Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Эпидемиология и общая характеристика семейства герпесвирусных инфекций 15
1.1.1. Современные аспекты этиопатогенеза, классификации, клинической картины и диагностики ЦМВИ у детей раннего возраста 18
1.1.2. Современные аспекты этиопатогенеза, классификации, клинической картины и диагностики ЭБВИ у детей раннего возраста 22
1.1.3. Современные аспекты этиопатогенеза, классификации, клинической картины и диагностики инфекции, вызванной ВГЧ-6, у детей раннего возраста 24
1.2. Современные аспекты этиопатогенеза, классификации,
клинической картины, диагностики и лечения ОРВИ у детей раннего возраста 1.3. Роль герпесвирусных инфекций в формировании соматической патологии 33
1.4. Современные подходы к лечению герпесвирусных инфекций, вызванных вирусами герпеса человека 4,5,6 типов у детей раннего возраста 37
1.5. Характеристика препарата рекомбинантного интерферона-альфа-2Ь
(ВИФЕРОН) и его применение у детей раннего возраста 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Общая характеристика работы 44
2.2. Объект исследования 45
2.3. Группы пациентов и критерии их формирования 45
2.4. Методы исследования 47
2.4.1. Клинические методы исследования 47
2.4.2. Лабораторные методы исследования 48
2.5. Методы статистической обработки результатов исследования 51
Глава 3. Клинико-лабораторная характеристика обследованных пациентов 53
3.1. Клиническая характеристика обследованных пациентов 53
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования детей раннего возраста 66
Глава 4. Вирусологическая характеристика обследованных детей 74
4.1. Частота выявления ДНК ВГЧ в разных биологических материалах обследованных пациентов 74
4.2. Анализ вирусной нагрузки ВГЧ 85
4.3. Особенности специфического гуморального иммунитета 93
4.4. Варианты инфицирования ВГЧ 95
Глава 5. Анализ результатов лечения препаратом альфа-2ь интерферона (виферон) детей раннего возраста с респираторными и персистирующими герпесвирусными инфекциями 105
Глава 6. Обсуждение результатов и заключение 121
Выводы 153
Практические рекомендации 155
Перспективы дальнейшей разработки темы 156
Список сокращений 157
Список литературы
- Современные аспекты этиопатогенеза, классификации, клинической картины и диагностики ЦМВИ у детей раннего возраста
- Группы пациентов и критерии их формирования
- Результаты клинико-лабораторного обследования детей раннего возраста
- Особенности специфического гуморального иммунитета
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Вирусы герпеса человека (ВГЧ) широко распространены в популяции [Викулов Г.Х.,2014]. Хроническая персистирующая герпесвирусная инфекция (ГВИ) часто сопровождается затяжным астеническим синдромом, способствует угнетению иммунитета, формированию соматической патологии. Для ГВИ характерен полиморфизм клинических проявлений, что создает трудности в диагностике этих заболеваний, особенно у детей младшего возраста [Вашура Л.В. с соавт., 2014; Кистенева Л.Б. с соавт., 2014; Лындин А.А.,2010].
Особую актуальность ГВИ имеют в период первичного инфицирования организма на фоне формирующейся иммунной системы. [Бабаченко И.В. с соавт., 2011]. Данные о частоте встречаемости и вариантах ГВИ у детей младшего возраста носят противоречивый характер.
Респираторные инфекции у детей являются самыми частыми в структуре общей заболеваемости [Романцов М.Г., 2012]. За последние 10 лет частота тяжелых и осложненных форм ОРВИ у детей раннего возраста возросла в 1,4 раза. Предполагаемой причиной чего может быть не только транзиторный иммунодефицит, но и персистенция ВГЧ [Левина А.С. с соавт., 2014].
Трудности лечения детей раннего возраста обусловлены ограничениями в назначении терапии, предпочтением малоинвазивных способов введения лекарственных препаратов [Нестерова И.В. с соавт.,2014]. Настоящая работа посвящена решению этих практически важных вопросов.
Степень разработанности темы исследования
Основанием для проведения диссертационного исследования послужила актуальность ГВИ у детей раннего возраста для педиатрической практики. Существенный вклад в изучение проблем этиологии, диагностики, клиники и терапии герпесвирусных инфекций у детей внесли В.А. Анохин, И.В.Бабаченко, Л.В.Вашура, Л.Б. Кистенева, Э.Н. Симованьян, Ф.С. Харламова, Т.А. Чеботарева, С.Г. Чешик, В.Ф.Учайкин, О.В. Шамшева, D.Lilleri, C.Martin-Gandul и другие.
По данным исследований И.В.Бабаченко, Л.В.Вашуры, Э.Н. Симованьян, Ф.С. Харламовой доказано, что хроническая персистирующая ГВИ часто проявляется затяжным респираторным и астеническим синдромом, является причиной усугубления иммунодефицита, формированию соматической патологии.
Для любого представителя герпесвирусов (ЦМВ, ВПГ1-2 типа, ВГЧ-6 типа и ВЭБ) характерен полиморфизм клинических проявлений, часто бессимптомное носительство, что создает трудности в диагностике. В раннем детском возрасте происходит первичное инфицирование организма на фоне формирующейся иммунной системы. Незрелость адаптивного и
противовирусного иммунитета создает предпосылки к возникновению вторичных бактериальных инфекций и повторных респираторных заболеваний у детей раннего возраста. Имеющиеся в литературе данные о частоте и вариантах ГВИ у детей раннего возраста носят разрозненный характер, нет единого представления о значимости активности герпесвирусов у детей на фоне ОРВИ. В настоящее время существуют единичные работы, например, C.Martin-Gandul, посвященные определению вирусной нагрузки в разных биологических средах у больного ребенка, что в дальнейшем может определять тактику лечения.
