Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
Глава 1. Взаимосвязь вирусного гепатита В и иммунитета 12
Глава 2. Плазмоцитоидные дендритные клетки 20
Глава 3. Плазмоцитоидные дендритные клетки и вирусный гепатит В 24
II Собственные исследования 36
Глава 1. Материалы и методы исследования 36
1.1. Дизайн исследования 36
1.2 Методы исследования 38
1.3 Статистические методы обработки результатов исследования 41
Глава 2. Клинико-лабораторная характеристика больных вирусным гепатитом В 43
Глава 3. Результаты оценки количественных характеристик pDCs в патологии у больных вирусным гепатитом В различных клинических форм 55
3.1 Количественные характеристики pDCs у больных острым вирусным гепатитом В 55
3.2 Количественные характеристики pDCs у больных хроническом вирусном гепатите В 60
Глава 4. Количественные характеристики pDCs у больных вирусным гепатитом В при различных уровнях билирубина 64
Глава 5. Количественная характеристика pDCs в патологии у больных вирусным гепатитом В при различных уровнях АлТ 69
Глава 6. Результаты оценки сравнительной характеристики функционального состояния pDCs при выработки интерферона у больных вирусным гепатитом В при различных клинических формах 74
Глава 7. Сравнительная характеристика показателей pDCs у пациентов ОГВ в катамнезе 79
Заключение 81
Итоги исследования 86
Список литературы 88
- Взаимосвязь вирусного гепатита В и иммунитета
- Клинико-лабораторная характеристика больных вирусным гепатитом В
- Количественные характеристики pDCs у больных хроническом вирусном гепатите В
- Результаты оценки сравнительной характеристики функционального состояния pDCs при выработки интерферона у больных вирусным гепатитом В при различных клинических формах
Взаимосвязь вирусного гепатита В и иммунитета
Механизмы, с помощью которых вирус гепатита В (ВГВ) устанавливает и поддерживает хроническую инфекцию, плохо изучены. Несмотря на то, что у взрослых приобретенный вирус обычно выводится благодаря устойчивому иммунитету, большинство людей инфицированные при родах или в очень раннем возрасте в результате развивают хроническую инфекцию в течение всей жизни. Кроме того, острые инфекции не излечиваются примерно у 5% людей, инфицированных в зрелом возрасте. Механизмы клетки-хозяина, которые обеспечивают установление и развитие острой инфекции и постоянной инфекции, остаются неясными [1, 10, 17, 89].
Вирус гепатита В “очищается” и контролируется иммунной реакцией хозяина примерно у 95% людей, инфицированных во время взрослой жизни, но при этом вирус имеет хроническую форму более, чем у 325 миллионов человек и наиболее распространен у лиц, инфицированных при рождении или в раннем детстве [3, 8]. Тем не менее, причины, по которым ВГВ становится хроническим, автоматически при рождении или в раннем детстве, и в более сложной форме в зрелом возрасте, остаются неопределенными. Связано ли это просто с незрелой иммунной системой у младенцев и детей раннего возраста, или же генотип ВГВ и другие вирусные факторы играют определенную роль? Также не ясно, как ВГВ противостоит естественной иммунной реакции носителя, чтобы установить стойкую инфекцию у 5% людей, инфицированных в зрелом возрасте. Опять же, это связано с факторами хозяина, вирусными факторами или их комбинацией?
