Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Различные темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции 11
1.2. Факторы, влияющие на длительность выживания ВИЧ-инфицированных 12
1.3. Роль полиморфизма генов врожденного иммунитета (TLR4 и OAS) в течении инфекционных заболеваний 20
ГЛАВА 2. Материалы и методы 28
2.1. Характеристика пациентов 28
2.2. Методы исследования и обработки результатов исследования
2.2.1 Лабораторные методы исследования 38
2.2.2 Общие принципы статистической обработки данных 41
ГЛАВА 3. Полиморфизмы генов врожденного иммунитета как генетические прогностические маркеры течения вич инфекции (результаты собственных исследований) 44
3.1. Генотипы и аллели гена TLR4 896A/G и TLR4 1196C/T у больных ВИЧ-инфекцией города Казани с разными темпами прогрессирования заболевания 44
3.2. Ассоциация полиморфизмов 896A/G и 1196C/T гена TLR4 с прогрессированием ВИЧ-инфекции 46
3.3. Генотипы и аллели генов OAS2 (олигоаденилатсинтетазы) и OAS3 у больных ВИЧ-инфекцией города Казани с разными темпами прогрессирования заболевания 49
3.4. Ассоциация полиморфизмов генов OAS2 rs2072137 и OAS3 rs1859330 с прогрессированием ВИЧ-инфекции 51
3.5. Оценка суммарного влияния аллелей риска полиморфизмов генов TLR4 и OAS2 54 3.6. Клинический анализ течения ВИЧ-инфекции у пациентов с разными вариантами генов TLR4 и фермента OAS 56
ГЛАВА 4. Системный воспалительный ответ пациентов с разными вариантами генов врожденного иммунитета (результаты собственных исследований) 68
4.1. Системный воспалительный ответ ВИЧ-инфицированных пациентов с разными гаплотипами гена TLR4 68
4.2. Системный воспалительный ответ ВИЧ-инфицированных пациентов с разными вариантами гена OAS2 rs2072137 75
4.3. Системный воспалительный ответ ВИЧ-инфицированных пациентов с разным числом аллелей риска (TLR4 896A/G, TLR4 1196C/T и OAS2 rs2072137) 80
Заключение 85
Выводы 93
Практические рекомендации 95
Перспективы дальнейшей разработки темы 96
Список сокращений 97
Список литературы 99
- Факторы, влияющие на длительность выживания ВИЧ-инфицированных
- Методы исследования и обработки результатов исследования
- Ассоциация полиморфизмов 896A/G и 1196C/T гена TLR4 с прогрессированием ВИЧ-инфекции
- Системный воспалительный ответ ВИЧ-инфицированных пациентов с разными вариантами гена OAS2 rs2072137
Введение к работе
Актуальность темы исследования. С первых лет наблюдения за ВИЧ-инфицированными пациентами многие врачи обратили внимание на различия в характере течения заболевания и темпах развертывания характерной клинической симптоматики, что, как оказалось, значимо влияло на его прогноз. Это и стало поводом к проведению целой серии исследований, направленных на изучение наблюдаемого природного явления. Оказалось, что вариабельность темпов прогрессирования ВИЧ-инфекции зависит от нескольких факторов. К их числу, помимо микробиологических характеристик возбудителя, были отнесены гено- и фенотипические особенности человека [Langford S. et al., 2007; Бартлетт Дж., 2012].
Еще «на заре» изучения патогенеза ВИЧ-инфекции к числу факторов, в той или иной мере способствующих формированию иммунодефицита, был отнесен феномен стойкой повышенной активности врожденного звена иммунной системы (в части развития его типовой реакции – воспаления) [Asher M. et al., 1988; Grossman Z., 1993]. Явление это хорошо известно и многократно подтверждалось клиническими наблюдениями. В тоже время, выраженность его биохимических показателей и их динамика в ходе болезни практически не оценивались с позиций прогностических. Вполне вероятно, что гено- и фенотипические особенности самого человека, впрямую связанные с реализацией воспалительного процесса, ассоциированы с различными вариантами течения заболевания, а в конечном итоге – и с его прогнозом.
Толл-подобные или толл-лайк рецепторы (TLR) являются одним из видов сигнальных рецепторов, распознающих т.н. «патогенные образы» (PAMPs – pathogen-associated molecular patterns), играют ключевую роль в реакциях врожденного иммунитета [Akira S. et al., 2006]. Мутации в генах, кодирующих эти рецепторы, ассоциированы с повышенной или сниженной восприимчивостью к инфекциям [O'Neill L. et al., 2009]. Поэтому вполне очевидно предположение о влиянии полиморфизмов гена TLR4, изменяющих активность этого рецептора, на течение ВИЧ-инфекции.
Механизмы врожденной защиты, в отличие от адаптивного иммунитета, не имеют дифференцированной системы клеток, а представляют собой рецепторы, молекулы и их комплексы, которые присутствуют в самых разных клеточных элементах и имеют (что
принципиально важно), одинаковое функциональное предназначение. К их числу могут быть отнесены плазмоцитоидные дендритные клетки (pDC) и интерфероны (ИФН) [Железникова Г.Ф., 2009]. Один из противовирусных механизмов ИФН основан на индукции синтеза фермента 2',5'-олигоаденилатсинтетазы (2',5'-OAS) [Salehzada T. et al., 1993; Sarkar S. et al., 1998]. Известно, что сам вирус обладает способностью как активировать, так и блокировать фермент OAS [SenGupta D. et al., 1989; Schrder H. et al., 1990; Maitra R. et al., 1994]. Поэтому изменения активности OAS в инфицированных вирусом клетках можно с полным основанием расценивать как одну из реакций врожденного иммунитета. Потенциально изменения в генах, кодирующих ферменты этой группы, могут повлиять на реакцию всех звеньев врожденного иммунитета и, в итоге, на течение самой инфекции. Эта гипотеза и стала поводом к проведению настоящего исследования. Чрезвычайно высокая распространенность ВИЧ-инфекции и ускорение темпов эпидемии в нашей стране [Cоколова Е.В. и др., 2013] также определяют актуальность исследований в этой области.