Актуальна разработка новых подходов к диагностике и терапии герпесвирусных инфекций у детей раннего возраста, так как единого мнения по определению алгоритма лечения детей с ГВИ до настоящего времени нет.
Цель исследования
Определение клинико-вирусологических вариантов герпесвирусной инфекции и оценка эффективности иммуномодулирующей терапии у детей раннего возраста с острыми респираторными вирусными заболеваниями.
Задачи исследования
-
Исследование клинико-вирусологических вариантов герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста с острыми респираторными вирусными инфекциями.
-
Определение клинико-вирусологических вариантов герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста с соматической патологией.
-
Сравнительный анализ клинико-вирусологической характеристики детей раннего возраста с острыми респираторными вирусными инфекциями и соматической патологией.
-
Оценка эффективности препарата альфа-2b интерферона у детей раннего возраста с острой респираторной вирусной инфекцией и герпесвирусной инфекцией.
Научная новизна
Впервые установлен ряд взаимосвязей каждого из ВГЧ с конкретными нозологическими формами у детей раннего возраста. Установлена статистически подтвержденная связь ЦМВ с острым артритом, менингоэнцефалитом, острым пиелонефритом, нейтропенией, анемией и лимфоцитозом н/э, СМД+ЗТПР, гепатитом ЦМВ-этиологии, гипотрофией; ВГЧ-6 - с экзантемой, лакунарной ангиной и фебрильными судорогами на фоне ОРВИ. Для ВЭБ подтверждена связь только с инфекционным мононуклеозом.
Впервые при анализе вирусологической характеристики герпесвирусных инфекций у пациентов раннего возраста показано, что при ОРВИ суммарный показатель выявления ДНК ВГЧ статистически значимо ниже, чем при соматической патологии.
Впервые установлено, что инфицирование различными ВГЧ происходит в разном возрасте: ЦМВ – до 6 месяцев, ВЭБ – в 7 месяцев и старше. Раннее, до 6 месяцев, инфицирование ВГЧ-6 характерно только для детей, не имеющих раннего дебюта соматической патологии. Особенностью ВЭБ является отсутствие выделения вируса с мочой до полутора лет.
Впервые показано, что частота выявления ДНК ЦМВ и ВЭБ в крови и слюне у детей раннего возраста при соматической патологии выше, чем при ОРВИ. У детей до полугода ДНК ВЭБ в слюне обнаруживали только при соматических заболеваниях. Впервые установлены статистически значимые ассоциации ВГЧ-6 и состояния здоровья детей: у практически здоровых пациентов - раннее, до 6 месяцев, обнаружение и высокая частота выявления ДНК ВГЧ-6, увеличивающаяся с возрастом; при соматической патологии - более позднее обнаружение ДНК ВГЧ-6, не ранее 7 месяцев; при ОРВИ возможность раннего выявления ДНК ВГЧ-6, но с частотой ниже, чем в норме.
Впервые выявлено, что вирусная нагрузка всех ВГЧ в крови детей раннего возраста с ОРВИ и соматической патологией низкая (log10 числа копий/мл <4), в моче - низкая или средняя, в слюне – максимальная, иногда достигающая высокого уровня (log10 числа копий/мл> 6), в слюне практически здоровых детей вирусная нагрузка ниже, чем в основной группе и группе сравнения.
Впервые установлены взаимосвязи вирусной нагрузки и степени тяжести заболевания у пациентов с ОРВИ: выявлена прямая корреляция вирусной нагрузки ЦМВ в слюне с тяжестью течения заболевания и числом осложнений у детей в возрасте до 6 месяцев, а также прямая корреляция вирусной нагрузки ВГЧ-6 в крови с наличием экзантемы.
Впервые при сопоставлении вариантов ВГЧ показано, что доля детей, не инфицированных герпесвирусами, намного выше среди практически здоровых детей и пациентов с ОРВИ, чем при соматической патологии, микст-инфекцию ЦМВ+ВГЧ-6+ВЭБ так же статистически значимо чаще выявляли у детей с ОРВИ и соматической патологией, чем у здоровых пациентов.
Впервые установлен дифференцированный элиминационный эффект препарата альфа-2b интерферона (ВИФЕРОН) по отношению к различным респираторным вирусам.
Теоретическая и практическая значимость работы
Установлена связь каждого из видов ВГЧ с определенными нозологическими формами у пациентов раннего возраста. Так, наличие четких взаимосвязей обнаружения маркеров ЦМВ с клиническими признаками острого артрита, менингоэнцефалита, острого пиелонефрита, с нейтропенией, анемией, лимфоцитозом н/э, СМД+ЗТПР, гепатита н/э, гипотрофии позволило рекомендовать для детей раннего возраста с вышеуказанной патологией вирусологическое обследование с обязательным определением маркеров ЦМВ, а при экзантеме,
лакунарной ангине и фебрильных судорогах на фоне ОРВИ - обязательное определение маркеров ВГЧ-6. Полученные данные позволяют оптимизировать диагностику ГВИ у детей с различной соматической патологией.
Доказано, что при оценке вирусологического статуса детей раннего возраста наиболее доступно и достаточно информативно исследование слюны. Это позволяет считать неинва-зивный метод исследования слюны приоритетным в педиатрической практике.
