Металлосвязывающие белки в системе факторов неспецифической резистентности организма у детей Туркин, Валерий Владимирович

Введение к работе

Актуальномь_щэоблемы. Несмотря на значительный прогресс теоретической медицины, клинической педиатрии и иммунологии в последние годы имеют место не только стабилизация младенческой и детской смертности, но и наметившаяся тенденция к их росту. Особенную тревогу вызывает возрастающая роль эпидемических вспышек инфекционных заболеваний (дифтерия, корь, коклюш, кишечные инфекции), увеличение роли нозокомиальных и внутренних инфекций в структуре смертности. Поэтому любые попытки и поиски новых путей управления специфической и неспецифической реактивностью организма у детей не теряют своей актуальности.

При различной патологии детского организма существенно нарушается метаболическое равновесие и концентрация в биологических средах микроэлементов, в частности, железа и меди, а также связанных с ними белков - трансферрина (ТФ), лактоферрина (ЛФ), церулоплазмина (ЦП), супероксиддисмутазы (СОД) и других. Эти белки - важнейшие звенья в системе факторов неспецифической резистентности /Яковлев A.M. и соавт., 1988; Дубинина Е.Е., 1989/, обеспечивающих первичную устойчивость к различным повреждающим агентам, особенно инфекционным /Алешкин В.А. и соавт.1988/.

Защитное гомеостатическое действие металлопротеидов реализуется по нескольким направлениям. Основное - это выраженный ^противовоспалительный эффект, создаваемый антиокскдантной системой (АОС).

Ключевым фактором ферментативной АОС является СОД, которую принято рассматривать как цигоплазматический фермент. Однако при ряде состояний (гипероксия, гипоксия, инфекционно-воспалительные процессы) генерация активных форм кислорода (АФК) наблюдается как внутри клетки, так и вне ее. Только совместное действие интра-целлюлярной и зкстрацеллюлярной защиты может предотвратить повышение уровня реакционноспособных метаболитов кислорода.

Второе направление защиты -^антибактериальная и вирусингиби-рующая активность металлопротеидов. Связывая свободные ионы металлов, инактивируя.бактериальные токсины, препятствуя адсорбции

вирусов на чувствительных клетках и вызывая образование дефект
ных вирусных частиц, эти белки тормозят развитие бактериальной и
вирусной агрессии / BexgerB., Beger ж., 1987; Сиверина О.Б.

и соавт., 1987; Каргозия И.И., 1987/.

В последние годы стал известным еще один аспект защитного действия металлопротеидов. Многие из них обладают^иммунорегулятор-ными свойствамк. Так, основные транспортные белки 'плазмы крови ТФ и ЦП имеют выраженный иммуностимулирующий эффект, оказывая влия- ние и на гуморальные, и на клеточные факторы: усиливают продукцию интерлейкинов I и 2, выработку антител и бласттрансформацию лимфоцитов, хелперную и цитстоксическую активность Т-КЛЄТ0К / Ко#ша Е. e-t «і.,' 1986/.

Несомненный теоретический и практический интерес представляет изучение способности металлосвязывающих белков усиливать сопротивляемость детского организма к инфекциям, а также их взаимодействия с другими факторами неспецифической резистентности и иммунобиологической реактивности как у здоровых детей, так и при различных формах патологии; оценка этих показателей при инфекциях бактериальной и вирусной природы; установление характера и степени повреждения системы металлопротеидов при указанных условиях; исследования возможностей детского организма и сроков восстановления этой системы до «сходного уровня. Для,решения этих проблем необходимо иметь высокочувствительные диагностические препараты, позволяющие определять содержание металлопротеидов в биологических средах организма. В этой связи представляются важными исследования, направленные на разработку простых и экономичных способов выделения металлосодержащих белков, получения антисывороток к ним и создание соответствующих тест-систем.

y2MLI!25S2HSI явилось изучение содержания и динамики изменений комплекса металлопротеидов, выявление их взаимосвязей между собой и с другими факторами естественной защиты детского организма в норме н при отдельных формах патологии.

