Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .13
1.1. Условно-патогенные энтеробактерии и их роль в развитии острых кишечных инфекций.. 13
1.2. Факторы патогенности энтеробактерий, и их роль в развитии диареи
1.3. Роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе острых кишечных инфекций 27
1.4. Молекулярно-генетические методы, применяемые в диагностике инфекционных заболеваний .29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1 Общий дизайн исследования 33
2.2 Принципы формирования и общая характеристика групп больных 35
2.3 Характеристика методов исследований 37
2.3.1. Индикация и идентификация условно-патогенных энтеробактерий...37
2.3.2. Реакция агглютинации с аутоштаммом выделенного микроорганизма .38
2.3.3. Выделение бактериальной ДНК .40
2.3.4. Амплификация участков ДНК фрагментов генов «островов» патогенности методом полимеразной цепной реакции .41
2.3.5. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 42
2.3.6. Определение факторов патогенности и персистенции условно патогенных Enterobacteriaceae молекулярно-генетическими методами... 43
2.3.7. Амплификация участков ДНК, кодирующих факторы патогенности условно-патогенных энтеробактерий 45
2.3.8. Определение основных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в крови динамике заболевания 48
2.4 Статистическая обработка материала 49
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторная характеристика больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно-патогенными энтеробактериями .52
3.1 Общая клиническая характеристика больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно-патогенными энтеробактериями .52
3.2. Клинико-лабораторная характеристика больных острыми кишечными инфекциями, ассоциируемыми отдельными видами условно-патогенных энтеробактерий 56
3.3. Клинико-лабораторная характеристика больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно-патогенными энтеробактериями, в зависимости от степени тяжести заболевания 65
3.4. Анализ показателей периферической крови больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно-патогенными энтеробактериями, в динамике болезни 69
3.5. Терапия острых кишечных инфекций, сопровождавшихся высевом условно-патогенных энтеробактерий 74
ГЛАВА 4. Генетические маркеры патогенности условно патогенных энтеробактерий, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями .76
4.1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов острыми кишечными инфекциями с выделением ДНК у штаммов условно-патогенных энтеробактерий .76
4.2. Фрагменты генов «островов» патогенности, ассоциируемые с патогенностью E.coli, у штаммов условно-патогенных энтеробактерий,выделенных от взрослых больных острыми кишечными инфекциями .79
4.3. Взаимосвязь наличия фрагментов генов «островов» патогенности у выделенных штаммов возбудителя и клинических проявлений острых кишечных инфекций условно-патогенных энтеробактерий .83
ГЛАВА 5. Цитокиновый профиль больных острыми кишечными инфекциями, вызванными условно патогенными энтеробактериями 92
5.1 Показатели цитокинового профиля у больных с острыми кишечными инфекциями, coпровождавшимися выделением условно-патогенных энтеробактерий 92
5.2. Анализ корреляционных связей между уровнем различных цитокинов в сыворотке крови при острых кишечных инфекциях, вызванных условно-патогенными энтеробактериями 95
5.3 Анализ взаимосвязей между концентрацией цитокинов в сыворотке крови и клинико-лабораторными проявлениями острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями .98
Обсуждение результатов .105
Заключение .118
Выводы .120
Практические рекомендации .121
Перечень условных обозначений (сокращений) 122
Список литературы
- Факторы патогенности энтеробактерий, и их роль в развитии диареи
- Реакция агглютинации с аутоштаммом выделенного микроорганизма
- Клинико-лабораторная характеристика больных острыми кишечными инфекциями, ассоциируемыми отдельными видами условно-патогенных энтеробактерий
- Фрагменты генов «островов» патогенности, ассоциируемые с патогенностью E.coli, у штаммов условно-патогенных энтеробактерий,выделенных от взрослых больных острыми кишечными инфекциями
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В структуре инфекционной патологии на территории Российской Федерации (РФ) второе место после острых респираторных вирусных инфекций занимают диарейные заболевания. По данным Федерального Центра Госсанэпиднадзора в РФ около 1 млн. человек ежегодно страдают от острых кишечных инфекций (ОКИ), заболеваемость которыми за последние 5 лет составила 500,2-522,3 случаев на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению. При этом остается высокой доля ОКИ невыясненной этиологии - более 60%. Следует отметить, что среди ОКИ установленной этиологии в последние годы прослеживается возрастание уровня вирусных диарей (до 60%) (Резник В.И. и др., 2011). В то же время эпидемиологическая роль условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ) при ОКИ не снижается (Подколзин А.Т., 2004; Малов В.А. и др., 2005; Жеребцова Н.Ю., 2007; Бондаренко В.М., 2011). В 2016 году доля острых диарей, ассоциируемых с УПЭ, по РФ в целом составила 9,5%, в отдельных субъектах колебалась от 5% до 29,3%.
