Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о цитомегаловирусной инфекции у детей (обзор литературы) 9
1.1 Структура, организация генома и репликация цитомегаловируса 9
1.2 Эпидемиология ЦМВИ в России и за рубежом 1.3. Современные аспекты патогенеза ЦМВИ 13
1.4. Особенности клинического течения соматической патологии у детей на фоне ЦМВИ 15
1.5. Методы лабораторной диагностики ЦМВИ 18
1.6. Современные подходы к лечению ЦМВИ у детей 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1 Общая характеристика больных 33
2.2 Методы обследования 36
2.3 Статистические методы анализа 40
ГЛАВА 3. Частота встречаемости активной формы цмви у детей с соматической патологией 42
Глава 4. Клинические особенности течения соматических заболеваний у детей на фоне активной ЦМВИ 47
Глава 5. Клинико-диагностическое значение обнаружения структурного белка цмв рр65 в лейкоцитах периферической крови у детей с соматическойпатологией 88
Заключение 97
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Перспективы дальнейшей разработки темы 110
Использованные сокращения 111
Список литературы
- Особенности клинического течения соматической патологии у детей на фоне ЦМВИ
- Современные подходы к лечению ЦМВИ у детей
- Статистические методы анализа
- Клинические особенности течения соматических заболеваний у детей на фоне активной ЦМВИ
Особенности клинического течения соматической патологии у детей на фоне ЦМВИ
Так, по результатам исследований, проведенных А. И. Ожеговым, 96% из обследованных беременных были серопозитивными в отношении ЦМВ, и 86,8% рожденных ими детей оказались инфицированными [38].
Заражение происходит во время родов, при прохождении ребенка по родовым путям и в послеродовом периоде, когда возбудитель передается новорожденному через слюну и молоко кормящих женщин. Высок риск заражения новорожденного при переливании крови [18,21,37,41,97].
Летальность при ЦМВИ составляет от 5 до 17,8% [32,39]. Максимальная летальность от ЦМВИ приходится на возраст 3-4 месяцев жизни [142]. По данным отечественных и зарубежных исследователей цитомегаловирусные клетки обнаруживаются в слюнных железах у 5-30% умерших новорожденных, а признаки генерализованной цитомегалии - у 5-15% новорожденных, умерших от различных причин, что свидетельствует о высокой частоте распространенности ЦМВИ [23,43,159].
ЦМВ - условно-патогенный возбудитель, необходимым условием для развития, вызываемого им заболевания является наличие первичного или вторичного иммунодефицита [17,26,172].
Как уже было описано вирус состоит из ядра, капсида, тегумента и поверхностных гликопротеинов. Белки, входящие в состав тегумента имеют две важные функции. Во-первых – разборка вириона во время входа и сборка вириона во время выхода из клетки [185]. Во-вторых – ингибирование иммунного ответа хозяина [66]. Белки, отвечающие за ускользание иммунного ответа упакованы внутри вириона и освобождаются только после проникновения вируса в клетку. Основным белком тегумента является рр65 [137]. Именно благодаря рр65 и другим матричным белкам (pp71, UL36, UL38 и IRS1/TRS1) иммунной системе человека долгое время не удается обнаружить ЦМВ внутри инфицированной клетки [110,158]. Так ген UL18 ЦМВ кодирует гомолог HLA I класса, а вирусный белок рр65 селективно подавляет образование антигенных пептидов [141,190]. Структурный вирусный белок рр65 (UL83), по данным литературы [64,84], также способен оказывать ингибирующее действие на индукцию и экспрессию антивирусных генов. Другой сверхранний вирусный белок IE86 способен эффективно блокировал индукцию IFN [212].
В ЦМВ-геноме найден гомолог клеточного IL-10 (по своему действию IL-10 относится к иммуносупрессивным лимфокинам). Установлено, что он подавляет ответ клеток на IFN и IFN, который играет ключевую роль в контроле экспрессии генов IFN и антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA), подавляет пролиферацию лимфоцитов и моноцитов и продукцию ими провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-6) [145,201].