У детей раннего возраста с ОРВИ показана связь вирусной нагрузки герпесвирусов со степенью тяжести заболевания, исследуемым материалом и возрастом ребенка, что позволяет рекомендовать исследование вирусной нагрузки как дополнительный метод диагностики с целью выработки алгоритма противовирусной терапии.
Назначение препарата ВИФЕРОН в суточной дозе 1000000 МЕ (по 500000 МЕ 2 раза в день) детям раннего возраста с ОРВИ обеспечивает более быструю элиминацию респираторных вирусов, более раннее статистически значимое исчезновение клинических и лабораторных признаков воспаления. Полученные данные позволяют рекомендовать альфа-2-b интерферон (ВИФЕРОН) пациентам раннего возраста с РС-вирусной инфекцией и аденовирусной инфекцией, а также при сочетании ОРВИ и герпесвирусной инфекцией.
Методология и методы исследования
Методологическая основа диссертационной работы спланирована согласно поставленной цели исследования и включает последовательное применение методов научного познания с целью решения поставленных задач. Исследование эпидемиологических и клинических особенностей течения ОРВИ у детей раннего возраста с герпесвирусной инфекцией выполнено по принципу сплошного скрининга, дизайн клинических исследований представляет собой сравнительный открытый рандомизированный характер с использованием эпидемиологических, клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов исследования.
Положения, выносимые на защиту
Проведенное исследование детей раннего возраста с ОРВИ выявило, что ДНК ВГЧ обнаружено в различных биологических материалах (кровь, моча, слюна) методом ПЦР у 20,4% детей с различиями в зависимости от типов ВГЧ: ДНК ЦМВ обнаруживали в 13,5% проб крови, 31,7% - мочи, 33,6% - слюны; ДНК ВГЧ-6 чаще выявляли в слюне (45,1%), чем в крови (21,1%) и моче (4,2%); наиболее низкие показатели по сравнению с другими герпесви-русами отмечены при детекции ДНК ВЭБ (в крови -9,8%, в моче-1,85%, в слюне -18%). Суммарная частота обнаружения ДНК ВГЧ у детей раннего возраста с соматической патологией составила 35,9% и была сопоставима с частотой регистрации ВГЧ в разных биологических средах: в слюне - 45,9%, в крови - 30,1% и в моче - 32,5%. Отмечена бльшая частота
выявления ДНК ЦМВ, чем ВЭБ и ВГЧ-6 в слюне - 65,7% vs 20,5% vs 39,9%(p<0,05) и в моче - 65,7% vs2,3% vs9,3%; сопоставимая частота обнаружения ДНК ЦМВ (34,9%), ВГЧ-6 (33,3%) и ВЭБ (21,6%) в крови.
Отмечена более высокая частота обнаружения ДНК всех ВГЧ и ДНК ЦМВ у детей с ранним дебютом соматической патологии, чем в основной группе. Выявлена ранняя - в возрасте 0-6 месяцев - детекция ДНК ВГЧ-6 у детей с ОРВИ; отсутствие ДНК ВЭБ в слюне до 7 месяцев и низкая частота обнаружения ВЭБ в последующем у детей обеих групп. Обнаружено, что репликация ЦМВ коррелирует с острым артритом (83,3%), менингоэнцефалитом (83,3%), пиелонефритом (63,3%), нейтропенией, анемией и лимфоцитозом неясной этиологии (55,6%), СМД+ЗТПР (52%), гепатитом (41,7%), гипотрофией (40%); репликация ВГЧ-6 – с экзантемой (44,4%), лакунарной ангиной (38,1%) и фебрильными судорогами на фоне ОРВИ (33,3%). Установлена прямая корреляция вирусной нагрузки ЦМВ в слюне с тяжестью заболевания и числом осложнений ОРВИ у детей в возрасте до 6 месяцев (r=0,468; =31; p<0,01), и установлена взаимосвязь высокой вирусной нагрузки ВГЧ-6 в крови с наличием экзантемы (r=0,317; =51; p<0,01).
Частота моно-ЦМВ инфицирования у детей с соматической патологией была в 4,2 раза выше, чем у больных с ОРВИ и в 10,9 раз выше, чем у практически здоровых детей. Доля детей с активными формами инфекции в группе с соматической патологией была статистически значимо выше, чем у детей с ОРВИ (82% vs 39%; р <0,05).
Проведенное исследование применения у детей раннего возраста с ОРВИ препарата ре-комбинантного альфа-2b интерферона (ВИФЕРОН) выявило сокращение длительности заболевания, симптомов интоксикации и катаральных явлений по сравнению с группой сравнения. Показано, что у детей основной группы на 7 – 10 сутки заболевания обнаружение вирусов было статистически значимо ниже (25%), чем в группе сравнения (71%) (p<0,01). Влияние кратковременного применения альфа-2b интерферона (ВИФЕРОН) на элиминацию герпесвирусов отсутствовало.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его критериям доказательной медицины, репрезентативностью выборок обследованных пациентов, достаточным объёмом проведенных наблюдений и использованием современных аналитических методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных. Результаты исследования оформлены в тезисах, статьях, внедрены в лекции и практические занятия с педиатрами.