В соответствии с поставленной целью в ходе работы предстояло решить следующие задачи:

I. Провести комплексное исследование металлосвязывающих белков в системе некоторых факторов гуморального и клеточного звеньев иммунитета у здоровых новорожденных детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию и заболевших в раннем неона-

4 тальном периоде, а также их матерей.

1. Изучить содержание и динамику изменения металлопротеидов и отдельных показателей иммунобиологической реактивности у детей, больных псевцотуберкулезом (ПТ) и инфекционным мононуклеозом (ИМ).

2. Выявить взаимосвязи между мегаллопротеидами и некоторыми факторами неспецифической резистентности: сопоставить характер их изменений при псевдотуберкулезе и инфекционном мононуклеозе.

3. Разработать способы выделения и очистки ЛФ и СОД из биологических жидкостей; тест-системы для иммуноферментного анализа металлосвязквающих белков - ЛФ, СОД, ЦП.

0сновньте_положения_А_вшосимые_на_за1Щ{ту2

1. Анализ содержания металлопротеидов в пуповинной крови здо
ровых детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипок
сию, представляет большие информативные возможности для оценки
состояния ферментативной антиоксидантной защиты в организме ново
рожденного ребенка. Низкие величины металлосодержащих белков

(ЛФ, ТФ, СОД плазмы) свидетельствуют о недостаточной активности АОЗ, что способствует ускорению процессов перикисного окисления липидов. Высокие значения показателей Щ1 можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на длительную кислородную недостаточность.

4. Содержание металлопротеидов ЦП и ТФ в сыворотке крови детей, больных псевдогуберкулезоя и инфекционным мононуклеозом достоверно увеличивается. Динамика изменения уровней сходна: концентрация ЦП достигает максимума уже в начале болезни, а ТФ постепенно нарастает в ходе заболевания. Повышенное содержание металлосвязывающих белков при инфекционном мононуклеозе может использоваться как вспомогательный тест дифференциальной диагностики между бактериальной и вирусной инфекциями.

5. Обратная взаимосвязь между ЦП и ТФ, а также прямые корреляции медьсвязывающего белка с СЗ фракцией комплемента, иммуноглобулинами (Иг) М, (}, лейкоцитами, СОЗ, ЛФ свидетельствуют об активном участии этих металлопротеидов в патогенетическом процессе

при инфекционных заболеваниях у детей.

УУ^чная_новизна_і I.Впервые проведено комплексное исследование металлопротеидов (ТФ, ЛФ, ЦП, СОД плазмы, СОД и каталазы эритроцитов) и некоторых факторов неспецифической резистентности и иммунобиологической

5 реактивности (Т- и В-лимфоцитов; Иг М, G- , А; общей фракции комплемента; циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК); иммунных комплексов (ИК) грудного молока) у здоровых новорожденных детей и детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию и заболевших в первый месяц после родов. Выявлены высокие концентрации СОД плазмы пуповинной крови у здоровых новорожденных детей и ЦП у детей, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию.

2. Впервые проведено параллельное изучение содержания и дина
мики изменений металлопротеидов (ЦП, ТФ, ЛФ) у детей, больных ПТ

и ИМ. Установлено достоверное увеличение концентраций ЦП и ТФ при бактериальной (ПТ) и вирусной (ИЫ) инфекциях. Показаны одинаковые тенденции изменения их содержания (повышение уровней ЦП в начале и ТФ - в конце заболевания). Отмечены достоверно более высокие значения показателей основных металлопротеидов у детей больных ИМ. Выявлены корреляционные связи этих белков между собой и с другими показателями неспецифической резистентности и иммунобиологической реактивности в ходе развития псевдотуберкулеза и инфекционного мононуклеозе.