Кроме того, описано свойство вирусных белков вызывать деградацию молекул МНС-1 класса и предотвращать тем самым нейтрализацию возбудителя специфическими антителами и Т-цитотоксическими клетками [33].
Активную роль в процессе ухода от иммунного ответа принимают вирусные белки IE, IE1 и IE2, которые помимо регуляции вирусной репликации способны подавлять апоптоз [226]. Сверхранние белки одни из первых синтезируются в инфицированной клетки и уже через 2 часа после проникновения вируса начинают контролировать экспрессию генов и синтез вирусных частиц [196].
Наиболее хорошо изучен гликопротеин В (gB) [81]. Доказано, что gB необходим для проникновения вируса в клетку и для передачи инфекционных частиц от инфицированной клетки к соседней, остальной каскад событий может происходить и при заражении клеток мутантным вирусом с делецией по гену UL55 [131]. Полагают, что взаимодействие gB с клеточной мембраной, является механизмом, при помощи которого вирус изменяет клеточную транскрипцию на ранних стадиях инфекции [193].
В ответ на продукцию матричных белков ЦМВ иммунная система активирует Т-клетки и NK-клетки, которые атакуют эти белки и инфицированные клетки. Клеточное звено иммунитета может воздействовать на все стадии вирусной репликации с подавлением сверхранних (IE), ранних (Е) и поздних (L) белков. За счет раннего подавления IE и Е белков, Т-клетки способны предотвратить реинфицирование и снизить вероятность длительной персистенции вируса [124]. На поверхности Т-клеток (СD4+ и CD8+) больше всего антигенов способных распознать структурный белок ЦМВ рр65. Но и другие белки не остаются без внимания gB, UL86, pp28, IE-2, UL36, UL48, pp10, UL113 и IRS-1 [208].
NK-клетки высвобождают IFN, который подавляет репликацию вируса [158]. Boehme с соавт. показали, что ЦМВ гликопротеины gB и gH активируют TLR2 на фибробластах, что приводит к активации NFkB и последующей воспалительной секреции цитокинов ответственных за защиту от ЦМВ [77].
Важную роль играет и гуморальное звено иммунитета. После инфицирования в сыворотке крови определяются антитела к ряду белков ЦМВ. Эти антитела распознают массив белков из разных частей вируса, в том числе рр65 и pp150, гликопротеины gB и gH, а также белки, участвующие в транскрипции, такие как IE-1 [83]. Большинство ЦМВ-серопозитивных людей имеют антитела, направленные против гликопротеина gB [83,116].
Современные подходы к лечению ЦМВИ у детей
Обследование детей, носило комплексный характер и включало в себя: клинический осмотр, лабораторные (клинические анализы крови и мочи, биохимические анализы крови), вирусологические, бактериологические, серологические и инструментальные методы исследования (УЗИ органов брюшной полости). У ряда больных, в зависимости от характера имеющейся соматической патологии, проводилась оценка электрокардиографии (ЭКГ), эхокардиографии (Эхо КГ).
Клинический анализ крови выполнялся повторно в ходе динамического наблюдения за больным и включал определение количественного содержания гемоглобина, эритроцитов, цветового показателя, лейкоцитов (с подсчетом лейкоцитарной формулы), атипичных мононуклеаров, тромбоцитов, скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Биохимический анализ крови проводился однократно, при необходимости – повторно, в динамике наблюдения за больным и включал определение содержания белка и его фракций, АСЛ-О, СPБ, уровня мочевины, креатинина, билирубина и его фракций, трансаминаз (АлАТ, АсАТ), амилазы, щелочной фосфатазы (ЩФ), – липопротеидов, электролитов. Биохимический анализ мочи на диастазу проводился детям с подозрением на панкреатит. Клинический анализ мочи выполнялся дважды (при поступлении ребенка в стационар и при выписке домой), при необходимости – чаще и заключался в оценке относительной плотности мочи, содержания белка, глюкозы, лейкоцитов, эритроцитов, цилиндров, солей. Выявлялись антитела к хламидийной и микоплазменной инфекции, вирусам гепатита В, С, ВИЧ в иммуноферментном анализе (ИФА).
