Содержание к диссертации
Введение
Глава 2 Материалы и методы 25
2.1. Способ получения модели илеоцекального инфильтрата у крыс 25
2.2. Химический синтез гелевых форм хитозана 30
2.3. Иммунологический метод тестирования стафилококковых антигенов (токсинов) в крови при сеансах энтеросорбции продуктами деацетелированного хитина в эксперименте 31
2.3.1. Иммунизация кроликов отмытыми эритроцитами быка 33
2.3.2. Иммунизация кроликов стафиловакциной 34
2.3.3. Фракционирование антиэритроцитарных сывороток путём аффинной колоночной ионообменной хроматографии 35
2.3.4. Приготовление эритроцитарных диагностикумов 36
2.3.4. Постановка реакции гемолиза 36
2.2.6. Фракционирование стафилококковых антисывороток путём аффинной колоночной ионообменной хроматографии 37
2.3.6. Разработка, постановка реакции связывания комплемента 38
2.3.7. Методика тестирования стафилококковых антигенов в сыворотке интактных животных при постановке РСК 39
Лабораторные методы исследования 40
Техника кишечного пассажа 41
Морфологическое исследование 41
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение (экспериментальный раздел) 44
Патоморфологическая характеристика илеоцекального инфильтрата при энтеросорбции 44
Количественная характеристика слизистой оболочки тонкой кишки 73
Количественная характеристика серозной оболочки тонкой кишки 74
Реакция ингредиентов плазмы крови на сеансы энтеросорбции 80
Биохимические критерии эффективности энтеросорбции у животных с илеоцекальным инфильтратом 88
Клинический раздел 101
Применение коллоидной формы хитозана в комплексном лечении больных с воспалительными инфильтратами в брюшной
полости 101
Глава 4. Заключение 119
Выводы 131
Практические рекомендации 132
Литература 133
- Способ получения модели илеоцекального инфильтрата у крыс
- Химический синтез гелевых форм хитозана
- Патоморфологическая характеристика илеоцекального инфильтрата при энтеросорбции
- Количественная характеристика слизистой оболочки тонкой кишки
Введение к работе
Актуальность проблемы
Общеизвестно, что острый аппендицит является самым распространенным заболеванием в группе хирургических болезней органов брюшной полости. Летальность больных острым аппендицитом и ряд осложнений, связанных с ним, не снизилась и остается на одном уровне. Основная масса пациентов имела осложненные формы аппендицита -разлитой перитонит, аппендикулярный инфильтрат, аппендикулярный абсцесс [2, 87, 123, 143]. Среди больных острым аппендицитом удельный вес больных с аппендикулярным инфильтратом и аппендикулярным абсцессом составляет от 0,3% до 19,2% случаев [42, 70, 101, 111, 125, 126]. Исходя из этого обстоятельства, проблема аппендикулярного инфильтрата становится актуальной, если учесть довольно большой их удельный вес в группе больных с энтерогенными инфильтратами брюшной полости [3, 4, 21, 29, 32, 33,34,36,83,84,87,97,111].
Каждому хирургу известны многочисленные случаи, когда весьма спокойная картина аппендикулярного инфильтрата резко или молниеносно изменяется, осложняясь его абсцедированием вплоть до разлитого перитонита. Даже при наличии плотного инфильтрата в центре его заключен очаг дремлющей инфекции, который в любой момент способен к дальнейшей генерализации воспалительного процесса. Несмотря на общеизвестные успехи ургентной абдоминальной хирургии, проблема диагностики и лечения аппендикулярных инфильтратов и абсцессов остается злободневной. На сегодняшний день актуальность проблемы абсцессов аппендикулярного генеза определяется их высоким осложнением. Без сомнения, первоисточником аппендикулярного инфильтрата служит острый аппендицит. Из всех морфологических форм поражения речь, как правило, идет о деструктивных формах воспаления [42, 51, 80, 98]. По данным Ю. А. Атаманова [5] среди больных острым аппендицитом в 70% случаев выявлялась его флегмонозная форма, в 30% случаев гангренозный
5 деструктивный аппендицит. По А.И. Краковскому [52] катаральная форма аппендицита при плотном инфильтрате установлена у 2,9% больных, флегмонозная в 18,8% случаев, флегмонозно-язвенная в 6,5% случаев, гангренозная без перфорации в 31,3%, гангренозная с перфорацией - у 40,5% пациентов.