Вопрос об этиологической значимости УПЭ при ОКИ остается неоднозначным. Поскольку вероятность развития кишечной инфекции определяется не только фактом выделения и количественной оценкой УПЭ, но и, не в меньшей степени, патогенным потенциалом возбудителя (Бондаренко В.М., 2011). Более того, во всем мире констатируются новые инфекционные угрозы, связываемые с представителями нормальной микробиоты человека (Struve C. et al., 2015).
Степень разработанности темы исследования
В последние годы появилось много работ, авторы которых аргументируют
существование конкретных генетически обусловленных механизмов изменения
патогенности энтеробактерий (Dautin N., 2010; Ruiz-Perez F. et al., 2014; Carraro N. et
al., 2017), в том числе связанных с циркуляцией между клиническими штаммами
бактерий мобильных генетических элементов, ответственных за синтез различных
факторов вирулентности, обеспечивающих микроорганизмам селективное
преимущество и конкурентоспособность, способствующих эволюции условно-патогенных видов и селекции патогенных вариантов (Мавзютов А.Р. и др., 2002; Silva L.E.P. et al., 2014; Struve C. et al., 2015; Xu Y. et al., 2017). В этой связи активно разрабатываются новые методы оценки этиологической значимости клинических штаммов энтеробактерий, основанные на высокоспецифичной детекции генетических детерминант патогенности с помощью молекулярно-генетических методов (ПЦР), поскольку они отличаются более высокой стабильностью (Slinger R. et al., 2017).
На уровне макроорганизма патогенез ОКИ реализуется при участии провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, определяющих варианты иммунного ответа, специфику функционально-морфологических изменений, определяющих особенности течения и степень тяжести заболевания (O’Ryan M., 2015; Ebisawa М. et al, 2017).
В связи с этим актуальным представляется комплексное обследование больных ОКИ, вызванными УПЭ, обнаружением фрагментов генов «островов патогенности» (ФГОП) и маркеров системного воспалительного ответа для объективной оценки этиологической значимости изолятов энтеробактерий и степени тяжести заболевания.
Цель исследования установить наличие и частоту встречаемости фрагментов генов «островов патогенности» у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий и особенности ответной реакции системы цитокинов при острых кишечных инфекциях у взрослых для обоснования новых комплексных критериев оценки тяжести и прогноза заболевания.
Задачи исследования
1. Провести анализ клинического течения ОКИ, вызванных УПЭ, в
зависимости от этиологической структуры и степени тяжести заболевания.
2. Установить частоту встречаемости у штаммов УПЭ, выделенных от больных
ОКИ, фрагментов генов «островов» патогенности, ассоциируемых с патогенностью Е.
coli (гены, кодирующие -гемолизины - ЫуА, ЫуВ, hlyD, цитолетальный энтеротоксин
- cdtB, адгезин-интимин - еае, фактор персистенции - ivy).
-
Определить уровень провоспалительных (ИЛ-1(3, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10) в системном кровотоке больных ОКИ, вызванными УПЭ, с учетом степени тяжести и динамики болезни.
-
Провести клинико-лабораторные параллели в двух группах пациентов ОКИ между наличием и частотой обнаружения ФГОП {ЫуА, ЫуВ, hlyD, cdtB, еае, ivy) в геноме клинических штаммов УПЭ (1-я группа) и их отсутствием (2-я группа).
Научная новизна работы
У 39,84% клинических штаммов УПЭ (K.pneumoniaе, Enterobacter spp., Proteus spp.), выделенных от больных ОКИ, выявлены ФГОП, ассоциируемые с патогенностью E.coli. Установлено, что частота обнаружения ФГОП, определяющих продукцию гемолизинов (ЫуА, ЫуВ, hlyD), цитолетального токсина (cdtB), интимина (еае) и фактора персистенции (ivy), коррелирует с тяжестью течения заболевания (i=0,41; р<0,001). Выявлены взаимосвязи между частотой обнаружения генетических
детерминант патогенности у клинических штаммов УПЭ и основными клинико-лабораторными симптомами ОКИ, ассоциируемых с ними.
Определены статистически значимо высокие уровни провоспалительных (ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови пациентов ОКИ, вызванных УПЭ, установлены взаимосвязи между степенью тяжести болезни и показателями исследуемых цитокинов.