Разработанные рекомендации были внедрены в лечебно - диагностический процесс ИКБ №1(главный врач д.м.н., проф. А.В. Девяткин), ФГБУ «ЦКБ с поликлиникой» УДП РФ (главный врач д.м.н., проф. Н.К.Витько), в практику работы инфекционных отделений.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 13 конгрессах и научно - практи
ческих конференциях, в том числе на 1 – за рубежом: на 4 Межрегиональной конференции
с международным участием «Актуальные вопросы педиатрии» (Калининград, 25-26 мая
2012г); на ХI Конгрессе детских инфекционистов «Педиатрия и Инфекция» (Москва, 5-7 декабря 2012г.); на ХII Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики», (Москва, 11-13 декабря 2013г.); на VI Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 24-26 марта 2014г.); на научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций: подходы, традиции, инновации» (С-Петербург, 23-25 апреля 2014г.); на XII Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства. Внедрение новых медицинских технологий в практическое здравоохранение» (Москва, 1-2 октября 2014г.); на ХIII Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 11-13 декабря 2014г.); на VII Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 30 марта -1 апреля 2015г.); на Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (С-Петербург, 9-10 октября 2015г.); на международном конгрессе Европейского респираторного общества (European Respiratory society, International Congress) (Amsterdam, 26-30 September 2015г.); на ХIV Конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 10-12 декабря 2015г.); на VIII Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 28 марта -30 марта 2016г.); на XV Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 25-27 октября 2016 г.).
По материалам диссертации опубликованы 22 печатные работы, в том числе, 5 статей, опубликованных в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК.
Личное участие автора в получении результатов
Автором осуществлено планирование, организация и проведение исследований по всем разделам диссертации: отбор пациентов, динамическое наблюдение за пациентами, анализ данных клинического обследования, назначение и контроль терапии, забор биологического материала для исследования, проведение экспериментального исследования. Разработаны схемы и алгоритмы диагностики и лечения герпесвирусных инфекций у детей ранне-8
го возраста. Подготовлены материалы для публикаций, в том числе в англоязычной литературе. Проведены обобщение, анализ и статистическая обработка полученных данных, сформулированы научные положения работы, выводы, практические рекомендации.
Структура и объем диссертации:
Современные аспекты этиопатогенеза, классификации, клинической картины и диагностики ЦМВИ у детей раннего возраста
ЦМВИ - одна из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [1, 203, 230, 246, 250, 267, 269, 270, 316]. ЦМВИ широко распространена, ее возбудителем является ВГЧ 5-го типа, входящий в подсемейство Betaherpesvirinae, который был открыт M.G.Smith, W.A.Rowe в 1956 г. [15, 67]. Вирус состоит из ДНК, заключенной в В - капсид, покрытый тегументом, в состав которого входит структурный белок рр65, кодируемый геном UL83. Показано, что рр65 играет важную роль в защите вируса от иммунного ответа: блокирует продукцию интерферона (ИФН) - альфа. Вирус адсорбируется на мембране и проникает внутрь клетки путем пиноцитоза, после чего идет быстрое перемещение нуклеокапсида, окруженного тегументом, в ядро клетки. Уже через 1 час после проникновения белок рр65 может быть обнаружен в ядре инфицированной клетки. Поскольку доля рр65 выше по сравнению с другими белками ЦМВ, его определение используют при лабораторной диагностике для подтверждения ранней активной ЦМВИ, в частности при быстром культуральном методе (БКМ) и определении рр65 в лейкоцитах периферической крови [171, 200, 227, 318].
Источником ЦМВИ является заболевший человек или вирусоноситель. Основными путями заражения являются воздушно-капельный, фекально-оральный (через загрязненные руки и предметы обихода), контактный (через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки), парентеральный, трансплантационный. Возможна передача вируса при поцелуях и половом контакте, а также вертикальная (трансплацентарная). Stowell J.D. et al (2012) показано, что на контаминированных поверхностях (дерево, ткань, пластик) вирус сохраняет инфекционную активность в течение 1-6 часов [315]. Известно, что ЦМВ можно обнаружить в моче каждого сотого новорожденного ребенка, в возрасте 1 года заражен каждый пятый ребенок, к 35 годам - 40% населения и 100% - к 50 годам [23, 280]. ЦМВ может инфицировать любые клетки, но основными мишенями считают клетки околоушных желез, макрофаги, лимфоциты, гепатоциты, клетки нервной системы, эпителий слизистых оболочек, сетчатки, почек. ЦМВИ является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка. При интранатальной ЦМВИ возможно поражение центральной нервной системы (ЦНС) плода. Дети, инфицированные ЦМВ, нередко рождаются с малой массой тела, угнетенными рефлексами, расстройствами актов глотания и сосания, иногда с косоглазием и нистагмом, мышечной дистонией. При ультразвуковом исследовании (УЗИ) головного мозга инфицированного плода могут быть найдены кисты, внутрикраниальные кальцификаты, атрофия коры мозга, микроцефалия, внутренняя гидроцефалия, порэнцефалическая и перивентрикулярная энцефаломаляция [1, 195, 224, 267].
Причиной поражения ЦНС при фетальной ЦМВИ может являться фокальный энцефалит с поражением серого и белого вещества и хориоидального сплетения, а также периэпендиматит. Разрешение острого энцефалита приводит к глиозу и кальцификации с преимущественно перивентрикулярной локализацией кальцификатов, что, в свою очередь, может способствовать формированию микроцефалии или гидроцефалии [214]. По данным Vivolo М. et al (2012) IgM-анти-ЦМВ выявляют в крови 2,6% детей с неврологическими заболеваниями, IgG-анти-ЦМВ - у 93,4%. Частота обнаружения IgG-анти-ЦМВ в спинномозговой жидкости достигала 31,6%. Все это указывает на этиологическую роль ЦМВ при болезнях ЦНС [206, 322].