3. Разработан методический подход к изучению комплекса основ
ных металлопротеидов (ТФ, ЛФ, ЦП, СОД плазмы) в биологических
жидкостях организма. Доказана принципиальная возможность примене
ния разработанных тест-систем в лабораторном исследовании ЛФ, ЦП

и плазменной СОД.

4. Предложен новый способ выделения и очистки СОД из плазмы крови человека. Впервые подучены сыворотки против плазменной СОД и создана тест-система для иммуноферментного анализа СОД. Показана возможность количественного определения СОД в плазме крови.

5. Впервые разработан простой в реализации, достаточно информативный, обладающий высокой чувствительностью способ выявления ИК в грудном молоке (молозиве).

6. Предложен простой и экономичный способ выделения и очистки ЛФ из грудного молока. Создана и апробирована тест-система для иммуноферментного анализа ЛФ.

Практическая_ценность_работы:

Показано, что определение низких концентраций и активности СОД плазмы, повышенного содержания ЦП в пуповинной крови новорожденных детей является одним из доказательств перенесения ими длительной кислородной недостаточности, что открывает перспективные дополнительные возможности диагностики постгипоксических осложнений.

Установлено, что определение уровней ЦП и ТФ в сыворотке крови детей больных псевдотуберкулезом и инфекционным мононуклеозом может использоваться как вспомогательный тест в дифференциальной диагностике бактериальной и вирусной инфекций.

Показано, что повышение содержания металлосвязнвагалих белков ЦП и ТФ в сыворотке крови больных детей может служить одним из показателей, характеризующих остроту воспалительного процесса, степень тяжести бактериальных и вирусных инфекций.

Разработаны методы количественного определения ЛФ, ЦП и СОД плазмы с помощью "сэндвич"-варианта иммуноферыентного анализа; показана возможность их применения, эффективность использования для измерений соответствующих белков в сыворотке крови больных и здоровых детей.

Предложены достаточно простые и экономичные методы выделения Ш из грудного молока и СОД из плазмы крови, пригодные для получения очищенных препаратов этих белков и применения их в качестве диагностических средств в клинической практике и эксперименте.

Апвобац,ия_Еаботы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на заседаниях научно-медицинского общества детских врачей (Ленинград,1983, 1987), на научной конференции ЛПМИ (1987), на заседаниях научного общества микробиологов и эпидемиологов (Ленинград, 1988, 1991), на 17-ом Международном конгрессе по химиотерапии (Берлин, ФРГ, 1991), на 4-ой Международной конференции, инфекционных, и онкологических заболеваний (Прага, Чехословакия, 1992), на 1-ой Международной конференции по иммунореабилитации (Сочи-Дагомыс, Россия, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2Ь печатных работ.

Внедрени^_р_ез^льтатов_исслеаования. Методы количественного определения металлопротеидов в сыворотке крови, ИК в грудном молоке используются в практической работе отделений новорожденных детей клинической больницы СПБПШ, инфекционной

7 клиники СПбПШ, клиники респираторных вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН. Полученные данные внедрены в учебный процесс со студентами и слушателями факультета повышения квалификации на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбПМИ.

Разработано и внедрено в практику II рационализаторских предложений. По результатам исследования оформлены четыре изобретения:

1. "Способ получения вещества, обладающего супероксиддисму-тазной активностью" - авторское свидетельство № I43II22 от 15.06.88 г.

2. "Способ получения иммунных сывороток против СОД" -авторское свидетельство № I62I72I от 15.09.90г.

3. "Способ выявления иммунных комплексов в биологической жидкости" - авторское свидетельство № I68I26I от 01.06.91г.

4. "Способ получения лактоферрина" - авторское свидетельство № 1803992 от 09.10.92г.

йіатериалн диссертации изложены на 365 страницах машинописного текста, включающего введение, обзор литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждение, выводы и практические рекомендации. Работа иллюстрирована 72 таблицами и 67 рисунками. В списке литературы приведено 345 источников, в том числе иностранных 240.