Теоретическая и практическая значимость
Показано, что наличие фрагментов генов «островов» патогенности: ЫуА, ЫуВ и hlyD, cdtB, еае и ivy у условно-патогенных Enterobacteriaceae является маркером вирулентности и может использоваться для оценки in vitro этиологической значимости клинических штаммов УПЭ. Установленные взаимосвязи между частотой обнаружения ФГОП, ассоциированных с патогенностью Е.соїі, у клинических штаммов УПЭ и тяжестью течения, основными клинико-лабораторными симптомами ОКИ могут быть использованы в качестве дополнительных критериев оценки степени тяжести и прогноза заболевания.
Показанные изменения цитокинового профиля у пациентов с кишечными инфекциями, ассоциированными УПЭ, свидетельствуют о развитии системной воспалительной реакции. Выявленные корреляции между уровнями сывороточных цитокинов и основными клиническими симптомами болезни указывают на степень тяжести заболевания и определяются вирулентностью клинических штаммов условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Наиболее распространенными УПЭ, при ОКИ у взрослых, являются представители родов Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp.
-
У клинических штаммов УПЭ (K.pneumoniaе, E.aerogenes, Proteus spp.) в 39,8% случаев обнаруживаются ФГОП, ассоциируемые с патогенностью Е.соїі (гены, ответственные за продукцию -гемолизинов - ЫуА, ЫуВ, hlyD, цитолетального энтеротоксина - cdtB, адгезин-интимина - еае, фактора персистенции - ivy).
-
Обнаружение генетических детерминант патогенности (ЫуА, ЫуВ, hlyD, ivy, cdtB, еае), ассоциируемых с патогенностью Е.соїі, в геноме клинических штаммов УПЭ свидетельствует о вирулентности выделенных изолятов энтеробактерий и подтверждаются положительными корреляционными взаимосвязями по указанному признаку с тяжестью течения и клиническими проявлениями ОКИ у взрослых.
-
У пациентов ОКИ, ассоциированными с УПЭ, развивается системная воспалительная реакция, сопровождающаяся повышением уровня сывороточных
цитокинов, выявленные взаимосвязи между основными симптомами болезни и показателями медиаторов воспаления могут быть использованы для дополнительной оценки степени тяжести заболевания.
Методология и методы исследования
В диссертационной работе использована методология научного познания,
включающая системный подход, основанный на методах доказательной медицины. В
соответствии с поставленной целью и задачами разработан план сравнительного
открытого исследования всех этапов диссертационной работы; с применением
клинических, бактериологических, бактериоскопических, серологических,
молекулярно-генетических, инструментальных, клинико-статистических методов.
Математическая обработка данных проводилась параметрическими и
непараметрическими методами с применением современных программных пакетов математико-статистического анализа.
Степень достоверности и апробация работы
Степень достоверности полученных результатов определяется дoстатoчным
объемом наблюдений, соблюдением критериев включения и исключения из
исследования, использованием современных методов исследования, применением
современных методов обработки данных и статистического анализа.
Сформулированные положения, выводы и практические рекомендации
аргументированы, являются результатом тщательного анализа полученных данных.
Основные положения диссертации доложены на ХV Российской научно-практической конференции (Махачкала, 2010); Республиканской научно -практической конференции, посвящённой 100 - летию муниципального учреждения инфекционной клинической больницы № 4 г. Уфы (Уфа, 2010), на I, III, IV, V, VI, VII, VIII Всероссийском Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2011, 2012, 2013, 2014, 1015, 2016). Работа апробирована на межкафедральном совещании сотрудников кафедры инфекционных болезней с курсом ИДПО, лабораторной диагностики ИДПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ФГБОУ ВО Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Данные, полученные в результате проведённых исследований, дополняют знания о возбудителях ОКИ, вызванных УПЭ, и патогенезе вызываемых ими заболеваний.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно проведен информационный поиск, анализ литературы по теме диссертации, определены цель и задачи, методы научно-исследовательской работы. Диссертант непосредственно участвовал в выполнении всех разделов работы (литературный обзор, сбор материала, формирование групп исследования, лабораторные исследования, лабораторная обработка полученных образцов, статистическая обработка и анализ полученных данных). Самостоятельно описаны результаты собственных исследований и обсуждений, сформулированы выводы, практические рекомендации, положения, выносимые на защиту. Диссертанту принадлежит основная роль в написании научных статей, которые опубликованы в соавторстве.
Внедрение результатов в практику
Результаты исследований внедрены в работу инфекционной клинической
больницы (ИКБ) № 4 г. Уфы, используются в педагогическом процессе кафедр
инфекционных болезней с курсом ИДПО, лабораторной диагностики ИДПО,
фундаментальной и прикладной микробиологии Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения Башкирский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.09 – инфекционные болезни. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 3 паспорта специальности инфекционные болезни.