Клинические проявления ЦМВИ весьма разнообразны и неспецифичны. Заболевание может протекать в активной и латентной форме. В случае приобретенной ЦМВИ инкубационный период составляет 15-90 дней. При раннем постнатальном инфицировании клинические признаки болезни чаще проявляются через 1-2 месяца после родов. Заболевание может протекать с изолированным поражением слюнных желез или внутренних органов. Исходя из ведущего клинического синдрома, выделяют респираторную, церебральную, желудочно-кишечную, гепато-билиарную, почечную, гематологическую формы ЦМВИ. Могут также поражаться надпочечники, щитовидная железа, яички и яичники, глаза, кожный покров, тимус. Заболевание, как правило, носит длительный, рецидивирующий характер [15, 36, 49, 67, 275, 305].
У детей первого года жизни ЦМВИ также характеризуется многообразием клинической картины, часто протекает под маской других заболеваний, что затрудняет раннюю диагностику [85, 86, 87, 90, 157]. В раннем возрасте, и врожденная, и приобретенная ЦМВИ может протекать бессимптомно или проявляться клиникой респираторного заболевания с синдромом бронхообструкции, коклюшеподобным кашлем и интерстициальной пневмонией или субфебрилитетом [154]. ЦМВ может также вызывать острый или хронический гепатит врожденного (в 69,3%) или приобретенного (у 30,7% случаев) характера. У 72,2% детей врожденный первично хронический ЦМВ-гепатит сочетается с пороками развития желчевыводящих путей (атрезиями - у 91,2%, кистами - у 8,8%). Острый ЦМВ-гепатит характеризуется лихорадкой, интоксикацией, желтухой, гепатоспленомегалией, повышением уровня билирубина и активности трансаминаз в крови. Хронический ЦМВ-гепатит проявляется желтухой, гепатоспленомегалией, внепеченочными знаками, геморрагическим синдромом, повышением уровня трансаминаз и билирубина, снижением общего белка, альбуминов, протромбинового индекса, изменениями ультразвуковой картины, морфологическими изменениями ткани печени. [54, 169, 170, 175].
Группы пациентов и критерии их формирования
Определение антител классов IgM и IgG к ЦМВ выполняли на анализаторе «Cobas» (фирма ROCH), используя электрохемилюминесцентный иммунотест «ECLIA».
Антитела классов IgM и IgG к ВЭБ выявляли на анализаторе «LIASON» посредством CLIA (хемилюминесцентного иммунологического анализа).
Для определения антител класса IgG к ВГЧ-6 в сыворотке или плазме крови применяли метод ИФА с использованием тест-системы «BeKToHHV-6-IgG».
ДНК ВГЧ в биологическом материале обнаруживали методом ПЦР. Параллельно у каждого ребенка исследовали несколько биологических материалов: кровь, слюну и мочу. Для забора крови использовали пробирки с разделительным гелем объемом 5 мл. Образцы мочи собирали в вакуумные пробирки с помощью специальной системы для сбора мочи для ПЦР-исследований. Образцы слюны собирали из подъязычной области ротовой полости одноразовыми пипетками и помещали в специальный контейнер.
Выделение и амплификацию ДНК ВГЧ проводили с помощью сертифицированных наборов фирмы «ДНК-Технология». Для постановки ПНР с детекцией в режиме реального времени (real time-PCR) использовали наборы "ЦМВ-ГЕН" (CMV), "ЭБВ-ГЕН (EBV)", "ВГЧ-6 (HHV6)". Проведение амплификации и детекцию осуществляли с использованием оборудования (термоциклера) "DT-Prime" («ДНК-Технология»).
Оценивали «вирусную нагрузку» в крови. Анализировали ее показатели в двух форматах - абсолютном количестве копий ДНК (число копий/мл), а также в логарифмическом выражении, в виде десятичных логарифмов (logio), поскольку число копий ДНК достигало значительных величин (до 10 порядков).
В работе используется термин «маркеры вирусов». Существуют прямые и косвенные маркеры вирусов. К прямым маркерам относятся белки, ДНК вирусов; косвенными маркерами считаются обнаруженные специфические иммуноглобулины.
Верификация респираторных вирусов в соскобах эпителиальных клеток из носоглотки и отделяемого слизистой оболочкой полости носа
ДНК/РНК респираторных вирусов определяли в соскобах эпителиальных клеток из носоглотки, которые собирали зондом и помещали в пробирку с транспортной средой.
Выделение и амплификацию ДНК проводили с помощью сертифицированных наборов фирмы «ДНК-Технология».
Для выделения ДНК/РНК из клинических материалов использовали набор реагентов «Проба-НК». ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили с использованием набора «ПНЕВМО-СКРИН Вирусы (ОРЗ Вирус Комплекс)». Для амплификации использовали термоциклер «DT-Prime» («ДНК-Технология»).
Антигены (АГ) респираторных вирусов в отделяемом полости носа выявляли в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для приготовления мазков из полости носа материал получали сухим аппликатором, который помещали в пробирки с фосфатно-солевым буфером (рН=7,0-7,4). Затем пробирки интенсивно встряхивали, аппликатор отжимали и удаляли. Полученную клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин (150g). Осадок клеток ресуспендировали в 0,2 мл фосфатно-солевого буфера и готовили мазки. Стекла с мазками фиксировали в охлажденном при 4С ацетоне.