Бактериальный фактор является основополагающим в развитии аппендикулярного инфильтрата, как осложненной формы острого аппендицита. Бактериологические исследования показали, что при деструктивных формах острого аппендицита микрофлора выходит за пределы червеобразного отростка, «инициирует» экссудативный реактивный процесс соседних органов брюшной полости: петли кишечника, сальник и другие органы, провоцирует процесс инфильтрации плазмы крови и клеток с образованием на их поверхности фибрина и последующим формированием воспалительного конгломерата. Органы, вовлеченные в инфильтрат, в свою очередь, подвергаются разным формам воспаления, вплоть до флегмонозно-некротического [22,25, 30, 39,42,98].
По результатам исследований З.К. Забегальской [42] в брюшном экссудате больных обнаруживается в достаточно большом количестве смешанная микрофлора. Ассоциации микробов имеют место при деструктивных формах аппендицита. Как правило, отмечается ассоциация кишечной палочки с золотистым стафилококком, кишечной палочки со стрептококком, кишечной палочки в ассоциации стафилококка и стрептококка. Обнаруженная кишечная палочка была типичной по всем своим свойствам [131]. Энтеропатогенных штаммов микробов не было найдено. Исследования показали, что при формировании инфильтрата в остром периоде, при обострении процесса, после его резорбции у абсолютного большинства больных в брюшной полости имеется кишечная палочка. Она обнаруживалась даже после полной резорбцией инфильтрата в холодном периоде. В то же время, при отсутствии инфильтрата кишечная палочка в брюшной полости находилась лишь у единичных больных.
Очевиден факт, что столь разнообразный микробный пейзаж вызван попаданием этой микрофлоры из кишки [109].
Больший удельный вес среди инфильтратов брюшной полости приходится на энтерогенные инфильтраты не аппендикулярного происхождения [45, 46, 75, 78, 79]. Любой воспалительный очаг в брюшной полости в той или иной степени может являться основополагающим фактором в формировании воспалительного конгломерата с последующей самопроизвольной редукцией или его абсцедированием [48].
Без сомнения, не купированный в силу тех или иных причин воспалительный процесс в брюшной полости в раннем послеоперационном периоде может приводить к слипчивому процессу, формируя элементы спаечной непроходимости [95]. Как правило, адгезивные процессы, как проявления отграниченного местного перитонита, могут способствовать формированию частичной кишечной непроходимости, парезу, усугубляя тяжесть клинических проявлений [17, 24, 26]. Классические методы лечения аппендикулярного инфильтрата, принятые большинством хирургов, далеко не обеспечивают связывания средне- и высокомолекулярных токсических продуктов из просвета кишечной трубки и лимфовенозного коллектора и направленны в целом на улучшение местных обменных процессов в области воспалительного конгломерата. При изучении отечественной и зарубежной литературы по данной теме обращает на себя внимание наличие противоречивых мнений в вопросах лечения аппендикулярных инфильтратов и инфильтратов брюшной полости в целом. Учитывая все положительные и отрицательные моменты в лечении, диагностике и профилактике отграниченных перитонитов, актуальность этой темы остается открытой для дискуссий.
Цель настоящей работы - разработать в эксперименте и внедрить в клинику метод лечения воспалительных инфильтратов брюшной полости энтеросорбцией продуктами деацетилированного хитина.
7 Для достижения поставленной цели сформулированы следующие основные задачи:
Разработать способ моделирования илеоцекального инфильтрата у крыс.
Разработать в эксперименте метод энтеросорбции при илеоцекальном инфильтрате с помощью высокомолекулярной формы хитозана.
Установить эффективность работы хитозановых энтеросорбентов при извлечении микробных токсинов граммположительной микрофлоры.
Оценить патоморфологические изменения илеоцекального инфильтрата при кишечном пассаже предложенными полимерами.
Установить эффект детоксикации крови по анализу сдвигов ее биохимических ингредиентов.
Внедрить в клинической практике метод энтеросорбции продуктами деацетилированного хитина при комплексном лечении пациентов с энтерогенными инфильтратами брюшной полости.
Основные положения, выносимые на защиту;
Разработана на экспериментальных животных однотипная и стабильная модель илеоцекального инфильтрата.
Установлен эффект детоксикации при применении высокомолекулярных гелевых форм крабового хитозана в процессе энтеропассажа.
Доказана роль энтеросорбции хитозаном в деградации патоморфологических нарушений при илеоцекальном инфильтрате.
Установлена эффективность энтеросорбции продуктами хитозана в комплексном лечении больных с неосложненной и осложненной формами энтерогеннных инфильтратов брюшной полости.
Научная новизна исследования:
1. Впервые разработана на крысах и испытана стабильная модель илеоцекального инфильтрата, как форма отграниченного местного перитонита.