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 – микробиология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта специальности
Публикации
По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура и диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, отраженных в 5 главах, главы обсуждения полученных материалов, выводов, списка использованных источников литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 11 рисунков. Список литературы включает 199 источников: 79 отечественных и 120 зарубежных авторов.
Факторы патогенности энтеробактерий, и их роль в развитии диареи
В настоящее время полагают, что мутационный механизм эволюционно ассоциируется с медленными изменениями адаптации.
Существенным для изменения патогенности УПЭ являются генетические рекомбинации, определяющие пластичность генов, реализуя через конкретные механизмы, связанные с «островами» и «островками» патогенности [4, 34, 41, 92].
Нестабильность и стабильность «островов» способны создать бактериям дополнительные адаптивные преимущества. Нестабильность «островов патогенности» способствует координированному регулированию вирулентности всей популяции возбудителя инфекции. Делеция «островов патогенности» могут привести к усилению экспрессии других, рядом расположенных генов [192, 196]. С другой стороны, отдельные факторы вирулентности являются адаптивными для бактерий. По этой причине они должны кодироваться на стабильных «островах патогенности». Чужеродная ДНК, интегрировавшаяся с хромосомой, не вовлекается в рекомбинацию с ДНК близкородственных микроорганизмов, поэтому она может длительно поддерживаться в бактериальных популяциях [117]. «Острова» патогенности – ДНК фрагмeнты размерами: от 1-10 kb – островки, от 10-20 до 200 kb - острова, соответственно, включают гены вирулентности и обнаруживаются лишь у патогенных микроорганизмов [9, 24, 162]. «Оcтрова» патогенности характеризуются следующим [4, 162]: 1. Несут гены, которые контролируют синтез инвазинов и адгезинoв, токсинов, белков III типа секреции; 2. Встречаются отдельно, либо отсутствуют у непатогенных видов; но присутствуют у патогенных; 3. По процентному содержанию гуанин+цитозин (Г+Ц) имеет отличие от хромосомы бактерии; 4. Захватывает огромные хромосомные области (около 30 Кбит); 5. Между повторами ДНК расположены сжатыми генетическими единицами; 6. Связь с генами тРНК; 7. Гены мобильности, которые кодируют IS элементы, интегразы, транспозоны, плазмиды; 8. Бывают нестабильны. Известны также нуклеотидные последовательности большинства генов патогенности энтеробактерий, которые доступны в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov.), что позволяет, в свою очередь, свободно подбирать праймеры для ПЦР-диагностики.
В первую очередь, к факторам патогенности относят белки, обеспечивающие взаимодействие бактерий с кишечным эпителием.
Как стало известно в последнее время, адгезия бактерий не является простым взаимодействием лиганд-структур с рецепторами клеток-мишеней хозяина. Взаимодействие клетки хозяина и патогена может привести к активации сигнальных систем клеток непосредственно бактериальным компонентом или через стимуляцию воспалительных цитокинов.
Известно, что кишечные энтеропатогенные палочки (ЕРЕС) секретируют белки, активирующие внутриклеточный сигнальный путь, включают фосфорилирование одного из белков клетки-хозяина - Нр90, после чего становится возможной адгезия бактерии к поверхности клетки. Тирoзин-фосфoрилированная форма Нр90 является тем рецептором, с которым взаимодействует адгезин ЕРЕС - наружный мембранный белок интимин (94 кд), кодируемый еае-геном. Адгезины энтеробактерий обычно собраны в пили, которые расположены на поверхности клетки [80]. Известны также нефимбриальные адгезины: липотейхоевые кислоты, липополисахариды наружной клеточной стенки и капсульные полисахариды и другие [187, 196]. Необходимо отметить, что более эффективную адгезию обеспечивают фимбриальные адгезины, чем афимбриальные [191].
Cоставляющей вирулентности семейства Enterobacteriaceae являются пили I типа, Р пили, и S пили, кодируются они, соответственно, fim, pар и sfa генами [46, 53, 116, 176]. У E.coli обнаружены только CFA пили, расположенные на плазмидах рядом с tox генами [46]. Также E.coli имеет островок патогенности LEE, который включает в себя несколько генов патогенности- eae (интимин), esps и tir[123, 132]. Важно отметить, что аналогичный фактор адгезии еае обнаруживаются и у других УПЭ – Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii и Hafnia alvei [95, 121, 147].
Функции адгезии, толчкообразования, подвижности, абсорбции бактериофагов, клеточную инвазию, модуляцию клеток мишеней, формирование биопленок, перенос генов выполняют пили IV типа. Они обнаружены у EPEC, Pseudomonаs aeruginosa, Moraxella bovis, Vibrio cholere, патогенных Neisseria [59, 138, 187].