Для выявления АГ респираторных вирусов посредством РНИФ использовали иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие (респираторно-синцитиальные, парагриппозные, гриппозные сухие) («ООО Предприятие по производству диагностических препаратов», Россия, Санкт-Петербург). Этот фрагмент работы был выполнен совместно с врачом 1 ИКБ Бондаревой Л.Н. Определение клеточного иммунитета Иммунологические показатели периферической крови пациентов оценивали в динамике, дважды - при поступлении в стационар (в 1-3 сутки заболевания) и при выписке (на 7-10 сутки), в период ранней реконвалесценции.
Венозную кровь забирали в вакуумные пробирки с трехзамещенной калиевой солью ЭДТА в качестве антикоагулянта. Материал сохраняли до исследования при комнатной температуре (20-25С) не более 12 часов с момента забора. Для оценки клеточного звена иммунитета в периферической крови определяли относительное (в %) и абсолютное (кл/мкл крови) количество: -лимфоцитов (CD3 CD19 ) Количественную оценку лимфоцитов с различными фенотипами в крови определяли, используя проточный цитофлуориметр «Becton Dickinson» FACS Calibur 2-х лазерный (США) путем кратного (двойного или тройного) окрашивания после их специфического связывания с моноклональными антителами (МКАТ) Multi TEST IMK Kit. Исследование осуществляли согласно инструкции производителя.
Иммунорегуляторный индекс вычисляли по соотношению числа лимфоцитов с фенотипами СШ 4 /СШ 8 .
Полученные данные сравнивали с соответствующими нормативными показателями, опубликованными в практическом руководстве «Иммунология детского возраста» под редакцией Щербины А.Ю. и Пашанова Е.Д. (2006) [142].
Статистический анализ данных осуществляли с использованием пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США) [ЗО, 145, 174].
При статистическом анализе качественных признаков определяли и анализировали показатели абсолютной и относительной частоты.
Для анализа соответствия распределений количественных признаков нормальному закону применялся критерий Шапиро-Уилка.
При статистическом анализе количественных признаков, соответствовавших нормальному распределению, оценивали среднее и стандартное отклонение (М+т).
Если значения количественного показателя выборки не соответствовали нормальному распределению, оценивали и анализировали значения медианы и квартилей (Me [Qi; Оз]) Для проверки гипотез о сходстве или различии характеристики выборок (групп детей) применяли корреляционный анализ, определяя коэффициент корреляции (г); число степеней свободы (v), равное пі+пг-2, для уровней значимости, соответствующих р 0,05, р 0,01 и р 0,001. Для сравнения несвязанных групп по количественным и порядковым признакам использовался тест Манна-Уитни (Uest). Для сравнения связанных групп по количественным и порядковым признакам использовался тест Вилкоксона (West). Для сравнения несвязанных групп по качественным признакам использовались тест %-квадрат и точный критерий Фишера. Статистически значимыми (достоверными) считали результаты при достигнутом уровне значимости р 0,05.
Результаты клинико-лабораторного обследования детей раннего возраста
Примечание: # - статистически значимое различие соответствующих показателей в основной группе и группе сравнения.
При повторном лабораторном обследовании пациентов на 7 день госпитализации выявлены следующие различия гемограммы детей с ОРВИ и пациентов с соматическими заболеваниями: у детей в возрасте менее 6 месяцев большим было общее количество нейтрофилов и сегментоядерных нейтрофилов, меньшим число лимфоцитов, эозинофилов и базофилов. В возрасте старше 18 месяцев, напротив, число лимфоцитов выше у пациентов с ОРВИ, количество моноцитов, эозинофилов и базофилов - ниже. Таким образом, признаки остроты воспалительного процесса через 7-10 дней сохранялись в основном у детей первых 6 месяцев жизни.
В формуле крови больных в возрасте от 0 до 6 мес. с ОРВИ в период ранней реконвалесценции относительное число нейтрофилов по-прежнему было выше, а лимфоцитов - ниже, чем в группе сравнения. У детей этого возраста и в основной группе, и в группе сравнения достоверных изменений гемограммы в динамике не выявлено (таблица 13). Таблица 13
Сопоставление гемограммы при поступлении больных в стационар и в период ранней реконвалесценции выявил существенную динамику показателей крови, которая свидетельствовала о снижении остроты воспалительного процесса у большинства пациентов основной группы в возрасте от 7-18 месяцев. У подавляющего большинства детей лейкоцитоз через 7-10 суток соответствовал возрастной норме. У большинства пациентов нормализовалось относительное число нейтрофилов и лимфоцитов и, соответственно, количественное соотношение этих клеток, а также СОЭ (таблица 14). Таблица 14
Анализ динамики гемограммы у большинства пациентов основной группы в возрасте более 18 месяцев также выявил признаки снижения остроты заболевания: уменьшение показателей лейкоцитоза и относительного числа нейтрофилов, параллельный рост относительного количества лимфоцитов даже в большей степени, чем у детей в возрасте от 7 до 18 месяцев. Статистически значимых изменений СОЭ в этой возрастной подгруппе не отмечено. В то же время почти у трети детей с соматической патологией относительное количество нейтрофилов за период наблюдения возросло, а число лимфоцитов уменьшилось.