Впервые получен способ энтеросорбции гелевыми формами высокомолекулярного крабового хитозана, позволяющий существенно быстрее резорбировать неосложненный плотный воспалительный конгломерат в брюшной полости.
Продемонстрированы возможности системной детоксикации крови при энтеросорбции отграниченного перитонита, включая антигены граммположительной микрофлоры.
Установлена эффективность энтеросорбции продуктами деацетилированного хитина в комплексном лечении больных с воспалительными инфильтратами брюшной полости.
Практическая ценность работы и внедрение результатов исследования.
Разработан "Способ получения аппендикулярного инфильтрата" -положительное решение по заявке на изобретение (№ 200116706/14(017418)), приоритет от 14 июня 2001.
Разработан "Способ лечения отграниченного перитонита в эксперименте" Заявка на изобретение (№ 2003102555/14), приоритет от 30 января 2003. Результаты экспериментальных разработок внедрены в хирургических отделениях городской и краевой клинических больниц г. Красноярска. Апробация работы.
Результаты исследования доложены на VI Международной конференции. «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана». Москва - Щелково, 2001, Всеросс.конф. "Этноэкологические особенности ассоциации инфекционных факторов и патологии органов пищеварения у взрослого и детского населения". Красноярск, 2001. Научная конференция молодых ученых имени академика Б.С. Гракова. «Актуальные вопросы медицины и новые технологии».-Красноярск, 2003.
Публикации: Основные труды диссертации ($) опубликованы в международной, центральной и местной печати.
9 Реализация результатов работы.
Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры оперативной хирургии с топографической анатомией, кафедры микробиологии КрасГМА, биохимической лаборатории ККБ г. Красноярска, совместные работы осуществлялись на базе института биофизики СО РАН г. Красноярска (лаборатория биотехнологии), НИИ ФХМ МЗ РФ г.Москва (лаборатория неинвазивных методов диагностики). Апробация клинической части работы проведена на базах I хирургического отделения городской больницы № 20 и II хирургического отделения краевой клинической больницы г. Красноярска.
Способ получения модели илеоцекального инфильтрата у крыс
Известны способы создания модели аппендикулярного инфильтрата [42, 61]. Однако при указанных способах отсутствует однотипность и стабильность анатомо-морфологической картины аппендикулярного инфильтрата, процесс развивается по типу язвенно-некротического и прободного с развитием гнойного перитонита. Картина модели мало соответствует проявлениям заболевания в клинике и редко используется в эксперименте. Задача, которая была поставлена, - это получение однотипной и стабильной по анатомо-морфологической картине модели илеоцекального инфильтрата у белых крыс, подобная по морфологической картине аппендикулярному инфильтрату. Для достижения поставленной задачи был осуществлен ряд серий экспериментов на животных для получения картины неосложненного илеоцекального инфильтрата. Каждая группа животных подвергалась оперативному вмешательству на слепой кишке, которое по объему было различным с учетом известных механизмов начала воспалительной реакции. В разные сроки от момента оперативного вмешательства экспериментальные животные выводились из опыта, осуществлялась ревизия органов брюшной полости, входящих в воспалительный конгломерат, с последующей их морфологической характеристикой.
Всем экспериментальным животным под эфирным наркозом производилась нижняя срединная лапаротомия до 4 см. В операционную рану выводилась слепая кишка с брыжейкой. После перевязки слепой кишки у ее основания (ниже места перехода подвздошной кишки в слепой отдел) шелковой лигатурой формируется замкнутое пространство. Эта манипуляция проводится без нарушения кровоснабжения кишки. В дальнейшем в брыжейку вводился 1% раствор адреналина в количестве 0,2 мл. За счет такого введения возникает спазм сосудов, приводящий к нарушению микроциркуляции в слепой кишке (перевязанном сегменте). В первой группе животных, где осуществлялась перевязка слепой кишки и введение в брыжейку адреналина, на 6 - 7 сутки инфильтрат не формировался (рис. 2). Рис. 1 Интактная слепая кишка. 1. Серозная оболочка. 2. Мышечная оболочка 3. Собственная мышечная пластинка. 4. Слизистая оболочка. Окраска гематоксилин - эозином. Увеличение 15 х 30. Слои сохранены и хорошо выражены. Кишечные крипты одинаковой глубины. Эпителий слизистой оболочки представлен однорядным призматическим эпителием, расположенным на базальной мембране. Собственная мышечная пластинка слизистой оболочки представлена пучками гладкомышечных волокон с примесью коллагеновых. Подслизистая основа содержит тонкостенные сосуды. Мышечная пластинка представлена пучками гладкомышечных волокон. Серозная оболочка тонкая, бедна клетками и сосудами.