Степень разработанности темы. Известно, что полиморфизмы 896A/G и 1196C/T гена TLR4 затрагивают экстраклеточный домен рецептора и ассоциированы со сниженным ответом эффекторных клеток на липополисахарид [Arbour N. et al., 2000; Schwartz D., 2001; Schwartz D., 2002]. Клинических исследований по оценке влияния такого рода мутаций TLR4 на ВИЧ-инфекцию крайне мало, и, более того, выводы авторов работ по данному вопросу достаточно противоречивы. К примеру, S. Kleeberger показал, что пациенты с полиморфизмами 896A/G и 1196C/T гена TLR4 значительно медленнее достигают стадии СПИДа [Kleeberger S., 2002]. В то же время, другие исследователи подобной ассоциации разных аллелей TLR4 с темпом прогрессирования ВИЧ-инфекции не обнаружили [Bochud P. et al., 2007; Soriano-Sarabia N. et al., 2008]. Что же касается оценки возможного влияния генов вышеупомянутого фермента OAS на темпы формирования иммунодефицита при ВИЧ-инфекции, то в современной литературе ответов на такого рода вопросы мы не нашли вовсе.
Цель исследования: Прогноз ВИЧ-инфекции на основе учета гено- и фенотипических особенностей реакций врожденного иммунитета.
Для достижения цели необходимо решение следующих задач:
-
Оценить возможную ассоциацию аллелей генов TLR4 896A/G и 1196C/T и фермента OAS с прогрессированием ВИЧ-инфекции.
-
Определить наличие связи характера прогрессирования ВИЧ-инфекции с суммарным числом полиморфизмов (мутаций) генов TLR4 и фермента OAS.
-
Выявить факторы, ассоциированные с темпом формирования иммунодефицита при ВИЧ-инфекции.
-
Оценить уровни ТNF-, IL6, INF-, INF- и sCD14 и возможную связь их с маркерами прогрессирования ВИЧ-инфекции у пациентов с разными вариантами генов TLR4 и фермента OAS.
Научная новизна. На основании молекулярно-генетического анализа получены новые данные о распределении аллелей и генотипов по генам TLR4, OAS2 и OAS3 у больных ВИЧ-инфекцией региона г. Казани. Показано, что частота аллеля G полиморфизма 896A/G гена TLR4 составляет 8,6%, Т аллеля полиморфизма 1196C/T гена TLR4 – 8,3%, аллеля С полиморфизма гена OAS2 rs2072137 – 21,8% и частота A аллеля полиморфизма гена OAS3 rs1859330 – 10,6%.
Проведен анализ распределения аллелей и генотипов по двум полиморфизмам гена TLR4 среди здоровых жителей региона г. Казани, показавший подобный европеоидной популяции характер распределения частот аллельных вариантов. Частота G аллеля TLR4 896A/G составляет 6,5%, а Т аллеля TLR4 1196C/T – 7%.
Выявлено, что мутантные генотипы G/A и G/G 896A/G гена TLR4, также, как и гаплотипы TLR4 896/1196 и 896/wt, ассоциированы с «медленным» развитием ВИЧ-инфекции. В тоже время, наличие генотипов Т/С и С/С OAS2 rs2072137 позволяет прогнозировать «типичный» вариант течения заболевания. Впервые оценен вклад трех мутаций TLR4 896A/G, TLR4 1196C/T, OAS2 rs2072137 в прогноз ВИЧ-инфекции: носительство 5-6 аллелей риска в 5,2 раза повышает шанс «типичного» прогрессирования ВИЧ-инфекции.
Показан высокий уровень sCD14 в группе с гаплотипом wt/wt
гена TLR4. Установлено, что для пациентов с генотипами Т/С и С/С
OAS2 rs2072137 характерен высокий уровень системной
воспалительной реакции (по показателям IL6, ТNF-, sCD14 и INF-).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты проведенного исследования расширили знания о
вариантах генов TLR4 896A/G, TLR4 1196 C/T, OAS2 rs2072137 и
OAS3 rs1859330 у больных ВИЧ-инфекцией и особенностях
распределения этих генотипов в зависимости от темпа
прогрессирования заболевания. Результаты исследования
демонстрируют новые данные о распределении аллелей генов TLR4 896A/G и TLR4 1196 C/T среди жителей региона г. Казани.
