован уровень IgG, как это представлено на рисунке 10, а полученный результат во многом перекликался с данными, полученными при анализе уровня IgM. 95%-е доверительные интервалы уровня IgG в группах сравнения и соответствующие им ROC-кривые диагностического значения тестов
Рисунок демонстрирует, что значения уровня IgG 200 МЕ/мл с очень высокой диагностической точностью (AUROC=0,895) свидетельствуют в пользу острого токсоплазмоза, а в интервале от 50 до 200 МЕ/мл могут характеризовать беременных женщин с инаппарантным или латентным токсоплазмозом (AUROC=0,752). В то же время дифференцировать между собой группы 1 и 2 с использованием уровня IgG не представляется возможным, о чем свидетельствует невысокая AUROC (0,550).
Таким образом, определение уровней IgM и IgG является достаточно информативным тестом при диагностике токсоплазмоза в целом и его острых форм, но недостаточно эффективно в дифференциальной диагностике первичного инаппарантного и латентного токсоплазмоза. Судя по данным литературы, с точки зрения диагностирования инаппарантного токсоплазмоза определенную информацию несет определение индекса авидности IgG-антител, которые при величине индекса 40% считаются высокоавидными и характерными для давнего заражения токсоплазмами. Значения индекса авидности ниже 30% являются признаком низкой авидности, а от 30% до 40% - средней авидности.
Поскольку речь идет о беременных женщинах, которые обследовались не только в первом триместре и у которых угрозу инфицирования плода представляет, по данным литературы, первичный инаппарантный токсоплазмоз, признак низкой авидности IgG-антител учитывался нами только при обследовании в первый триместр беременности, а во втором и третьем триместре учитывалась не только низкая, но и средняя авидность как признак первичного заражения. Это связано с тем обстоятельством, что высокоавидные IgG-антитела начинают появляться, начиная с 16-й недели от момента инфицирования [118; 1444 171]. В связи с этим нарастание авидности при первичном обследовании во втором или третьем триместре может быть зафиксировано и в тех случаях, когда заражение токсоплазмами произошло уже в ходе развития самой беременности. По этой причине авидность IgG-антител исследовалась нами раздельно по триместрам беременности, о чем свидетельствует обобщение этих данных в таблице 7.
Как следует из таблицы, только группа 3, в которую вошли женщины с предположительно острым токсоплазмозом, характеризуется только низкоавидными антителами, а сыворотки женщин остальных двух групп содержат как низкоавидные, так и высокоавидные антитела при отсутствии достоверности различий между этими группами. Это заставило нас по-новому перегруппировать данные.
В новую группу 1 вошли 44 беременные женщины с низкоавидными IgG-антителами и положительной РНИФ (реакция в диагностическом титре и выше), а также 16 человек во втором-третьем триместре беременности, у которых РНИФ прошла в диагностическом титре и выше, но это сочеталось со средне- и высокоавидными антителами – всего 60 человек с предположительно инаппарантным течением токсоплазмоза. Таблица 7 – Авидность IgG-антител у беременных женщин различных групп в соответствии с триместром беременности
В новую группу 2 – с отрицательными РНИФ и высокоавидными антителами – вошли 396 человек с предположительным латентным токсоплазмозом, группа 3 (15 человек с острым токсоплазмозом) осталась без изменений. Вновь сформированные группы нуждались в более детальной серологической характеристике с целью подтверждения, в первую очередь, инаппарантного токсоплазмоза. 3.4. Серологическая характеристика инаппарантного токсоплазмоза
Результаты исследований для предположительно инаппарантного токсоплазмоза (группа 1) и для возможного латентного токсоплазмоза (группа 2) в РНИФ представлены в таблице 8, а на рисунке 11 показана диагностическая значимость теста, установленная путем построения ROC-кривой. Таблица 8 – Частота встречаемости положительной РНИФ у беременных женщин в сравниваемых группах в парных сыворотках Критерий оценки Частота встречаемости (чел. / %) Группа предположительно инаппа-рантного токсоплазмоза (n=60) Группа латентного токсоплаз-моза (группа 2) n = 396 ANOVA Низкая авид-ность IgG-антител (группа 1а) n = 44 Высокая/средняя авидность IgG-антител (группа 1б) n = 16 F p РНИФ ДТ - - 396 чел. / 100% 495,0 0,001 РНИФ=ДТ 15 чел. / 34,1% 7 чел. / 43,8% - РНИФ ДТ 29 чел. / 63,3% 9 чел. / 56,2% - Примечание: n – число женщин в группе; F – критерий Фишера; р – вероятность расхождения данных в сравниваемых группах; серым цветом обозначена достоверность расхождения данных при р 0, Кривые ROC 0,8- / O 0,6- 0,1- 0,2- / AUROC=0,981 0, і і і і] 0,2 0,4 0,6 0,8 11 - Специфичность 0
Серологическая оценка эффективности лечения инаппарантного токсоплазмоза у беременных женщин
На рисунке 22 представлена динамика изменения уровней антител к токсоплазмам, определяемая у беременных женщин с помощью РНИФ. Как следует из графиков, при латентном токсоплазмозе, не подвергавшемся противопротозойной терапии, результаты РНИФ в нашем исследовании были всегда отрицательными, поскольку никогда не превышали диагностического титра. При инаппарантном токсоплазмозе, развившемся уже в ходе беременности, исходный уровень антител к токсоплазмам был достаточно высок, находился на уровне диагностического титра (34%) или превышал его в 4 и более раз (66%). Однако уже после второго курса лечения независимо от того, в каком триместре проводился этот курс, уровень антител к токсоплазмам падал ниже диагностического титра, то есть РНИФ была отрицательной, а к моменту наступления родов сравнивался с таковым при латентном токсоплазмозе.