В качестве клинических образцов для идентификации ЦМВ исследовали кровь, мочу и слюну. Цельную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. Затем стерильно отбирали фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. Фракцию лейкоцитов использовали в дальнейшем для проведения ЦМВ pp65 - антигенемии. Сыворотку крови использовали для определения антител IgM и IgG к ЦМВ методом ИФА. Мочу центрифугировали в тех же условиях. Слюна не подвергалась дополнительной обработке. Кровь, осадок мочи и слюну использовали для выявления ДНК ЦМВ методом Realime ПЦР. ЦМВ pp65 – антигенемия. Определение белка тегумента вириона рр65 методом ЦМВ рр65 – антигенемии в лаборатории НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (зав. профессор Кущ А.А.). ЦМВ рр65 – антигенемии представляет собой трудоемкую и не простую задачу. В методе можно выделить 4 основных этапа.
На первом этапе производилось центрифугирование цельной крови в течение 10 мин. при 1500 об./мин (“Joane”, Франция). Затем отбирали фракцию лейкоцитов (около 1,5 мл.), расположенную над эритроцитами. К фракции добавляли хлорид аммония по объему в 5 раз превышающий количество отобранных лейкоцитов и инкубировали в течение 10мин. при температуре +5С. Далее лейкоциты отмывались в 5мл. PBS.
Второй этап заключался в приготовлении лейкоцитарного мазка. Отмытые лейкоциты разводили в PBS до создания концентрации 2 х 106кл/мл (подсчет клеток проводился в камере Горяева). 100 мкл. полученной взвеси наносились на полилизиновые стекла и центрифугировали в течение 5 мин. при 500 об./мин. Влажные стекла помещали в холодный метанол на 15-20 мин.
Третий этап – фиксация лейкоцитарных мазков, производился с использованием NP-40 и эмбриональной телячьей сыворотки, HyClone (США), Biowest (Франция).
Четвертый этап – непрямое пероксидазное окрашивание с использованием моноклональных антител к белку рр65 (использовались моноклональные антитела к белку рр65 ЦМВ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, г. Москва). После отмывки в PBS на препараты наносили очищенные моноклональные антитела (МКА), специфичные к вирусному белку и инкубировали в течение 1 часа при 37 С. В качестве выявляющих антител использовали поликлональные кроличьи антимышиные иммуноглобулины (анти-мышиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ, Sigma (США), DАКО (Дания)), конъюгированные с пероксидазой хрена (DakoCytomation, Дания). Реакцию проявляли диаминобензидином (DAВ), Biosciences, США. Препараты окрашивались гематоксилином и анализировали с помощью флуоресцентного/ светового микроскопа OlympusBX-51(Япония), оснащенного объективами 4х, 10x, 40x и цифровой камерой OlympusU-CMAD3 (Япония) (Рис. 2,3,4).
Статистические методы анализа
Как видно из данных таблицы, в клинической картине у обследованных детей с маркерами активной ЦМВИ в 52,7% случаев отмечалось повышение температуры до 38,0-39,0, при этом длительность лихорадки в 78,9% случаев была более 5 дней (p.adjust=0.002, мощность=0,81). Длительность заболевания у детей с активной ЦМВИ в 63,2% случаев превышала 14 дней (p.adjust=0.003, мощность=0,78). Тяжесть состояния детей с пневмонией была обусловлена выраженной дыхательной недостаточностью (на долю ДН III ст. пришлось 52.7% случаев) и высокой лихорадкой. У некоторых больных, разрешение инфильтративных изменений в легких, наступало через месяц от начала заболевания. Следует так же отметить, что осложнения основного заболевания встречались у детей с активной ЦМВИ встречались чаще (47,4%, против 15%, p.adjust=0.02). У 4 из 19 диагностированы гнойно-воспалительные заболевания ЛОР-органов (отиты, синуситы), у 3 был обнаружен плеврит, у 2 – спаечная болезнь плевры, у 1 – абсцесс правого легкого, у 1 – ателектаз правого легкого. У одного ребенка в ходе обследования была обнаружена эхинококковая киста правого легкого, которая потребовала оперативного лечения.