Таким образом, обобщение результатов клинических исследований позволяет сформулировать несколько положений, касающихся особенностей клинической характеристики пациентов основной группы (с ОРВИ) и группы сравнения (без ОРВИ, но с соматической патологией): - показана зависимость частоты клинических диагнозов при поступлении от возраста больных: диагнозы «ОРВИ, БОС», «СМД и ЗТПР», «Нейтропения, анемия, лимфоцитоз н/э», «ЦМВ-гепатит», «Острый пиелонефрит» детям в возрасте менее полугода ставили статистически значимо чаще, чем в других возрастных группах. Напротив, диагнозы «ОРВИ, острый ларинготрахеит», «Лимфаденопатия и гепатоспленомегалия н/э», «Острая пневмония» чаще отмечались при госпитализации пациентов в возрасте более 6 месяцев; - в возрасте до полугода не было зарегистрировано случаев лакунарной ангины, фебрильных судорог на фоне ОРВИ, менингоэнцефалита и серозного менингита, немотивированного субфебрилитета, а ИМ, ОРВИ, сочетающейся с острыми отитом, синуситом, гайморитом, острого артрита и олигоартрита н/э, инфекционной экзантемы - у больных младше 18 месяцев. - Для клинической картины больных основной группы в период госпитализации были характерны признаки острой респираторной инфекции катаральные явления, лихорадка от субфебрильных до фебрильных значений, недомогание, вялость, интоксикация, у 31,3% больных - признаки острого ларинготрахеита, БОС (чаще в возрасте менее 6 месяцев - у 41,1%). Реже регистрировали острый отит, синусит и/или гайморит, фебрильные судороги на фоне ОРВИ, острый бронхит (трахеобронхит), лакунарную ангину, ИМ и острую пневмонию.
При биохимическом исследовании показано, что у пациентов с соматическими заболеваниями активность АлАТ выше, чем у детей с ОРВИ, в особенности в возрасте менее 6 и старше 18 месяцев, что может быть признаком предикции раннего дебюта соматической патологии.
Гемограмма детей с ОРВИ при поступлении в большей мере отражала острый характер воспаления, чем у больных с соматической патологией: более высоким были лейкоцитоз и СОЭ (в возрасте старше 6 месяцев), относительное количество нейтрофилов (у пациентов в возрасте до полугода - сегментоядерных, старше полугода - палочкоядерных), значительно снижено относительное число лимфоцитов (у детей старше 6 месяцев). Различие гемограммы у детей в возрасте от 0 до 6 месяцев было выражено в меньшей степени, чем в других возрастных группах. У детей с соматической патологией количество эозинофилов и базофилов в циркуляции было выше, чем у детей с ОРВИ, что, по-видимому, объясняется снижением уровня эозинофилов и базофилов в циркуляции при остром воспалительном процессе, а также умеренной физиологической эозинофилией и базофилией, характерной для раннего возраста. - В периоде ранней реконвалесценции (на 7-10 день госпитализации) признаки остроты воспалительного процесса в гемограмме сохранялись только у детей первых 6 месяцев жизни. У детей старше 6 месяцев выявлена значительная динамика показателей крови, которая свидетельствовала о снижении остроты процесса: у большинства пациентов основной группы лейкоцитоз соответствовал возрастной норме, нормализовалось относительное число нейтрофилов и лимфоцитов и количественное соотношение этих клеток. - Наиболее значимым результатом этого фрагмента исследования явился впервые установленный ряд четких взаимосвязей каждого из ВГЧ с конкретными нозологическими формами. Так, установлена статистически подтвержденная ассоциация репликации ЦМВ с острым артритом (олигоартритом): соотношение частоты выявления ДНК ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-6 - 83,3%, 0%, 0%; менингоэнцефалитом - 83,3%, 0%, 33,3%; острым пиелонефритом - 63,3%, 0%, 11,1%; нейтропенией, анемией и лимфоцитозом неясной этиологии - 55,6%, 16,7%, 11,1%; СМД+ЗШР - 52,0%), 2,7%, 0%; гепатитом ЦМВ-этиологии -41,7%о, 0%), 0%; гипотрофией - 40,0%о, 0%, 13,3%о. В меньшей степени с репликацией ЦМВ ассоциированы острый бронхит, трахеобронхит и БОС. Такое разнообразие клинико-вирусологических ассоциаций, по-видимому, обусловлено, выраженной полигистиотропностью ЦМВ. Статистически значимое лидерство ВГЧ-6 установлено при экзантеме, лакунарной ангине и фебрильных судорогах на фоне ОРВИ. Патогенетическое значение репликации ВЭБ у обследованных детей установлено только для ИМ. Четкой связи острого ларинготрахеита, ОРВИ, лимфаденопатии, гепатоспленомегалии, острой пневмонии, субфебрилитета н/э, отита, синусита, гайморита на фоне ОРВИ и репликации ВГЧ не найдено.
Особенности специфического гуморального иммунитета
При сопоставлении показателей в начале заболевания и в периоде ранней реконвалесценции в обеих группах выявлено увеличение абсолютного количества «нулевых» клеток и В-лимфоцитов, при этом степень увеличения последнего показателя у детей основной группы выше, чем в группе сравнения.
Для выявления функционального потенциала «нулевых» лимфоцитов были оценены корреляционные связи между их числом и числом CD16 CD56 -клеток (NK-клеток, естественных киллеров). У больных, получавших терапию интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН"), выявлена прямая корреляционная зависимость между числом естественных киллеров и «нулевых» клеток с высокой степенью статистической значимости (r=0,568, v=18, р 0,01). В группе сравнения подобной корреляции не выявлено (r=-0,074, v=18, р 0,05).
Таким образом, были сопоставлены результаты вирусологического и иммунологического обследования детей раннего возраста с острыми респираторными вирусными инфекциями, которые составили две рандомизированные группы - пациентов, которым назначали только симптоматическое лечение и пациентов, получавших симптоматическое лечение в сочетании с терапией интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным.