Слизистая оболочка слепой кишки сохранена, в подслизистом слое полнокровие, отек, периваскулярная лейкоцитарная инфильтрация. Во второй группе животных осуществлялась аналогичная перевязка слепой кишки, в замкнутое пространство ниже перевязки через тонкую иглу вводился 10% раствор СаСІ2 в объеме 0,4 мл. На 6 -7 сутки от момента моделирования формируется небольшой по объему рыхлый воспалительный конгломерат (рис. 3).
Рис. 3. Илеоцекальный инфильтрат, 6-е сутки развития. 1. Серозная оболочка 2. Мышечная оболочка Окраска Ван Гизон. Увеличение 15 х 30.
При микроскопическом исследовании: некроз слизистой и подслизистой оболочки, мышечный слой диффузно инфильтрирован лейкоцитами с формированием микроабсцессов. На серозной оболочке серозно-гнойное воспаление, глубокие очаги некроза.
В третьей группе животных в замкнутую полость перевязонного сегмента слепой кишки вводилась 1,5 миллиардная взвесь St. aureus 209 Р в объеме 0,4 мл. На 6 - 7 сутки формируются единичные рыхлые фибринозные наслоения и сращение петель тонкой кишки (рис. 4).
В четвертой группе животных осуществлялась перевязка слепой кишки у ее основания, введение в брыжейку перевязанного сегмента 0,2 мл - 1% раствора адреналина и в сформированное замкнутое пространство ниже перевязки слепой кишки через тонкую иглу поочередно вводилось 0,4 мл -10%) раствора СаОг и до 0,4 мл 1,5 миллиардной взвеси St. aureus 209 P.
Микроскопическая картина очага воспаления представляет собой некроз слизистого слоя с деструкцией собственной мышечной пластинки. В подслизистом слое - резкий отек, паралитически расширенные сосуды, лейкодиапедез. Мышечный слой инфильтрирован лейкоцитами. Серозная оболочка утолщена хорошо, васкуляризована, диффузно инфильтрирована лейкоцитами (апостематоз). Клеточные перфузаты содержат эозинофилы, лимфоциты, плазматические клетки. На серозной оболочке гнойно-фибринозный экссудат.
После выполненных выше манипуляций слепая кишка вместе с перевязанным сегментом погружалась в брюшную полость, между петлями тонкой кишки и большого сальника. На 6 - 7 сутки от момента моделирования в брюшной полости формируется плотный инфильтрат, занимающий до 20 - 25% объема брюшной полости, с наличием массивных межкишечных фибринозных наложений и свободного выпота в брюшной полости воспалительного характера. Между петлями тонкой кишки, прилегающих к слепой кишке, абсцессов нет (рис. 5). Самопроизвольное восстановление картины, близкой к первоначальной происходит за 30 - 35 суток.
Таким образом получена однотипная и стабильная модель илдеоцекального отграниченного инфильтрата у белых крыс, соответствующая проявлениям подобной патологии в клинике. Как видно из морфологической картины срезов ткани, входящих в инфильтрат, воспалительный процесс носит диффузный характер по типу апостематоза без признаков его генерализации, с местными экссудативными явлениями в полости брюшины.
Химический синтез гелевых форм хитозана
Для получения мелкодисперсной и хлопьевидной форм хитозана растворяют 1 г сухого хитозана в 6% уксусной кислоте, тщательно фильтруют и осаждают двумя способами: а) Титрованием раствора хитозана 1н раствором NaOH. б) Титрованием раствором хитозана 1н раствора щелочи. В первом случае образуется мелкодисперсная форма геля, во втором случае -хлопьевидная форма хитозана. Обе формы образуют устойчивые суспензии в водно-солевых средах. Получение глутамата хитозана При получении 2% геля глутамата хитозана используют 100 мл 2% хлоргидрата хитозана, который осаждают щелочью путем титрования 0,1 н NaOH . Суспензию полимера отжимают на стеклянном фильтре, промывают водой, повторно отжимают. Восстанавливают объем суспензии полимера до 100 мл и добавляют порциями сухую глутаминовую кислоту в эквивалентном соотношении, перемешивают до полного растворения полимера.