Начальным этапом инвазии у патогенных микроорганизмов является прикрепление к поверхности эпителия, при этом инвазивные энтеробактерии в качестве рецепторов используют интегрины эпителиоцитов кишечника.
После прикрепления и успешной колонизации кишечника, для микроорганизма следующей проблемой становится обеспечение устойчивости к многочисленным факторам защиты организма хозяина и поддержание достаточного уровня размножения [6, 91]. Это, в первую очередь, различные антигены у энтеробактерий (О, К и Vi). У Klebsiella spp., к примеру, имеется мукоид и полисахаридная капсула, IgA-протеазы. Защитные белки наружной мембраны многообразны, среди которых выделяют те, которые обеспечивают передвижение бактерий. Например, Shigella имеет такой фактор, который кодируется геном патогенности icsA.
Среди белков наружной мембраны у Salmonella typhimurium выделяют секретивные белки, являющиеся также факторами вирулентности: SipA, SipB, SipC и InvJ [198]. У Сitrobacter rodentium обнаружены такие же белки, кодируемые генами EspA, EspB, и EspD [95, 147, 149].
Устойчивость микроорганизмов обеспечивается также за счет факторов персистенции, так, например, E.coli и другие энтеробактерии имеют фактор ivy, ингибирующий лизоцим, тем самым патоген свободно может существовать в ЖКТ хозяина, долго оставаясь необнаруженным защитными системами [68]. Кроме того, практически все энтеробактерии и, в частности, представители рода Klebsiella spp. имеют высокую адгезивную способность и способность формировать биопленки, за счет чего могут длительно персистировать в кишечнике [85]. В биопленках микроорганизмы формируют устойчивые как к защитным механизмам хозяина, так и к лекарственной терапии сообщества, состоящие из различных видов и активно обменивающихся между собой генетической информацией. Также необходимо иметь в виду, что, если даже микроорганизмы в чистой культуре не устойчивы к какому-либо антибиотику, это еще не означает, что они будут к нему чувствительны в биопленках [49, 59].
Реакция агглютинации с аутоштаммом выделенного микроорганизма
Из суточной агаровой культуры выделяли бактериальную ДНК, применив стандартные наборы («ДНК-сорб-АМ», Россия) сорбционным методом с применением силикагеля (SiO2) в присутствии 4-6 М гуанидинтиоционата.
В одноразовые пробирки добавляли по 300 мкл лизирующего раствора (5М гуанидинтиоционат, 1% Triton X100). Далее маркировали пробирки. В пробирки с лизирующим раствором вносили необходимое количество клеток исследуемых микроорганизмов. Пробы перемешивали тщательно на вортексе и прогревали при температуре 65С 5 мин. Центрифугировали при 5 тыс. об/мин 5 сек на микроцентрифуге. Когда проба растворялась не полностью, пробирку центрифугировали на микроцентрифуге при 12 тыс. об/мин 5 мин и перенеся ее в новую пробирку использовали надосадочную жидкость для выделения ДНК. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляли по 25 мкл ресуспендированного сорбента (силикагель) и перемешивали на вортексе. Затем пробирки ставили в штатив на 2 мин, еще раз перемешивали и оставляли на 5 мин в штативе. Далее в пробирках сорбент осаждали центрифугированием в течение 30 сек при 5 тыс. об/мин. Потом удаляли надосадочную жидкость, используя для каждой пробы отдельный наконечник и вакуумный отсасыватель. В пробы добавляли для отмывки (5М гуанидинтиоционат) 300 мкл раствора, затем перемешивали на вортексе для полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждали при помощи центрифугирования на микроцентрифуге в течение 30 сек при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляли с помощью вакуумного отсасывателя, и добавляли в неё раствор для отмывки (этиловый спирт 70%) по 950 мкл. До ресуспендирования сорбента, перемешивали на вортексе, центрифугировали 30 сек на микроцентрифуге при 10 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удаляли так же, как описано выше. Пробирки помещали в термостат при температуре 65С для подсушивания сорбента на 5-10 мин. Крышки пробирок при этом были открыты. Для элюции ДНК в пробирки добавляли по 50 мкл ТЕ-буфера и перемешивали на вортексе. Далее инкубировали в термостате в течение 5 мин при температуре 65С, встряхивая на вортексе. В течении 1 мин. на микроцентрифуге пробирки центрифугировали при 12 тыс. об/мин. Для ПЦР использовали супернатант с очищенной ДНК.