В качестве примера приводим следующее клиническое наблюдение. Георгий М. 5 лет (история болезни № 18305) находившегося на обследовании и лечении в МДГКБ с 16.02.2013 по 14.03.2013. Поступил с диагнозом: «Двусторонняя полисегментарная плевропневмония, ДН II». Из анамнеза известно, что ребенок от 2 беременности. Роды 1 срочные, родился 3350г/52см. Рос и развивался нормально. Выписан из роддома на 4 сутки. На грудном вскармливании до 5 мес. Вакцинирован по возрасту. Аллергические реакции на лекарственные препараты, бытовые и пищевые аллергены – отрицает.
В конце января перенес ОРЗ, ринит. 08.02.13 появились жалобы на высокую температуру, кашель, снижение аппетита, боли в животе справа. 09.02.13 поступил в НИИ неотложной детской хирургии с подозрением на острый аппендицит, диагноз снят. Получал симптоматическую терапию с положительным эффектом. 14.02.13 вновь появился кашель, температура 39,5. В ночь на 16.02.13 в связи с ухудшением состояния (повышение температуры до 39,0, усилился кашель, нарастание симптомов интоксикации) осмотрен врачом скорой помощи, выставлен предварительный диагноз: «Правосторонняя нижнедолевая пневмония». Ребенок госпитализирован в МДГКБ.
При осмотре состояние тяжелое. Вялый. Аппетит снижен. Температура 38,5. Кожные покровы бледно-розовые, без инфекционной сыпи. Слизистая ротоглотки гиперемирована. Периферические лимфатические узлы: увеличены шейные и подмышечные лимфатические узлы 1,5 1,0см, при пальпации безболезненные. Тоны сердца ясные, шумов нет. Носовое дыхание затрудненно, серозное отделяемое. В легких при перкуссии слева звук с коробочным оттенком, справа укорочение звука. При аускультации дыхание жесткое, крупно-пузырчатые хрипы с обоих сторон, «шум трения плевры». Живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Стул и мочеиспускание не нарушены. Менингеальные симптомы отрицательные. На обзорной рентгенографии органов грудной клетки – на фоне деформированного легочного рисунка отмечаются полиморфные и мелкоочаговые инфильтративные тени, преимущественно в средних отделах правого легочного поля и по всему левому легочному полю. Корни легких расширены, инфильтративны и малоструктурны. Признаки плевропневмонии справа. КТ - органов грудной клетки (рис. 12) – изменения легочной ткани по типу «матового стекла», уплотнение ткани, утолщение стенок бронхиол, наличие очаговых и мелкофокусных изменений.
В общем анализе крови от 16.02.2013 - Hb – 121г/л, эр. -3,91012/л, тромб. -60810 9/л, лейк. – 29,110 9/л, лимф. -7%, п/я -32%, с/я -37%, эоз. – 22%. В биохимическом анализе крови СРБ -102 г/л, остальные показатели в пределах нормы.
По совокупности объективных данных у ребенка диагностирована: «Двусторонняя полисегментарная плевропневмония, ДН-IIст.». На фоне проводимой антибактериальной терапии состояние незначительно улучшилось, но продолжало оставаться тяжёлым. В общем анализе крови сохранялся лейкоцитоз до 28,610 9/л, лимф. -16%, п/я -3%, с/я -10%, эоз. – 70%. В ходе до обследования обнаружены антитела класса IgM к цитомегаловирусу методом ИФА и ДНК цитомегаловируса в слюне (2000 коп/мл), крови (3200 коп/мл) методом ПЦР. В лейкоцитах крови определялся структурный белок цитомегаловируса рр65. При этом маркеры вирусного гепатита А, В, С, токсоплазмоза, антитела к микоплазме, хламидии, вирусу простого герпеса I/II типа, Эпштейн – Бар, герпес вирусу человека 6 типа не были обнаружены.