Интоксикационный синдром у больных с осумкованными процессами в брюшной полости порой носит неуправляемый характер. На фоне спокойного течения возможен мощный выброс продуктов микрофлоры из зоны воспаления. Отчасти это объясняется источником эндотоксимии, которым является воспалительный выпот брюшной полости, энтеральное содержимое области воспалительного конгломерата и местная микрофлора. Особую группу составляют пациенты с преобладающей коли-стафилоккоковой ассоциацией, которой свойственна высокая «молниеносная» генерализация воспалительного процесса с явлениями абсцедирования тканей, входящих в воспалительный конгломерат, с последующей деструкцией, выходом высоко токсичных продуктов тканевого распада и микробного протеолиза в свободную брюшную полость. Как правило, такие осложненные формы инфильтратов сопровождаются высокой степенью осложнений в группе больных с местной отграниченной формой перитонита различного генеза. Продукты кишечной палочки - липополисахариды (ЛПС) и гемолизины золотистого стафилококка рассматриваются как потенциальные компоненты токсического взаимодействия с элементами клеточных структур. Применяемая на сегодняшний день энтеросорбция позволяет извлекать ЛПС, гемолизины и другие антигены с различной специфичностью из просвета желудочно-кишечного тракта и его лимфовенозного коллектора при всевозможных деструктивных состояниях тонкой и толстой кишки (разлитой перитонит, острая кишечная непроходимость, энтероколит). Очевидно, что интоксикационный синдром при отграниченном перитоните не является главенствующим, но снижение токсичности плазмы брюшного экссудата и кишечного содержимого способствует улучшению ряда клинических показателей периферической крови. Умеренные явления интоксикации при осумкованных воспалительных процессах в брюшной полости не всегда вызывают серьезных сдвигов лабораторных показателей крови, поэтому дать полную оценку от проводимого лечения можно опираясь на иммунологический контроль антигенов периферической крови.
Определение в биологических жидкостях искомых антигенов при постановке иммунологических реакций порой представляет нелегкую задачу. В арсенале иммунологических реакций на первый план выступают методы иммуноферментного анализа (ИФА) и реакция связывания комплемента (РСК). Реакция связывания комплемента информативна, но в последнее время отходит на второй план по своей значимости. Это связано, в первую очередь, с тем, что в качестве антител используется сывороточный гамма -глобулин, содержащий антитела различной специфичности основных пяти классов. Применяя в качестве антител гамма-глобулиновую фракцию, реакция связывания комплемента становится малочувствительной к ряду антигенов по причине большого потребления антигена в его различных разведениях. Во-вторых, отмечено увеличение расхода сывороточного комплемента. Кроме того, с комплексом антиген-IgA комплемент связи вовсе не образует. Подход к решению данной ситуации можно осуществить путем выделения из гамма-глобулиновой фракции иммунного IgG. В силу такого обстоятельства реакция связывания комплемента становится чувствительным методом при больших разведениях антигена.
Метод количественной оценки циркулирующих токсических продуктов периферической крови позволяет определять их титр, основываясь на формировании комплекса антиген-антитело, с использованием эритроцитов быка в качестве индикаторных частиц, сенсибилизированных антиэритроцитарным иммуноглобулином класса IgG (табл. 3). Иммунизация кроликов отмытыми эритроцитами быка Получение антисывороток на высоте вторичного иммунного ответа (Ig G) Иммунизация кроликов стафиловакциной Получение антисывороток на высоте вторичного иммунного ответа (Ig G) Фракционирование антиэритроцитарных сывороток путем аффинной колоночной ионообменной хромотографии Получение высокоочищенной фракции антиэритроцитарного иммуноглобулина класса Ig G. Фракционирование антистафилококковых сывороток путем аффинной колоночной ионообменной хромотографии Получение высокоочищенной фракции антистафилококкового иммуноглобулина класса IgG. Приготовление эритроцитарных диагностикумов Подготовка к проведению реакции гемолиза Постановка реакции гемолиза Тестирование титров полученной фракции IgG к эритроцитам быка
Разработка, постановка реакции связывания комплемента Тестирование титров фракции антистафилококкового иммуноглобулина класса Ig СОценка элиминации стафилотоксинов в периферической крови животных при энтеросорбции
Иммунизация кроликов отмытыми эритроцитами быка. Животные. Для иммунизации использованы животные в количестве четырех особей весом 2,5 - 3 кг. Антиген. В качестве антигена использовались нативные эритроциты быка, полученные из шейной вены животного. Для предупреждения свертывания крови в стеклянную посуду добавлялся раствор гепарина. Гепаринизированная кровь трижды отмывалась физраствором (0,9% NaCI), 10 мл плотного осадка отмытых эритроцитов (центрирование при 1500 об/мин в течение 10 минут) разводились 90 мл физраствора с последующим ресуспендированием.