Полигенный анализ результатов молекулярно-генетического исследования генов TLR4 896A/G, TLR4 1196C/T и OAS2 rs2072137 подтвердил гипотезу о том, что аллели риска «типичного» прогрессирования статистически значимо связаны с темпом формирования иммунодефицита при ВИЧ-инфекции. Обнаружены различия в уровне системного воспалительного фона у людей с разными вариантами изучаемых генов при наличии и в отсутствие признаков прогрессирования основного заболевания. Выявленные данные позволяют прогнозировать темп развития иммунодефицита и персонализировать подход к организации наблюдения за пациентами и проведения антиретровирусной терапии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Определено, что «медленное» прогрессирование ВИЧ-
инфекции ассоциировано, как с генотипами G/A и G/G полиморфизма
896A/G TLR4, так и с гаплотипами 896/1196 и 896/wt TLR4;
«типичное» развитие заболевания ассоциировано с генотипами Т/С и
С/С гена OAS2 rs2072137. Обнаруженные ассоциации дают
возможность прогнозировать исход заболевания.
2. Доказано, что темп прогрессирования ВИЧ-инфекции значимо
связан с суммарным числом аллелей риска «типичного прогресса»
TLR4 896A/G, TLR4 1196C/T и OAS2 rs2072137, первичным уровнем
CD4-лимфоцитов, возрастом пациента при его постановке на учет.
Носительство большого числа (5-6) аллелей риска повышает шанс
«типичного» прогрессирования ВИЧ-инфекции. У пациентов
старшего возраста с исходно низким уровнем CD4-лимфоцитов
(350-500 клеток/мкл) значимо возрастает вероятность «типичного»
развития инфекции.
3. Установлено, что уровень маркеров воспалительных реакций
и sCD14 различаются у пациентов с разными вариантами генов TLR4
896A/G, TLR4 1196C/T и OAS2 rs2072137, как при наличии, так и в
отсутствие признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции, что
доказывает связь полиморфизма генов врожденного иммунитета с уровнем хронической иммунной активации.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
В соответствии с формулой специальности 14.01.09 –
Инфекционные болезни, охватывающей проблемы изучения
этиологии, патогенеза, патофизиологии, диагностики, клиники,
прогнозирования исходов и лечения инфекционных болезней у
человека, представленное диссертационное исследование посвящено
изучению влияния полиморфизмов генов системы врожденного
иммунитета на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции, в том числе
через изменение уровня хронической иммунной активации.
Выявлены факторы, ассоциированные с темпом формирования
иммунодефицита при ВИЧ-инфекции, что соответствует п.1
«Изучение свойств возбудителей и их взаимодействие с организмом
человека, иммунологические, патоморфологические, биохимические,
патофизиологические изменения в организме в процессе болезни,
лечения и развития постинфекционного иммунитета», п.2
«Клинические проявления инфекционного процесса, повреждения и нарушения функции различных органов и систем, особенности течения заболевания во всех возрастных группах, в различных условиях окружающей среды и в сочетании с другими болезнями. Прогнозирование течения инфекционного заболевания и его исходов» паспорта специальности 14.01.09 – Инфекционные болезни.
Апробация диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании
научно-проблемной комиссии «Инфекционные болезни» ГБОУ ВПО
«Казанский ГМУ» Минздрава России (протокол № 3) 23 декабря 2015
года. Проведение диссертационного исследования одобрено
локальным этическим Комитетом ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» Минздрава России, протокол № 9 от 25 ноября 2014 года.
Основные положения диссертации докладывались и
обсуждались на: 87-й Всероссийской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых (21-22 марта 2013 г., г. Казань); V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (25-27 марта 2013 г., г. Москва); 88-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 200-летию Казанского государственного медицинского университета (22 марта 2014 г., г. Казань); Российской научно-
практической конференции «Инфекции и соматическая патология», приуроченной к 80-летию кафедры детских инфекций Казанского государственного медицинского университета (24-25 мая 2013 г., г. Казань).
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования внедрены в работу ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Республики Татарстан» (ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ»); а также в учебный процесс на кафедре детских инфекций ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» Минздрава России (КГМУ).
Публикации и участие в научных конференциях
Основные материалы диссертации опубликованы в 7 научных
работах, в том числе – 4 в научных рецензируемых изданиях,
рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для
публикации результатов диссертационных исследований.
Личное участие диссертанта в получении научных результатов
Личный вклад автора состоял в разработке плана исследования;
наборе исследуемой группы; анализе компьютерной базы и
амбулаторных карт пациентов; создании и наполнении баз данных;
сборе анамнеза, проведении врачебного осмотра, наборе материала
(соскоба эпителия ротовой полости и сыворотки крови). Диссертант
самостоятельно выделяла ДНК, определяла полиморфизмы гена TLR4
896 A/G и 1196C/T методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) с
последующим рестрикционным анализом. Статистическая обработка
результатов проводились лично диссертантом на всех этапах
диссертационного исследования. Автором подготовлены к печати
публикации по результатам полученных исследований.
Формулировка выводов, положений, выносимых на защиту, принадлежит лично диссертанту.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 123
страницах компьютерного набора, состоит из введения, 4 глав (обзора
литературы, описания пациентов и методов исследования, 2 глав по
результатам собственных исследований), заключения, выводов,
практических рекомендаций, описания перспектив дальнейшей
разработки темы, списка сокращений, списка литературы и списка
иллюстрированного материала. Работа иллюстрирована 45
таблицами, 20 рисунками, 2 клиническими примерами. Список литературы включает 180 источников, из которых 19 на русском языке, 153 – на английском, 8 – электронных.