Метод ПЦР использовали для избирательной амплификации определенных участков ДНК in vitro. В зависимости от цели эксперимента объем смеси для ПЦР колебался от 20 до 100 мкл. Для аналитической ПЦР использовали объем 30 мкл, которая содержала 1 мкл геномной ДНК (100 нг/мкл) и 3 мкл 10-кратного буфера для Taq – полимеразы, поставляемый в наборе с используемым ферментом, по 3 мкл dNTP, 1мкл каждого праймера и 1 мкл Taq–полимеразы. Для избежания испарения жидкости наслаивали 50 мкл минерального масла на поверхность каждой реакционной смеси. ПЦР проводили в амплификаторе МС–16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). На первом этапе при 94С проводили денатурацию ДНК, после этого следовали 25-30 циклов амплификации, из которых каждый включал стадию денатурации ДНК при 94С в течение 40 сек, стадию отжига праймеров длительностью 1 мин 30 сек при температуре от 54 до 72С и стадию элонгации при 72С в течение 1 мин 30 сек, оптимальной для Taq– полимеразы. В определенных случаях для оптимизации ПЦР и уменьшения количества неспецифичных продуктов амплификации использовался «горячий старт». По этой процедуре попадание Taq–полимеразы, разбавленной в 10 мкл соответствующего 1-кратного буфера, в реакционную смесь осуществлялось лишь после нагрева последней до 94С, это исключало возможность неспецифичного отжига праймеров на нуклеотидных последовательностях с низкой гомологией. Количество и качество и амплифицированных фрагментов ДНК определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. После окончания электрофореза гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали на фотодокументационной системе Gel Camera System (UVP, Inc. США).
Порошок агарозы (1 грамм) добавляли в отмеренный объем э/ф буфера (2 мл 50х TAE буфера и 100 мл очищенной воды). Нагревали смесь в микроволновой печи до полного расплавления гели (2-2,5 мин). Раствор остужали до 50С. В заливочную камеру помещали чисто вымытую стеклянную пластинку. Края камеры обрабатывали остывающей агарозой во избежание дальнейшего вытекания агарозы из камеры. На одном из краев камеры устанавливали пластиковый гребешок так, чтобы его зубцы образовали в геле лунки для проб ДНК. Аккуратно заливали в форму теплый раствор агарозы толщиной не более 5-6-мм. Приготавливали 1 л 1-кратного буфера ТАЕ. После полного затвердения агарозы (15-20 мин) аккуратно вынимали гребенку, стараясь не повредить образовавшиеся кармашки. Пластинку с гелем из камеры помещали в электрофоретическую камеру. Заливали в камеру буфер так, что он покрывал агарозу сверху тонким слоем 2-3 мм.
Отбирали 15 мкл раствора ДНК из эппендорфа на пластинку для нанесения проб. Добавляли 3 мкл красителя бромфенолового синего с ксиленцианолом и глицерином. Перемешивали пипеткой. Медленно наносили автоматической пипеткой пробу ДНК с красителем в лунку геля под слой буфера. Подключали клеммы прибора к источнику питания так, чтобы (-) находился на старте, а (+) - на финише. Включали источник питания и устанавливали напряжение в 100 вольт. Проводили разделение ДНК в течение 30-40 мин. Вынимали пластинку с гелем и помещали ее в кювету для окрашивания. Наливали в кювету слабый раствор бромистого этидия. Окрашивали в течение 10-15 мин. Промывали гель проточной водой. Помещали его на стекло трансиллюминатора. Фотографировали гель на фотосистеме Gel Camera System (UVP, Inc. США).
Клинико-лабораторная характеристика больных острыми кишечными инфекциями, ассоциируемыми отдельными видами условно-патогенных энтеробактерий
Продолжительность лечения была более длительной при тяжелой форме ОКИ и составила 14,1±0,26 дней, при среднетяжелой и лёгкой форме болезни – 9,9±0,64 (р 0,001) и 7,0±0,31 суток (р 0,001), соответственно.
У обследованных больных с ОКИ, сопровождавшихся высевом УПЭ, в течение заболевания не выявлены какие-либо специфические осложнения.
Выявленные корреляционные взаимосвязи между симптомами интоксикации и поражения желудочно-кишечного тракта, по-видимому, обусловлены общностью патогенеза заболевания и свидетельствуют об их взаимосвязанности и взаимозависимости.
Таким образом, сравнительный анализ основных клинических проявлений ОКИ, вызванных УПЭ, различной степени тяжести без учета вида возбудителя, выявил прямую зависимость от степени тяжести и выраженности клинических симптомов заболевания.