Забор крови осуществлялся путем сердечной пункции. Забранная кровь разливалась в пластиковые колбы, оставалась в них при 37 С 30 мин до полного образования кровяного сгустка. Отделение кровяного сгустка от сыворотки проводилось центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 мин. Сыворотка извлекалась, разливалась в стеклянную посуду с последующим консервированием.
Патоморфологическая характеристика илеоцекального инфильтрата при энтеросорбции
При воспалении червеобразного отростка и не купированного в силу тех или иных причин воспалительного очага брюшной полости, инфекция способна переходить на висцеральную брюшину, последняя продуцирует экссудат с большим содержанием фибрина. Происходит склеивание участков брюшины выпавшим в осадок из экссудата фибрина с отграничением источника воспаления от свободной полости брюшины [47, 60]. Версия образования воспалительного конгломерата в эксперименте на неосложненной модели илеоцекального инфильтрата позволила уточнить некоторые механизмы его патогенеза. В качестве источника воспалительной реакции был взят отрезок слепой кишки. Воспалительный процесс затрагивает близлежащие петли тонкой кишки с приобретением вялотекущего течения с гиперпродукцией фибрина. На 6-е сутки воспалительного процесса макроскопически инфильтрат плотный, занимающий до 20-25% объема брюшной полости с наличием массивных межкишечных фибринозных наложений и свободного выпота в брюшной полости воспалительного характера. На характер такого типа воспаления указывает гистологическая характеристика отрезка подвздошной и слепой кишки, входящих в воспалительный конгломерат. На 6-е сутки воспалительного процесса изменения затрагивают все слои слепой кишки, преимущественно слизистого и подслизистого слоев. На этот промежуток времени отмечается некроз слизистого слоя с деструкцией собственной мышечной пластинки, в подслизистом слое отек, паралитическое расширение сосудов, лейкодиапедез. Мышечный слой инфильтрирован лейкоцитами. Серозная оболочка утолщена, хорошо васкуляризирована, диффузно инфильтрирована лейкоцитами. Клеточные перфузаты содержат эозинофилы, лимфоциты, плазматические клетки. На серозной оболочке -серозно - фибринозные наложения.
Кишечное содержимое в зоне инфильтрата может приобретать токсический характер. При бактериологическом исследовании кишечной микрофлоры выявлено существенное изменение микробного пейзажа илеоцекального сегмента. Значительно активировались представители грамотрицательной микрофлоры: количество микробных клеток кишечной палочки увеличено в 1,6 раза по сравнению с нормой и составляет 2 104, количество Acinetobacter calcoaceticus увеличено в 2,3 раза и составляет 2x10 в 1 г. Появились возбудители рода Proteus и Candida. Отсюда становится понятен механизм токсического воздействия на слизистую оболочку тонкой кишки. В результате бактериологического исследования жидкости из брюшной полости выявлено обсеменение брюшного экссудата грамположительной и грамотрицательной микрофлорой в общем количестве 105 микробных клеток в 1 мл. В преобладающем большинстве случаев в экссудате высеваются кишечная палочка, энтерококк, эпидермальный стафилококк. На 10-й день развития заболевания количественный состав микрофлоры практически не изменился, лишь на 15-е сутки регистрировалось снижение числа кишечной палочки с 105 до 103 в 1 мл. Проникновение микробной флоры через дефекты слизистой оболочки кишечной трубки в свободную брюшную полость очевидно. Комплексное антагонистическое взаимоотношение микроорганизмов в такой ассоциации не приводит к диффузной генерализации воспалительного процесса в полости брюшины, что придает затяжное течение воспалительному процессу. Микробный пейзаж брюшной полости пациентов с подобной патологией по данным З.К. Забегальской [42] представлен коли-стафилококковой, коли-стафило-стрептококковой ассоциациями в незначительном количестве без диффузного распространения воспалительного процесса со скудной перитониальной симптоматикой. Выше изложенные факты послужили основанием для уточнения отдельных сторон патогенеза аппендикулярного инфильтрата в целом.
Изучая отдельные стороны этиопатогенеза осумкованного воспалительного процесса, выявлен ряд аргументов для обоснования метода энтерального введения сорбента.