Факторы, влияющие на длительность выживания ВИЧ-инфицированных
ВИЧ-инфекция – хроническое заболевание, неуклонно прогрессирующее в отсутствие антиретровирусной терапии (АРВТ). АРВТ позволяет инфицированным людям контролировать течение заболевания и значительно увеличивает продолжительность их жизни [3, 5, 6, 9]. Однако, у отдельных лиц инфекция прогрессирует медленно или не прогрессирует вовсе. Такие пациенты поддерживают «нормальный» уровень CD4-лимфоцитов и в отсутствие терапии.
В зависимости от темпа развития иммунодефицита всю популяцию больных принято делить на несколько групп. Первую составляют т.н. «типичные прогрессоры», у которых развитие необратимого синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) наступает в течение первых 8-10 лет после инфицирования. Вторую группу составляют люди со сравнительно быстро прогрессирующей формой заболевания («быстрые прогрессоры»). СПИД у них формируется в течение ближайших 2-5 лет. Третья группа – пациенты с непрогрессирующей в течение длительного времени формой заболевания («длительные непрогрессоры» или LTNP – longerm nonprogressors). Такие пациенты находятся в бессимптомной стадии заболевания и сохраняют уровни CD4-лимфоцитов в пределах физиологической нормы в течение 10 и более лет [151]. С появлением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для количественного определения вируса стало очевидно, что небольшая часть больных способна контролировать «вирусную нагрузку» в течение многих лет и в отсутствие АРВТ. Эту категорию больных делят на 2 подгруппы: т.н. «элитные контроллеры» (поддерживающие «вирусную нагрузку» на уровне 50 копий/мл) и «виремические контроллеры» (с уровнем РНК ВИЧ 50-2000 копий/мл) [34, 132]. Чаще всего способность инфицированного человека контролировать «вирусную нагрузку» коррелирует со стабильно высокими показателями СD4-лимфоцитов [79], однако, и в этих случаях возможны исключения. Для «длительных непрогрессоров» характерно сохранение высоких показателей числа CD4-лимфоцитов в отсутствие АРВТ (наиболее часто упоминаемая в литературе величина – 500 клеток/мкл и более) [117]. Однако среди исследователей нет единого мнения в вопросах критериев отбора. Так, для отнесения пациентов в группу элитных контроллеров предлагаются следующие критерии: неопределяемая, «нулевая» вирусная нагрузка, выявленная более трех раз в течение 12 месяцев [43]; неопределяемая вирусная нагрузка в течение 2 лет и более [115]; неопределяемая вирусная нагрузка в течение 10 лет и более [77].
Более того, сам уровень т.н. «неопределяемой» вирусной нагрузки зависит от порога чувствительности метода ПЦР. В более ранних исследованиях – это 400 копий/мл, в других - 50 копий/мл. При этом, к примеру, в работах Okulicz и коллег было описано, что в группе больных с очень низким уровнем виремии (менее 2000 копий/мл) даже небольшая разница в вирусной нагрузке отражается на темпах прогрессирования ВИЧ-инфекции [43].
Аналогичная ситуация и с «длительными непрогрессорами». В качестве критериев включения в группу предлагаются: уровень CD4-лимфоцитов выше 600 клеток/мкл в течение 7 лет и более [151]; уровень CD4-лимфоцитов выше 500 клеток/мкл в течение 8 лет и более [55]; уровень CD4-лимфоцитов выше 500 клеток/мкл в течение 10 лет и более [43] и т.д.
Ясно, что неоднородность критериев отбора неизбежно сказывается на результатах исследований и, часто, не позволяет сравнивать или объединять итоги разных исследований.
Факторы, влияющие на прогноз клинического течения ВИЧ-инфекции (по сути, темпа ее последовательного развития) можно условно разделить на три группы: 1) генетические, 2) вирусные и 3) иммунологические факторы.
Генетические факторы Доказано, что CCR5-A32- полиморфизм, отдельные HLA-фенотипы ассоциируются с группой «нонпрогрессоров» [52, 56, 87].
Генотип CCR5-A32 описывает делецию 32 пары оснований, приводящую к нарушению адгезивных свойств кодируемого ею белка CCR5 Т-клеток. У гетерозигот эта мутация сильно уменьшает шанс инфицирования, а у гомозигот приводит к полной невозможности заражения ВИЧ [37, 131]. Подтверждена корреляция гетерозиготности по CCR5-A32 с низким темпом прогрессирования ВИЧ [56].
Помимо этого, выявлена связь прогрессирования заболевания с полиморфизмом гена CCR2b. CCR2b - альтернативный хемокиновый корецептор для ВИЧ, используемый им существенно реже, чем CCR5 и CXCR4. Мутация в данном гене ведет к изменению структуры белка в трансмембранном домене, что прямо коррелирует с замедлением прогрессирования СПИДа [47].
Многочисленные исследования сообщают об ассоциации HLA-фенотипа с прогрессированием ВИЧ-инфекции. Так HLA-B57 1 класса и HLA-B27 связаны с выживанием в течение достаточно длительного времени. Эта связь обнаружена в США и в Северной Европе, где преимущественно распространен субтип В [52, 87]. С другой стороны, быстрое прогрессирование до стадии СПИД ассоциировано с HLA А24, В35, В37, В56, В58S и А1-В8-DR3 [36].
Гены Толл-лайк рецепторов (TLR) кодируют белки, участвующие в реакциях врожденного иммунитета. Активация Толл-лайк рецепторов на поверхности иммунных клеток приводит к продукции провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, могут способствовать репликации вируса. Bochud с коллегами проанализировали 28 однонуклеотидных полиморфизмов TLR 2-4 и TLR 7-9 у 428 ВИЧ-инфицированных, не получающих антиретровирусную терапию, и установили связь с быстрым прогрессированием ВИЧ-инфекции для двух мутаций TLR9 (1635A/G и +1174G/A) [129].