Учитывая наличие маркеров активной ЦМВ инфекции к терапии добавлен неоцитотект. После 3х доз препарата состояние улучшилось, температура 38,5С-37,0С, в общем анализе крови: лейк. -7,810 9/л, лимф. -29%, п/я -5%, с/я -56%, эоз. – 1%. После завершения курса лечения ребенок выписан.
Как мы видим из данного клинического примера для пневмонии, протекающей на фоне активной ЦМВИ характерно длительное течение с постепенным нарастанием тяжести заболевания. При несвоевременной постановке этиологического диагноза, отсутствии этиотропной терапии и присоединении бактериальной инфекции, возможно развитие симптомов дыхательной недостаточности, нарастающего респираторного дистресс-синдрома с высокой вероятностью летального исхода. Резюмируя вышеизложенное можно сказать, что у детей с заболеваниями нижних отделов респираторного тракта в 79,2% случаев выявлялись маркеры активной ЦМВИ, что подтверждалась обнаружением ДНК ЦМВ (58,5%) и/или анти-CMV IgM (33,4%). При этом суммарная вирусная нагрузка составила 3,5±0,37 log10 копий/мл. У всех обследованных детей эпизоды ОРЗ повторялись от 8 до 10 раз в год, отмечалось затяжное течение ОРЗ с развитием различных осложнений.
Нами были выделены следующие клинические особенности ЦМВИ у детей с заболеваниями нижних отделов респираторного тракта: длительность заболевания у детей, инфицированных ЦМВИ в 63,2% случаев была более 7 дней; заболевание чаще сопровождалось гипертермией от 38,5 и выше (89,5%), а длительность лихорадки превышала 5 дней (78,9%); частота развития осложнений была в 2 раза выше, чем у детей без маркеров ЦМВИ (23,1%, против 7,6%).
Клинические особенности течения соматических заболеваний у детей на фоне активной ЦМВИ
Примером активной персистенции ЦМВИ у детей с поражением ЛОР органов может служить следующее клиническое наблюдение.
Алексей Н. 3года 4мес. (история болезни № 45697-13С). Находился на обследовании и лечении в МДГКБ с 21.10.2013 по30.10.2013. Поступил с диагнозом: «Двусторонний острый средний гнойный отит».
Из анамнеза известно, что ребенок от 2 беременности. Роды 1 срочные, родился 3200г/50см. Рос и развивался нормально. Выписан из роддома на 4 сутки. Привит согласно календарю профилактических прививок. Аллергические реакции на лекарственные препараты, бытовые и пищевые аллергены – отрицает. За последний год отмечались 8 эпизодов ОРЗ. Мальчик перенес 4 эпизода гнойных отитов в течение года, лечение которых проводилось в условиях поликлиники с наложением парацентеза и проведением антибактериальной терапии. Так же следует отметить, что в 2 года ребенок перенес инфекционный мононуклеоз (ЭБВ и ЦМВ этиологии).
Ребенок поступил с жалобами на резкую ушную боль, повышение температуры тела до 39,0, насморк.
Анамнез заболевания: с 19.10.2013 у ребенка появился насморк, повышение температуры до 38,0. 20.10.2013 появилась резкая ушная боль.21.10.13 был госпитализирован в МДГКБ. При осмотре: состояние средней тяжести. Температура тела 39,0. Кожные покровы бледно-розовые, без инфекционной сыпи. Слизистая оболочка полости рта розовая, чистая. Небные миндалины I степени, без наложений и патологического отделяемого в лакунах. Задняя стенка глотки розовая, чистая. Носовое дыхание умеренно затруднено. Слизистая оболочка полости носа розовая, умеренно отечная, в общих носовых ходах – слизисто-гнойное отделяемое, средние носовые ходы – свободные. Заушные области визуально не изменены, безболезненны при перкуссии и пальпации. Слуховые проходы широкие, свободные. Барабанные перепонки гиперемированы, инфильтрированы, выбухают (рис.19,20). Периферические лимфатические узлы: увеличены тонзиллярные и шейные лимфатические узлы 1,5 1,5см, при пальпации безболезненные. Тоны сердца ясные, шумов нет. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Живот мягкий, при пальпации безболезненный. Стул и мочеиспускание не нарушены. Менингеальные симптомы отрицательные.