Нарушение равновесия микробных ассоциаций с активацией патогенных штаммов микроорганизмов приводит к появлению токсического характера кишечного содержимого в области илеоцекального сегмента. Токсическое воздействие на слизистую оболочку тонкой кишки приводит к ее частичному некрозу с дальнейшим распространением деструктивных изменений на все слои кишечной стенки, входящей в инфильтрат. Кроме этого, отмечается местная экссудативная реакция за пределами кишки. В этом случае механизмы действия энтеросорбентов рассчитаны на детоксикацию кишечной трубки и лимфовенозного коллектора, снижение воспалительных процессов всех слоев кишечной стенки и экссудативной реакции за пределами кишки.
Задача настоящего исследования сводилась к уточнению отдельных механизмов резорбции воспалительного конгломерата и вероятных путей воздействия энтеросорбентов в условиях осумкованного перитонита. Эксперименты решали ряд вопросов: 1. Изменит ли энтеральное введение сорбента структуру всех слоев тонкой и слепой кишки, входящих в воспалительный конгломерат? 2. Возможно ли воздействие энтеросорбции на местную экссудативную реакцию в полости брюшины? 3. Может ли энтеросорбция способствовать резорбции фибриновой пленки на висцеральной брюшине? 4. Изменит ли введение энтеросорбентов динамику и сроки рассасывания инфильтрата? 5. Будет ли энтеросорбция способствовать активации клеток макрофагального звена, ликвидации воспалительной реакции? Руководствуясь поставленной задачей, проведен ряд экспериментов на животных (крысы популяции Wistar массой 150-200 г). Контрольная серия представлена группой животных, получавшей с диетой физиологический раствор натрия хлорида, и группой животных, получавшей полифепановый сорбент. Опытная серия представлена группой животных, получавшей с диетой гелевую форму глутамата хитозана и гелевую мелкодисперсную форму хитозана. Начиная с шестых суток к моменту формирования инфильтрата, первая контрольная группа крыс в течение 12 суток с диетой через желудочный зонд получала по 1,5 мл физраствора 3 раза в день с экспозицией в три часа. Спустя три дня после энтерального введения физраствора (9-е сутки развития), визуальная картина воспалительного конгломерата соответствовала развитию шестисуточного воспалительного процесса. Инфильтрат плотный, занимает 20-25% объема брюшной полости, имеется наличие массивных межкишечных фибринозных наложений, свободного выпота в брюшной полости серозно-фибринозного характера в значительном количестве, распространенного спаечного процесса по всей брюшной полости, десерозирование покрова кишечных петель при попытке их разъединения. Гистологические изменения в слепой кишке характеризуются резким утолщением стенки самой кишки, выраженным отеком подслизистого, мышечного слоев. Подслизистый и мышечный слой диффузно инфильтрированы сегментоядерными лейкоцитами. Собственная мышечная пластинка утолщена, сосуды в ней расширены, переполнены кровью (стаз), неравномерно инфильтрирована лейкоцитами, очаговый некроз слизистой оболочки (рис. 7). На серозной оболочке - фибриновые наложения, лейкоциты. Воспаление распространяется на брыжейку слепой кишки (рис. 6). Стенка интимно спаенной тонкой кишки утолщена, с выраженным отеком подслизистого и мышечного слоев с диффузной инфильтрацией сегментоядерными лейкоцитами (рис.8). Собственная мышечная пластинка утолщена, васкуляризирована, инфильтрирована лейкоцитами. В слизистой оболочке тонкой кишки видны очаговые некрозы ворсин, в железах преобладают бокаловидные клетки. На серозной оболочке тонкой кишки-фибрин, лейкоциты. На двенадцатые сутки развития воспалительного процесса макроскопическая картина илеоцекального инфильтрата у животных, получавших физраствор, мало, чем отличалась от групп животных с шестидневным и девятидневным развитием воспалительного процесса.