Методы исследования и обработки результатов исследования
Все больные находились на субклинической стадии ВИЧ-инфекции. 93% больных были моложе 40 лет. Большинство больных (80%) на момент первичной диспансеризации имели уровень CD4 клеток от 350 до 850 на мл, а вирусная нагрузка у 61% больных была средней (5000-100000 копий/мл). Среди хронических заболеваний ведущее место по распространенности в исследуемой группе занимают вирусные гепатиты. Серологические маркеры гепатита С выявлены у 86 пациентов (65%), гепатита В - у двоих (2%). Следует отметить, что 10 пациентам (8%) был установлен диагноз микст-гепатита В+С. Кроме того, были выявлены и другие сопутствующие заболевания. Так, у 5 человек отмечались заболевания желудочно-кишечного тракта: у 2 - хронический гастрит, у 3 – геморрой. У 12 пациентов – урогенитальные заболевания (у 2 – хронический пиелонефрит, у 1 - мочекаменная болезнь, у 1 – эндоцервицит, у 8 – различные урогенитальные инфекции). Хронические заболевания ЛОР-органов были выявлены у 1 человека – хронический гайморит и тонзиллит. Болезни органов дыхания в виде бронхиальной астмы и пневмонии были зарегистрированы у 3 человек.
На основании архивных иммунологических данных (из базы данных AIDSNET и амбулаторных карт ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ») больные были разделены на 2 группы в зависимости от характера и темпа «потери» CD4-лимфоцитов. Значимые аналитические вариации обуславливают широкий диапазон нормальных значений CD4-лимфоцитов (обычно 500-1400 клеток в 1 мкл) [2]. Для «типичного» прогрессирования заболевания характерно снижение количества CD4-лимфоцитов на 50-100 клеток в год [2]. Таким образом, в среднем за 5 лет (при «типичном» развитии болезни) человек теряет 250 клеток. Согласно этим данным нами выбраны критерии для деления больных основной группы (133 человека) на две подгруппы с разными темпами прогрессирования ВИЧ-инфекции, которые условно были названы нами «медленные прогрессоры» и «типичные прогрессоры».
Критерии включения в подгруппу «медленные прогрессоры»: - скорость потери CD4-лимфоцитов не более 50 клеток в год (не более 250 клеток за первые пять лет наблюдения), - отсутствие получения АРВТ в течение 5 лет с момента лабораторного подтверждения диагноза «ВИЧ-инфекция». Критерий включения в подгруппу «типичные прогрессоры»: - скорость потери CD4-лимфоцитов более 50 клеток в год (более 250 клеток за первые пять лет наблюдения). У части больных (n=21) мы не смогли оценить скорость потери CD4-лимфоцитов за первые пять лет наблюдения, так как этим пациентам была назначена АРВТ. Средний уровень CD4-лимфоцитов (на момент первичного клинико-лабораторного обследования) составил 584±114 клеток/мкл. Средний срок начала АРВТ 3,2±0,4 года. В период без АРВТ снижение CD4-лимфоцитов составляло в среднем 100 клеток в год, поэтому данные пациенты были отнесены в подгруппу «типичных прогрессоров». Характеристика подгрупп пациентов с разными темпами прогрессирования ВИЧ-инфекции для исследования полиморфизмов генов TLR4 и фермента OAS
У всех пациентов основной группы (N=133) определяли полиморфизмы 896A/G и 1196C/T гена TLR4. Краткая характеристика исследуемых подгрупп на момент первичного клинико-лабораторного обследования представлена в таблице 4.
Когорту для определения полиморфизмов генов фермента OAS составили 94 человека из основной группы. Краткая характеристика исследуемых подгрупп на момент первичного клинико-лабораторного обследования представлена в таблице 5. Таблица 5 – Характеристика показателей на момент первичного клинико-лабораторного обследования (для исследования генов фермента OAS) Характеристики пациентов. «медленныепрогрессоры»N=40 «типичныепрогрессоры»N=54 p Пол: мужчины женщины 24 (60%) 16 (40%) 33 (61%) 21 (39%) 0,92 0,92 Возраст, г., Me (25%-75%) 24 (21,5-28) 26,5 (22-32) 0,04 Количество CD4-лимфоцитов, клеток/мкл, Me (25%-75%) 655 (511-868) 479 (374-658) 0,0014 CD4 350-500 клеток/мкл 9 (22,5%) 32 (59%) 0,0004 CD4 более 500 клеток/мкл 31 (77,5%) 22 (41%) 0,0004 Вирусная нагрузка, log10 копий/мл, Me (25%-75%) 3,9 (3,3-4,4) 4,3 (3,8-4,59) 0,019 Вирусная нагрузка, копий/мл Менее и/или равно 50.000 копий/мл 35 (87,5%) 44 (81%) 0,4 Более 50.000 копий/мл 5 (12,5%) 10 (19%) 0,4 Путь инфицирования, %:половойпарентеральный 14 (35%) 26 (65%) 23 (43%) 31 (57%) 0,43 0,43 Стадия ВИЧ-инфекции 3 стадия 40 54 1,0 p – уровень статистической значимости различий между группами больных Имеются статистически значимые различия в подгруппах по возрасту, количеству CD4-лимфоцитов и по вирусной нагрузке. Эти характеристики потенциально могут повлиять на прогрессирование (исход). В связи с этим, данные оценивались с позиций логистического регрессионного анализа.