Анализ показателей периферической крови больных острыми кишечными инфекциями, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, в динамике болезни Изменения в анализах крови у исследуемых пациентов находятся в прямой зависимости от степени тяжести ОКИ, сопровождавшихся выделением УПЭ. В остром периоде заболевания в периферической крови на фоне патологических потерь жидкости регистрировалось повышение содержания гемоглобина и эритроцитов, которое зависело от тяжести течения инфекции и отражало степень эксикоза и гемоконцентрации (таблица 17).
При анализе внутригрупповой динамики показателей крови обследованных выявлено следующее (таблица 17). В группе больных с легкой формой ОКИ показатели эритроцитов в крови статистически значимо возросли в динамике болезни в сравнении их с значениями практически здоровых лиц, составив 4,0 (3,7–4,0) при поступлении и 4,0 (4,0–4,3) при выписке, р=0,037. Однако в сравнении с уровнем контрольной группы (4,5 (4,3–4,8) показатели эритроцитов в крови оказались достоверно ниже: при поступлении (р=0,001), и при выписке из стационара (р=0,018).
В группе больных со среднетяжелой формой ОКИ выявлено достоверное снижение количества эритроцитов в крови на протяжении заболевания с 4,0 до (4,0–4,1) до 4,0 (3,1–4,0), р=0,001, причем оба показателя оказались достоверно ниже значений нормы (р=0,001 и р=0,001).
При тяжелом течении ОКИ содержание эритроцитов в крови существенно снизилось в динамике, составив 4,4 (4,0-4,9) при поступлении и 3,5 (3,5-4,0) при выписке (р=0,002) и отставало от уровня группы контроля, р=0,001 (таблица 17).
У пациентов с легкой, среднетяжелой и тяжелой формой ОКИ показатели гемоглобина имели четкую тенденцию к снижению в динамике болезни и к моменту выписки из стационара оказались статистически значимо ниже нормы.
Снижение содержания эритроцитов и гемоглобина в крови пациентов в динамике легкой, среднетяжелой и тяжелой степени ОКИ, по-видимому, связано постепенным восстановлением водного баланса организма после прекращения патологических потерь в остром периоде заболевания, для которого было характерно обезвоживание и сгущение крови.
При всех степенях тяжести ОКИ, ассоциированных УПЭ, в остром периоде болезни определялось снижение количества тромбоцитов в крови и значимое возрастание их уровня в динамике болезни. Однако значения тромбоцитов в крови оказались достоверно ниже показателей группы контроля при среднетяжелой (р=0,013) и тяжелой форме инфекции (р=0,001) (таблица 17), они, по-видимому, отражают выраженность интоксикации, поскольку в связывании эндотоксина принимают участие форменные элементы крови, в том числе и тромбоциты [39].
Уровень лейкоцитов в периферической крови статистически значимо снижался в динамике болезни как при легком, так и при среднетяжелом и тяжелом течении ОКИ, р=0,003; р=0,001; р=0,070, соответственно. В сравнении со значениями группы здоровых лиц показатели лейкоцитов оказались существенно выше при поступлении (р=0,003; р=0,001; р=0,070; соответственно), и при выписке (р=0,001) (таблица 17).
Как следует из таблицы 18, нарушения функционального состояния почек при ОКИ, вызванных УПЭ, проявлялись незначительной кратковременной протеинурией, которая выявлена у 2 (13,3%) больных тяжёлой формой. При лёгкой и средней степени тяжести заболевания в моче белка не было. Статистически значимых различий в удельной плотности мочи в сравниваемых группах не выявлено и небольшие изменения в моче носили обратимый характер и были кратковременными. В зависимости от тяжести болезни обнаружена склонность к повышению средних показателей креатинина - 82±5,6; 93,3±6,3; 112,4±13,2 мкмоль/л, соответственно, но они не превышали верхнюю границу нормы. Патологические изменения в копроцитограмме чаще определялись при тяжелом течении инфекции.
Таким образом, изменения в анализах крови, мочи находятся в прямой зависимости от степени тяжести ОКИ, сопровождавшихся выделением УПЭ, и отражают выраженность основных синдромов заболевания и особенности развития ответной реакции организма в процессе выздоровления.