Совершенно иная ситуация наблюдалась при остром токсоплазмозе. Исходный уровень антител к токсоплазмам в этом случае у 80–90% беременных женщин в 4 и более раз превышали диагностический титр, а в остальных случаях находился примерно на уровне диагностического титра. При лечении во втором триместре беременности уровень антител в РНИФ ни в одном из наблюдений не был ниже диагностического титра, но становился таковым перед родами. Если же лечение проводилось в третьем триместре беременности, то после окончания терапии РНИФ во всех случаях оставалась положительной, причем положительный результат сохранялся вплоть до родов.
Эти наблюдения позволяют сделать несколько заключений. С точки зрения диагностической значимости РНИФ для оценки эффективности лечения, то эту реакцию целесообразно применять с этой целью только при инаппарантном токсоплазмозе. При остром токсоплазмозе РНИФ указывает на эффективность лечения, проведенного только во втором триместре беременности. В случаях лечения токсоплазмоза в третьем периоде беременности РНИФ либо недостаточно чувствительна, поскольку снижение уровня антител, устанавливаемое в этой реакции, не успевает достичь желаемого уровня, либо излечение не было полным. Оценка данных по уровню IgM антител при токсоплазмозе у беременных женщин (рисунок 23) проводилась в соответствии с критериями, установленными в главе 3: для латентного токсоплазмоза был характерен интервал значений 0,3– 0,5 МЕ/мл, для инаппарантного токсоплазмоза – 1,7–2,2 МЕ/мл, для острого токсоплазмоза – выше 2,4 МЕ/мл.
В соответствии с этими величинами было установлено, что при латентном токсоплазмозе значения уровней IgM все время находились в пределах критериальных значений. При инаппарантном токсоплазмозе исходные значения уровней IgM соответствовали критериальному интервалу, но уже после первого курса лечения (независимо от срока его проведения) падали и переходили в диапазон значений, характерных для латентного токсоплазмоза, оставаясь на этом уровне вплоть до родов. Что же касается уровней IgM при остром токсоплазмозе, то они начинали значительно снижаться только после второго курса лечения независимо от сроков его проведения.
Учитывая тот факт, что уровень IgM не отражает динамику гуморального иммунитета на возбудителя токсоплазмоза в целом, а лишь состояние первичного иммунного ответа, использование теста по определению уровня IgM как критерия эффективности лечения токсоплазмоза имеет лишь вспомогательное значение, поскольку позволяет зафиксировать тенденцию ответа на лечение, но не сам ответ.
Динамика уровня IgG антител у женщин с разными формами токсоплазмоза в соответствии с триместром беременности, в котором проводилось лечение (К1 – верхний критерий для латентного токсоплазмоза, К2 – нижний критерий для инаппарантного токсоплазмоза, К3 – нижний критерий для острого токсоплазмоза)
Как и в случае IgM, оценка данных по уровню IgG антител при токсоплазмозе у беременных женщин проводилась в соответствии с критериями, установленными в главе 3: для латентного токсоплазмоза был характерен интервал значений 90–105 МЕ/мл, для инаппарантного токсоплазмоза – выше 300 МЕ/мл, для острого токсоплазмоза – выше 250 МЕ/мл. При этом исходные данные, полученные в процессе исследования независимо от триместра беременности находились в диапазоне критериальных значений, а после первого курса лечения опускались ниже критериальных значений, что позволяет оценивать этот тест в оценке эффективности лечения как вспомогательный – отражающий тенденцию в ответ на терапию.