Контрольную группу для молекулярно-генетического анализа составили 100 здоровых добровольцев (студенты медицинского университета). Характеристика пациентов для исследования уровня цитокинов и sCD14 В исследование вошло 81 ВИЧ-инфицированный пациент из основной группы, из которых у 59 оценивался также уровень sCD14. Для исследования уровня цитокинов и sCD14 отбирались пациенты, не имеющие на данный момент жалоб, острых заболеваний и находящиеся в фазе ремиссии по ВИЧ-инфекции. Критериями исключения при данном исследовании для устранения действия вмешивающихся факторов послужили наличие беременности и противовирусной терапии гепатита С и В.
Ассоциация полиморфизмов 896A/G и 1196C/T гена TLR4 с прогрессированием ВИЧ-инфекции
Пациентка Х.Д. (ВП 4849). Дата рождения – 08.03.1979 ВИЧ-инфекция выявлена в 2002 году при обследовании перед медицинским абортом. Путь инфицирования – инъекционный (нерегулярно употребляла героин в 2000-2001 годах). Не замужем. В анамнезе: в 2004 году травма позвоночника, закрытый осложненный компрессионный перелом тела L2 позвонка, парез нижних конечностей; ХВГС. Инвалид 1 группы. К пациентке на дом регулярно выезжает отделение медико-социальной реабилитации ГАУЗ оппортунистические инфекции не регистрировались. АРВТ не получала. Результаты исследования CD4-лимфоцитов и вирусной нагрузки представлены на графике (рисунок 9). Рисунок 9 – Динамика уровня CD4-лимфоцитов и вирусной нагрузки у пациентки Х.Д. за период наблюдения 2004 по 2013 гг. Данные на 02.06.2013. Жалоб нет. Состояние удовлетворительное. Передвигается по дому в инвалидном кресле. По органам – без физикальных изменений. Температура тела - 36,6С. Физиологические отправления не нарушены. Симптомов оппортунистических инфекций нет. Диагноз: ВИЧ-инфекция. Субклиническая стадия (3). ХВГС. Травма позвоночника, перелом позвоночника на уровне поясничного отдела. Парез нижних конечностей. Лабораторные показатели (02.06.2013): - СD4-лимфоциты 567 клеток/мкл (36%) - СD8-лимфоциты 840 клеток/мкл (53%) - CD4+/CD8+ = 0,68 - РНК ВИЧ (ПЦР) менее 150 копий/мл - Общий анализ крови: Лейкоциты – 3,9 х 109/л, палочкоядерные нейтрофилы – 2%, сегментоядерные нейтрофилы – 52%, эозинофилы – 2%, моноциты – 8%, лимфоциты 36%, базофилы – 0%; эритроциты – 3,59 х 1012/л, гемоглобин – 135 г/л; СОЭ – 9 мм/ч. - Биохимический анализ крови: Аланинаминотрансфераза – 16,6 ед/л (референтные значения 5-22), аспартатаминотрансфераза – 16,9 ед/л (референтные значения 7-33), общий билирубин – 6,2 мкМ/л (референтные значения 5-20), прямой билирубин – 1,1 мкМ/л (референтные значения 0-5), креатинин – 74,6 мкМ/л (референтные значения 44-97). - sCD14 – 2,2 мкг/мл - ТNF- – 1,16 пг/мл - IL6 – 1,7 пг/мл - INF- – 3,2 пг/мл - INF- – 0 пг/мл Генетический анализ выявил генотип A/G по полиморфизму 896A/G TLR4, генотип С/С по полиморфизму 1196С/Т TLR4, генотип ТТ по полиморфизму OAS2 rs2072137. Итого, у пациентки 3 аллеля риска «типичного прогрессирования». У пациентки, по-прежнему, отсутствуют клинические признаки прогрессирования заболевания, сохраняются удовлетворительное состояние и самочувствие. «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ» для проведения диспансеризации. За время наблюдения По данным на 2 ноября 2015 года: количество CD4-лимфоцитов 580 клеток/мкл, уровень вирусной нагрузки менее 50 копий/мл.
Заключение: Данный клинический пример можно рассматривать как вариант течения инфекции у пациентки, отнесенной к «длительным непрогрессорам» или к longerm nonprogressors. В определенной мере ее можно отнести и к подгруппе «элитных контроллеров» (в течение 9 лет вирусная нагрузка остается неопределяемой в отсутствие АРВТ, за исключением трех случаев минимальных показателей). Уровень CD4-лимфоцитов остается в пределах «нормы». Пациентка имеет малое количество аллелей риска «типичного прогрессирования» инфекции и демонстрирует отсутствие лабораторных признаков воспаления (невысокие уровни sCD14, цитокинов, СОЭ).
Пациентка Т.Р. (ВП 9154). Дата рождения – 19.04.1986 История заболевания: ВИЧ-инфекция обнаружена в 2007 году при обследовании перед медицинским абортом. Путь инфицирования – половой. Заболевания было выявлено на стадии первичных проявлений (стадия 2А). С учетом высокой вирусной нагрузки пациентке была предложена АРВТ. Однако, женщина отказалась.
ВП 9154 регулярно проходит диспансерное наблюдение в ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ». Результаты исследования CD4-лимфоцитов и вирусной нагрузки представлены на графике (рисунок 10).