Фрагменты генов «островов» патогенности, ассоциируемые с патогенностью E.coli, у штаммов условно-патогенных энтеробактерий,выделенных от взрослых больных острыми кишечными инфекциями
В структуре инфекционных заболеваний одну из лидирующих позиций из года в год занимают ОКИ [75]. Однотипность клинической картины кишечных инфекций, ассоциируемых с микроорганизмами различных видов, не позволяет в ранние сроки по клинико-эпидемиологическим данным устанавливать этиологию, четко определить тактику ведения, прогнозировать особенности течения и исход заболевания. Выделение возбудителя бактериологическим методом в большинстве случаев служит ретроспективной расшифровке этиологической причины ОКИ, особенно сопровождавшихся высевом УПЭ, поскольку они отличаются быстротечностью патологического процесса. Помимо этого, не всегда удается выделить культуру возбудителя, и этиология большей части диарейных заболеваний остается не выясненной, количество диагностических ошибок, по некоторым данным, достигает 12,2-14,7%. По данным литературы, среди возбудителей ОКИ бактериальной этиологии превалируют условно-патогенные представители Enterobacteriaceae [5, 15, 17, 75].
По степени тяжести заболевания исследуемые пациенты с ОКИ, вызванными УПЭ, распределились таким образом: диагностирована лёгкая форма болезни у 21 больного (11,7%) среднетяжёлая – у 144 чел. (80,0%) и тяжёлая форма – у 15 чел. (8,3%). В каждой исследуемой группе больных, выявлены статистически значимые различия при сравнительном анализе структуры и продолжительности основных клинических симптомов ОКИ, сопровождавшихся высевом 3-х видов УПЭ, в зависимости от степени тяжести болезни. При сравнительном анализе частоты и продолжительности основных клинических синдромов ОКИ, ассоциированных с Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., при одинаковой степени тяжести болезни (легкой, средней и тяжелой) значимых различий не выявлено, что позволило объединить три группы больных в одну общую группу, не принимая во внимание видовую принадлежность возбудителя, но учитывая степень тяжести болезни. При анaлизе клинических проявлений ОКИ, вызванных УПЭ, в совокупности в зависимости от степени тяжести болезни были выявлены существенные различия. У пациентов при тяжелом течении заболевания в сравнении со среднетяжелым регистрировались более продолжительная лихорадка выше 380С, p 0,02%; боли в животе, р 0,05; рвота, р 0,05; жидкий стул, р 0,01. У исследуемых больных с ОКИ специфических осложнений не было, что, по-видимому, связано с включением в исследование пациентов молодого и среднего возраста (от 20 до 50 лет) без отягощенного преморбидного фона.
Важной составляющей диагностического процесса становится оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов, основанная, в частности, на характеристике их патогенного потенциала. Это, вместе с тем, не всегда обеспечивает надежные и воспроизводимые данные ввиду высокой вариабельности фенотипических признаков возбудителя, в особенности в условиях in vitro.
Установлено, что в основе формирования факторов патогенности различных энтеробактерий лежит их генетическая детерминированность. В этой связи значительный интерес может представлять возможность оценки патогенности УПМ на молекулярно-генетическом уровне [5]. Определенные перспективы в этом направлении обозначились в связи с установлением феномена группирования ряда структурных и регуляторных генов, детерминирующих патогенность микроорганизмов, в мобильные кластеры («острова» и «островки» патогенности), способные к вертикальному и горизонтальному перемещению, встраиванию в определенные сайты бактериальной ДНК («горячие точки»). Полагают, что данный механизм изменения патогенности бактерий играет важную роль в фoрмировании патoгенных вариантов различных видов бактерий [4, 41].
Фрагменты, гомологичные известным генам кластеров патогенности E.coli, были обнаружены в составе геномной ДНК представителей условно-патогенных Enterobacteriaceae, выделенных при ОКИ у детей, и при сальмонеллезах у взрослых [13, 15].
Более того, относительно недавно у K. pneumoniae была обнаружена новая большая плазмида (hvKP), определяющая феномен гипервирулентности указанных микроорганизмов способность вызывать гнойные абсцессы в печени с неидентифицированными пока факторами патогенности [181].
Роль УПЭ в патогенезе ОКИ до недавнего времени недооценивалась, однако, исследования последних лет свидетельствуют, что эти микроорганизмы отличаются высоким уровнем изменчивости, быстро эволюционируют и могут достаточно быстро формировать пулы чрезвычайно опасных патогенов, в частности, благодаря генетическим детерминантам «островов» патогенности, гомологичным известным генам кластеров патогенности E.сoli [103, 106]. В связи с этим большой научно-практический интерес могут представлять данные о молекулярно-генетическом потенциале клинических штаммов УПЭ и его влиянии на тяжесть течения болезни и/или связи с клиническими проявлениями заболевания.
Основной задачей нашей работы явилось установление наличия и частоты встречаемости фрагментов генов островов патогенности, ассоциируемых с патогенностью E.coli, в геномах клинических штаммов УПЭ, выделенных у исследуемых пациентов с ОКИ, в качестве нового маркера патогенности возбудителя и критерия оценки степени тяжести вызываемого им заболевания у взрослых.