Отоскопическая картина пациента Н. 21.10.13 (правое ухо) Микробиологическое исследование отделяемого из ушей от 21.10.2013, полученного при парацентезе: Streptococcus pneumonia массивный рост. В отделении ребенку проводилось следующее лечение: Цефтриаксон 600 х 2 раза в день внутримышечно 10 дней, Супрастин 0,2 х 2 раза в день внутримышечно, анемизация общих носовых ходов 0.025 % Називином, ежедневное промывание слуховых проходов раствором Хлоргексидина, в уши Отофа по 4 кап х 3 раза в день.
На фоне проводимого лечения отмечалась незначительная положительная динамика, сохранялась лихорадка, шейный лимфаденит, выраженное нарушение носового дыхания, длительное гноетечение из уха (7 дней).
Учитывая выше изложенное, ребенок был дообследован. Методом ИФА в сыворотке крови выявлены антитела к ЭБВ IgG ядерный 180,4; IgM и IgG ЦМВ 154,5. Методом ПЦР ДНК ЭБВ в крови, слюне и моче не выявлялась. ДНК ЦМВ в моче 225900 коп/мл, слюне 576100 коп/мл и крови 84200 коп/мл. В лейкоцитах периферической крови методом ЦМВ рр65антигенемии выявлен ранний антиген ЦМВ. По совокупности объективных данных у ребенка диагностирован: «Двусторонний рецидивирующий средний гнойный отит. Острая цитомегаловирусная инфекция» . Ребенку была назначена противовирусная терапия (ацикловир 20мг/кг/сут в/в кап. на 7 дней) и иммуноглобулин (неоцитотект 2 мг/кг/сут). При повторном осмотре через 2 недели после проведенного оперативного вмешательства отмечена нормализация отоскопической картины (бледно-серый цвет барабанных перепонок, четкость всех опознавательных контуров), зарегистрирована тимпанограмма типа «А», акустические рефлексы стременной мышцы регистрировались.
При повторном обследовании через 2 мес. Антитела класса IgM к ЦМВ не определялись. Методом ЦМВ рр65антигенемии ранний антиген к ЦМВ не обнаружен. ДНК ЦМВ методом ПЦР в 3х средах не выявлено. При катамнестическом наблюдении через 1 год эпизоды отита у ребенка не повторялись. Таким образом, особенностью данного клинического примера является развитие у ребенка рецидивирующего среднего гнойного отита на фоне активной ЦМВ-инфекции. Можно отметить, что у детей цитомегаловирус в активной стадии может являться причиной формирования затяжного течения отита, что подтверждается результатами клинико-лабораторного обследования, в том числе обнаружение ДНК ЦМВ методом ПЦР, антител вируса методом ИФА и структурного антигена ЦМВ рр65.
Резюмируя вышеизложенное можно сказать, что у детей с заболеваниями ЛОР-органов в 88,9% случаев выявлялись маркеры активной ЦМВИ, что подтверждалась обнаружением ДНК ЦМВ (88,8%) и/или анти-CMV IgM (22,2%). При этом суммарная вирусная нагрузка ДНК ЦМВ составила 3,6±0,59 log10 копий/мл.
Нами были установлены следующие клинические особенности течения ЦМВИ у детей с ЛОР патологией: как и в предыдущих группах обращает на себя внимание преобладание высокой лихорадки, более 5-7 дней и длительное течение заболевание вплоть до 14 дней; выраженная оталгия (62,5%), а также спонтанное гноетечение из уха выявленное у 4х детей; у детей с выраженным затруднением носового дыхания наряду с ЦМВ выявлялся и ЭБВ.