Динамика уровня CD4-лимфоцитов (верхний график) и вирусной нагрузки (нижний график) пациентки Т.Р. за период наблюдения с 2007 по 2015 гг. (копия из электронной базы данных AIDSNET ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ»). В анамнезе: эрозия шейки матки, гарднереллез, контагиозный моллюск (2011). Данные на 28.06.2012. Жалоб нет. Состояние удовлетворительное. По органам – без физикальных изменений. Температура тела – 36,6 С. Физиологические отправления не нарушены. Симптомов оппортунистических инфекций нет. Не замужем. Работает бухгалтером. Курит. Употребление наркотиков отрицает. Есть ребенок 10 лет, здоровый. Диагноз: ВИЧ-инфекция. Субклиническая стадия (3). Лабораторные показатели (28.06.2012): - СD4-лимфоциты 337 клеток/мкл (26%) - СD8-лимфоциты 883 клеток/мкл (62%) - CD4+/CD8+ = 0,4 - РНК ВИЧ (ПЦР) 13400 копий/мл - Общий анализ крови: Лейкоциты – 4,8 х 109/л, палочкоядерные нейтрофилы – 4%, сегментоядерные нейтрофилы – 46%, эозинофилы – 6%, моноциты – 6%, лимфоциты 38%, базофилы – 0%; эритроциты – 4,1 х 1012/л, гемоглобин – 142 г/л; СОЭ – 16 мм/ч. - Биохимический анализ крови: Аланинаминотрансфераза – 21,6 ед/л (референтные значения 5-22), аспартатаминотрансфераза – 15,9 ед/л (референтные значения 7-33), общий билирубин – 7,2 мкМ/л (референтные значения 5-20), прямой билирубин – 1,7 мкМ/л (референтные значения 0-5), креатинин – 87,6 мкМ/л (референтные значения 44-97). - Маркеры вирусных гепатитов (HBs-антиген и суммарные а/т к ВГС) не выявлены. - Комплекс серологических реакций на сифилис – результат отрицательный. - sCD14 – 4,84 мкг/мл Генетический анализ выявил генотип A/А по полиморфизму 896A/G TLR4, генотип С/С по полиморфизму 1196С/Т TLR4, генотип Т/С по полиморфизму OAS2 rs2072137. Итого, у пациентки 5 аллелей риска «типичного прогрессирования».
В связи с клинико-лабораторными признаками прогрессирования заболевания (кандидоз ротовой полости, волосистая лейкоплакия языка) в июле 2013 года была назначена АРВТ по схеме зидовудин, ламивудин, лопинавир/ритонавир. В мае 2015 года схема была изменена на зидовудин, ламивудин, этравирин из-за побочных эффектов (липодистрофия, жидкий стул). На фоне терапии отмечается вирусологическая и иммунологическая эффективность. Диагноз: ВИЧ-инфекция. Стадия вторичных заболеваний (4Б) в фазе ремиссии на фоне антиретровирусной терапии. По данным на 12 декабря 2015 года: количество CD4-лимфоцитов 556 клеток/мкл, уровень вирусной нагрузки 160 копий/мл.
Заключение: Данный клинический случай можно рассматривать как пример «типичного прогрессирования» ВИЧ-инфекции. За первые пять лет наблюдения уровень CD4-лимфоцитов уменьшился более чем на 250 клеток/мкл; появились клинические симптомы прогрессирования заболевания. Пациентка имеет большое количество аллелей риска «типичного прогрессирования» ВИЧ-инфекции и высокий уровень sCD14.
Таким образом, представленные результаты демонстрируют различия в темпах формирования иммунодефицита и клиническом развитии ВИЧ-инфекции у людей с разными вариантами генов TLR4 и фермента OAS.
Системный воспалительный ответ ВИЧ-инфицированных пациентов с разными вариантами гена OAS2 rs2072137
Отмечаются более высокие цифры sCD14 в группе wt/wt, чем у пациентов с гаплотипом 896/1196 (р=0,02). Эта разница сохраняется на разных стадиях ВИЧ-инфекции, и с учетом формирования оппортунистических заболеваний: высокие показатели sCD14 регистрируются у людей с гаплотипом wt/wt на 4 стадии ВИЧ-инфекции (р=0,046) и, в том числе, без оппортунистических заболеваний (р=0,049). С нашей точки зрения, это может быть свидетельством низкой реактивности клеток на ЛПС у пациентов с мутантными аллелями гена TLR4. Кроме того, в группе пациентов с «диким», немутантным гаплотипом даже при сохранном адаптивном иммунитете регистрируются высокие показатели IL-6 (p=0,044 по сравнению с гаплотипом 896/1196). Показательно, что в группе с мутантным гаплотипом показатели TNF- не отличались от уровня здоровых людей (р=0,13). Таким образом, медленное прогрессирование ВИЧ-инфекции у людей, несущих мутантные аллели гена TLR4 ассоциировано со сравнительно низким, как общим воспалительным фоном, так и невысокой активностью клеток миелоидного ряда в результате гипореактивности их толл-подобных рецепторов.