Ребенок Х.А., 9 месяцев поступил в КИБ№ 1 с диагнозом ОРВИ, о. ларингит. Anamnesis vitae: Родился от молодых здоровых родителей, беременности с токсикозом 1 триместра и угрозой прерывания, срочных физиологических родов. Вес при рождении 3140 г, рост 54 см., оценка по шкале Апгар 8/9. Период новорожденности без особенностей, на грудном вскармливании до 8 месяцев. Привит по календарю. Психомоторное развитие по возрасту.
Anamnesis morbi: заболел остро, появились ринит, сухой кашель, осиплость голоса, температура до 37,5, снижение аппетита, сонливость. Поступил в стационар на 2 сутки болезни в состоянии средней тяжести. Кожные покровы бледно-розового цвета, чистые. Лимфатические узлы (подчелюстные, заднешейные, подмышечные и паховые) увеличены до 1,0 см, безболезненные. Яркая гиперемия слизистой ротоглотки, увеличение миндалин 2 степени, наложений нет. Голос осипший. Носовое дыхание умеренно затруднено, скудное серозное отделяемое. В легких жесткое дыхание, проводится во все отделы, хрипов нет. Тоны сердца ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Стул и диурез не нарушены. Менингеалъной и очаговой симптоматики нет.
Клинический анализ крови: лейкоциты - 11,7 10 , п/я нейтрофилы - 8%, с/я нейтрофилы - 50%, лимфоциты - 37%, моноциты - 5%, гемоглобин-111г/л, эритроциты - 4,33 10 , СОЭ - 22 мм/ч. Общий анализ мочи - норма. Б/х анализ крови: АСТ-58 ед/л, АЛТ-24ед/л, ЩФ - 154ед/л. Вирусологическое обследование: выявлены IgG-антитела к ЦМВ, IgM к ЦМВ - не обнаружены. Концентрация ДНК ЦМВ в крови составила 300 коп/мл, в моче - 132500 коп/мл, в слюне - 6386400 коп/мл. Концентрация ДНК ВГЧ-6 в крови -1900 коп/мл, в моче - 0 коп/мл, в слюне - 6500 коп/мл.
На 3 сутки болезни - повышение температуры до 39,0, нарастание кашля, появление одышки смешанного характера и выраженного БОС. Сохраняется полилимфаденопатия. В легких дыхание жесткое, сухие свистящие хрипы. На рентгенограмме грудной клетки - картина диффузного бронхита. Гипертермия, катаральные явления и признаки БОС сохранялись в течение 3 суток. Получал антибактериальную и симптоматическую терапию, противовирусный препарат Виферон (интерферон альфа-2Ъ человеческий рекомбинантный) в возрастной дозировке.
Окончательный диагноз: ОРВИ, среднетяжелая форма. Бронхит. БОС, ДН 1 ст. Лимфаденопатия. Сочетанная герпесвирусная инфекция (ЦМВ+ВГЧ-6).
На 7 сутки болезни - снижение температуры до субфебрильных значений, улучшение самочувствия, БОС купирован. Клинический анализ крови через 7 дней: лейкоциты - 6,9 10 , п/я нейтрофилы - 3%, с/я - 32%, лимфоциты - 51%, моноциты -14%, гемоглобин - 106г/л, эритроциты - 4,35 10 , СОЭ - 25мм/ч.
Ребенок был выписан с улучшением. Получал терапию интерфероном алъфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОНОМ ) в течение месяца. При катамнестическом обследовании через месяц выявлена ДНК ЦМВ с концентрацией в моче - 218900 коп/мл, в слюне-3969500 коп/мл. ДНК ВГЧ-6 обнаружена в концентрации в крови - 800 коп/мл, в слюне-22300 коп/мл. Субфебрилитет и полилимфаденопатия сохранялись.
Таким образом, этот клинический пример демонстрирует осложненное течение ОРВИ на фоне смешанной ГВИ, ЦМВ и ВЧГ-6-ассоциированной, с высоким уровнем вирусной нагрузки.
Полученные данные выявили ряд закономерностей, ассоциированных с терапией интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным: - противовирусный эффект терапии интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН) подтвержден статистически значимо более высоким показателем элиминации респираторных вирусов при лечение интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным по сравнению с симптоматическим лечением; показан дифференцированный противовирусный эффект терапии интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН") по отношению к различным респираторным вирусам: полная элиминация риновируса, метапневмовируса и гриппа, существенная - PC-вируса и аденовируса, отсутствие элиминации бокавируса; эффективность терапии интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным по отношению к респираторным вирусам значительно выше, чем к ВГЧ: отсутствие элиминации ДНК ЦМВ в периоде ранней реконвалесценции и рост числа положительных проб в группе сравнения позволило предположить, что ОРВИ может приводить к транзиторной иммунной недостаточности; - положительная динамика гемограммы в большей степени выражена у детей, получавших терапию интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН ), что свидетельствует об эффекте препарата, направленном на скорейшее разрешение воспалительного процесса; - положительная динамика иммунограммы также в большей степени выражена в основной группе. Отмечается больший прирост числа В-лимфоцитов у больных, получавших терапию интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН"), что можно расценивать как дополнительную индукцию у них гуморального иммунитета; - увеличение числа «нулевых» клеток при терапии интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбинантным (ВИФЕРОН) ассоциировано с ростом числа «естественных киллеров», обладающих противовирусной активностью, в отличие от «нулевых» клеток, поступающих в циркуляцию детей группы сравнения, которые, как можно предположить, не обладают эффекторной противовирусной функцией и относятся к низкодифференцированным клеткам или клеткам с запрограммированной гибелью.