Количественная характеристика слизистой оболочки тонкой кишки
При развитии патологического процесса изменения в слизистой оболочке тонкой кишки выражены не столь значительно, как в слепой кишке. Слизистая оболочка к 6-м суткам развития воспалительного процесса истончена по причине ее очагового некроза и восстанавливается во всех группах наблюдения неравномерно (рис. 36). Это связано с восстановлением ворсин, снижением степени инфильтрации сегментоядерными лейкоцитами собственной мышечной пластинки. Восстановление целостности ворсин отмечается у животных, получающих полифепан и продукты хитозана. По истечению воспалительных явлений (12-е сутки) утолщение слизистой оболочки в группах крыс получавших различный вид диеты происходит неравномерно и составляет для группы с физраствором в 1,07 раза, полифепана - в 1,8 раза, глутамата хитозана и мелкодисперсного хитозана, соответственно, - в 1,49 и в 1,6 раза, за счет васкуляризации собственной мышечной пластинки, увеличения глубины кишечных крипт. Срок, при котором намечена тенденция к восстановлению слизистой оболочки тонкой кишки, составляет для контрольной группы с физраствором - 20-25 суток развития воспалительного процесса, для второй контрольной группы (полифепан) - 12-е сутки и для хитозанов, соответственно, на 9-е сутки воспалительного процесса. Под действием полифепанового сорбента за все время наблюдения увеличивается толщина слизистой оболочки больше, чем при действии всех других сорбентов, в результате коллагенизации, сохраняющегося отёка собственной мышечной пластинки и удлинения ворсин. В следующие промежутки времени (18-е и 25-е сутки) в этих экспериментальных группах утолщение слизистой оболочки происходит незначительно в силу стихания воспалительных явлений. Нормализация регенеративных процессов в слизистой оболочке пораженного участка тонкой кишки реализуется быстрее при сочетании полифепановой и хитозановой диет, чем в контрольной группе с физраствором. Количество бокаловидных клеток зависит от длительности воспалительных явлений и степени регенеративных процессов в слизистой оболочке и носит волнообразную зависимость (рис. 37). По мере восстановления ворсин слизистой оболочки тонкой кишки увеличивается количество бокаловидных клеток. На 9-е сутки степень увеличения их числа у животных, получавших физраствор, составило в 7 раз, а для животных с полифепановой и хитозановыми (глутамат хитозана , мелкодисперсный хитозан) диетами, соответственно, в 8,1; 10,9 и 15,3 раза. В начальной фазе воспаления (6-е - 9-е сутки) число бокаловидных клеток повышено во всех группах наблюдения, что можно рассматривать, как защитный механизм со стороны слизистой оболочки. Замечено, что мелкодисперсная нейтральная форма хитозана способна создавать условия поддерживания на высоком уровне количества бокаловидных клеток в отличии от кислой формы глутамата хитозана, что благотворно отражается на процессах секреции и биоценоза.
Значительные изменения затронули и серозную оболочку, которая в ходе развития конгломерата в начальной фазе воспалительного процесса утолщена в контрольной и опытной сериях животных, сменяясь постепенным истончением её в результате резорбции инфильтрата (рис.38). Морфометрический анализ серозной оболочки тонкой кишки показал, что только в серии животных, леченных хитозаном, появилась тенденция к снижению ее толщины уже через 3 дня энтеросорбции (9-е сутки развития). Через 12 дней энтеросорбции толщина серозной оболочки снижается достоверно и составляет, соответственно, для солевой формы глутамата хитозана 20,1 ±0,24 мкм (р 0,05), коллоидной формы 18,4±1,3 мкм (р 0,05) против контроля (физраствор) 47,2±1,21 мкм (р 0,05). Положительные результаты проявлялись в опытных группах крыс с хитозановыми полимерами. Такому результату свойственна способность этих полимеров значительно снижать отёк и инфильтрацию, что отражается на толщине серозной оболочки. Лучшим в этой группе препаратов оказалась гелевая форма глутамата хитозана, способная за шестидневный интервал энтеросорбции уменьшить толщину серозной оболочки, приблизив к нормальным величинам, стабилизировать морфологические изменения, уменьшить клеточную инфильтрацию и отек. Мелкодисперсная форма хитозана способна была уменьшить отек и, следовательно, толщину серозной оболочки только, спустя 12 дней энтеросорбции. По видимому, высокий положительный заряд, создаваемый глутаматом хитозана за счет большого количества протонированных аминогрупп от глутаминовой кислоты позволяет разобщать межклеточные контакты не только на уровне слизистой оболочки, но и на уровне серозной оболочки с перемещением токсичных агентов воспаления в сторону сорбента, тем самым, уменьшая воспалительный отёк и плазмоклеточную инфильтрацию. Создается дополнительный градиент за счет электростатических взаимодействий. Мелкодисперсная форма хитозана уступает по количеству активных аминогрупп и, как следствие этого, обладает меньшим положительным зарядом. В этом случае функция энтеросорбента приходится на уровень слизистого и мышечного слоев тонкой кишки, вовлеченных в инфильтрат, что демонстрируется (рис. 36, 37, 38). Полифепановая терапия была не способна устранять на протяжении длительного времени воспалительный отёк и инфильтрацию в серозной оболочке. Основной терапевтический эффект сосредоточен на уровне слизистого и подслизистого слоев. В контрольной группе с физиологическим раствором воспаление на висцеральной брюшине поддерживалось во все сроки наблюдения, отсутствовал дренирующий эффект всех слоев кишечной стенки и за её пределами.