Сравнительное исследование по оценке возможной ассоциации генов фермента OAS с разными темпами развития ВИЧ-инфекции показало, что в группе с «типичным» прогрессированием чаще встречаются мутантный аллель С и генотипы С/С и Т/С гена OAS2 rs2072137, чем в группе с «медленным» развитием заболевания. Дальнейший анализ выявил, что генотипы Т/С+С/С повышают шанс «типичного» прогрессирования заболевания почти в 3,5 раза (p=0,0125, OR=3,44). Медиана «бессобытийной выживаемости» (фактически, это время до развития первого эпизода оппортунистической инфекции) в группе с мутантными генотипами составила 2518 дня от момента постановки на учет, что значимо меньше в сравнении с группой «дикого» генотипа Т/Т (3228 дня). По результатам ранее проведенных исследований взаимодействия ВИЧ с OAS [33, 83, 107, 142, 146] следует, что активация ферментов этой группы в инфицированных клетках является отражением типичной реакции врожденной противовирусной защиты. Ее эффективность, в частности, зависит от способности инфицированных клеток предотвращать ингибирование собственной OAS. Наши результаты впервые продемонстрировали клинические доказательства роли OAS2 в прогрессировании ВИЧ-инфекции. Они, конечно же, требуют дополнительного подтверждения в других исследованиях и детального изучения этого феномена. Это естественно. Мы даже не стали спекулировать и пытаться объяснять механизм выявленного явления только собственными результатами. Их, на наш взгляд, недостаточно, и потому решили ограничиться лишь констатацией данного факта и попытаться оценить его практическую, прикладную значимость.
Дальнейший анализ общего воспалительного фона выявил высокие уровни ТNF-, IL6, sСD14 и СОЭ у пациентов с мутантными генотипами гена OAS2 rs2072137. В этой же группе высокие показатели INF- наблюдались по мере прогрессирования стадии ВИЧ-инфекции (р=0,03). При этом стоит специально отметить различия в уровнях sCD14 и СОЭ при сравнении пациентов, находящихся в одной стадии ВИЧ-инфекции, но имеющих разные генотипы. Маркеры активации иммунной системы были выше в группе с мутантными генотипами Т/С и С/С. Эта тенденция сохраняется при прогрессировании иммуносупрессии и при развитии симптомокомплекса оппортунистических инфекций.
Таким образом, группа с мутантными генотипами Т/С и С/С гена OAS2 rs2072137, ассоциированная с «типичным» прогрессированием ВИЧ-инфекции, показала наибольший уровень активности воспаления, как при наличии, так и в отсутствие признаков прогрессирования заболевания.
Для суммарной оценки влияния аллелей риска «типичного» прогрессирования трех полиморфизмов TLR4 896A/G, TLR4 1196C/T и OAS2 rs2072137 нами проведен полигенный анализ. Обнаружено, что наличие 5-6 «аллелей риска» повышает шанс «типичного» прогрессирования инфекции в 5,2 раза. Кроме того, медиана времени «дожития» до развития первого эпизода оппортунистической инфекции в группе с меньшим числом аллелей риска составила 3141 день от момента постановки на учет, что значимо больше, чем в группе с 5-6 аллелями (2323 дня).
Определение маркеров наступления события с использованием методики бинарной логистической регрессии показало, что число «аллелей риска» (р=0,007), первичный уровень CD4+-лимфоцитов (р=0,0026) и возраст (р=0,044) значимо влияли на темп прогрессирования ВИЧ-инфекции. Эти цифры мы отмечаем специально, поскольку они подтверждают правильность сделанных нами предположений, да и сам тренд проводимых исследования. Ведь уровень CD4-лимфоцитов и возраст - самые значимые и признанные во всем мире предикторы прогрессирования заболевания [11, 38, 88, 93,121,124, 156,176]. Сравнение общего воспалительного фона показало более высокий уровень активности воспаления, как при наличии, так и в отсутствии признаков прогрессирования ВИЧ-инфекции в группе с большим числом (5-6) аллелей риска.
Ясно, что феномен разной прогрессии иммунодефицита зависит от множества факторов, в том числе от других генов и их продуктов, а также от воздействия внешней среды. Выше мы писали, что не совсем понятен механизм влияния OAS2 rs2072137 на темпы развития иммунодефицита. Данный вариант гена локализован в 12 хромосоме и является интронным. Интроны – участки ДНК, расположенные между экзонами и регулирующие образование разных матричных РНК (мРНК) (по принципу «один ген – несколько функциональных продуктов») за счет альтернативного сплайсинга [1]. Тем более, что новая парадигма генетики формулируется следующим образом: «ген – совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов» [175]. Обычно частота интронных полиморфизмов в геноме средняя, а предполагаемый эффект на фенотип очень низкий. Изменения в регуляторных областях генов сопровождаются количественными изменениями соответствующего продукта и не затрагивают структуры и функциональную активность белка. Проявление таких мутаций определяется пороговым уровнем концентрации белка, при котором его функция еще сохраняется [1]. Отсюда следует что, полиморфизм OAS2 rs2072137 может влиять не только на экспрессию гена или на стабильность мРНК фермента олигоаденилатсинтетазы, но меняет и активность других полипептидов, значимых в отношении динамики ВИЧ-инфекции, что, по нашему мнению, наиболее вероятно. Тем не менее, это всего лишь наше предположение. Возможные эффекты интронного варианта OAS2 rs2072137 на ген конечно же требуют своего дальнейшего изучения.
Завершая обсуждение, мы можем констатировать, что наше исследование, подтвердило правильность выдвинутой гипотезы и продемонстрировало влияние особенностей генов врожденного иммунитета на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции, в том числе, через изменение уровня хронической иммунной активации.