В настоящее время существуют две научные школы, которые придерживаются точки зрения о том, что либо ВГВ является «невидимым» вирусом, который изначально устанавливает инфекцию, избегая врожденных иммунных реакций хозяина, либо ВГВ облегчает первоначальную инфекцию и прогрессирование, активно манипулируя иммунной реакцией хозяина в своих интересах. Несмотря на то, что адаптивная иммунная реакция важна для эффективного контроля за инфекцией ВГВ, ее роль сложнее анализировать, отчасти потому, что инфицированные ВГВ пациенты почти повсеместно диагностируются в течение 10-12 недель после инфицирования [4, 5]. Исследования с острыми инфицированными ВГВ шимпанзе показали, что ВГВ не модифицировал транскрипцию генов хозяина в раннем возрасте и не вызывал врожденных антивирусных реакций в гепатоцитах и печени. Действительно, ВГВ не попадал в логарифмическую фазу амплификации до 5 недель после заражения, и никакие транскрипты хозяина, включая IFN-/-стимулированные гены, не были равномерными или репрессированными в течение этого периода. Хотя возможно, что экспрессия гена была ниже предела обнаружения, это явление можно было бы также объяснить следующими сценариями: ВГВ у шимпанзе - это невидимый вирус, который не может быть обнаружен врожденной иммунной реакцией на ранней стадии инфекции или ВГВ, эффективно подавляет врожденный иммунный ответ очень рано после заражения. Поскольку только 5% взрослых людей прогрессируют до хронического состояния после острой инфекции, также возможно, что исследование с использованием большего числа шимпанзе, возможно, выявило бы врожденные противовирусные ответы у дополнительных животных. Хотя аспекты жизненного цикла ВГВ, такие как репликация вируса, происходящая внутри нуклеокапсидов, могут эффективно «скрывать» вирусную нуклеиновую кислоту из клетки, белки ВГВ экспрессируются в цитоплазме. Многочисленные исследования показали прямое взаимодействие между этими белками, кодируемыми ВГВ, и врожденными иммунными ответами, что указывает на то, что ВГВ разработал множество механизмов противодействия клеточной защите [6, 7,8].
Печень человека представляет собой орган, образованный двумя типами клеток, непаренхимными клетками (клетки Купфера и синусоидальные эндотелиалые клетки) и паренхимальными клетками (гепатоциты и модифицированные эпителиальные клетки), каждый из которых обладает уникальными иммунологическими характеристиками.
Врожденная иммунная реакция на инфекцию ВГВ обусловлена ранним ответом на специфические «связанные с патогенами молекулярные структуры» и стимулирует последующий адаптивный иммунный ответ, который имеет решающее значение для вирусного клиренса [9]. Хотя ВГВ почти исключительно заражает гепатоциты, становится все более очевидным, что другие клетки в печени и периферической крови играют важную регуляторную роль во врожденном иммунном ответе, что, в свою очередь, регулирует адаптивный иммунный ответ на инфекцию.
Выздоровление взрослого, инфицированного вирусом гепатита В, приблизительно в 95% случаев связано с участием T-клеток в ВГВ-инфицированных гепатоцитах. Однако становится все более очевидным, что врожденные иммунные реакции также играют важную роль в этом процессе. Природные киллеры (NK) и клетки естественного киллера T (NKT) имеют решающее значение для принимающих противовирусных врожденных иммунных реакций, связывая хозяина с врожденными и адаптивными иммунными ответами и играют центральную роль в клиренсе ВГВ.
Было обнаружено, что ВГВ-инфекция непосредственно активирует NK клетки путем индукции цитокинов, таких как IFN-, IFN- и интерлейкина (IL) -12, или опосредованно посредством активации дендритных клеток (DCs) и макрофагов с целью получения IL -12, IL-18 и CXCR3 и других хемокинов [11]. Активированные NK-клетки уничтожают инфицированные вирусом клетки-мишени посредством прямых цитотоксических эффектов, а также ингибируют репликацию ВГВ путем продуцирования IFN-, фактора некроза опухоли (TNF) -, трансформирующего фактора роста-, гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора и IL 10 [12, 13, 14]. Развитие реакции NK и NKT-клеток у двух ВГВ серонегативных доноров крови, которые стали HBsAg- и ВГВ-ДНК положительными, при постоянном нормальном уровне аланинаминотрансферазы, указывает на то, что врожденная иммунная система способна ощущать инфекцию ВГВ в очень раннем возрасте этап [15]. Фактически, исследование, количественно определяющее кинетику родственной репликации вируса гепатита (ВГВ) и активацию гена (модель острой инфекции гепатита B) через 1 час после инокуляции, выявило значительную расширенную внутрипеченочную транскрипцию IFN- и IL-12, 3-6 часов после заражения [16]. Показано, что на ранних стадиях инфицирования ВГВ человека NK и NKT-клетки улучшали продукцию IFN- и TNF- в соответствии с пиком репликации ВГВ, когда ВГВ-специфический ответ Т-клеток все еще был очень слабым [15]. В течение 48-72 ч активировали NK и NKT-клетки, а репликация вируса была временно снижена, что указывает на стабильную врожденную иммунную реакцию. Однако Т-клетки активировались только через 4-5 недель. Эти данные предполагают, что произошла активация врожденной иммунной реакции, но своевременный адаптивный ответ Т-клеток не произошел [16]. Данные наблюдения совпадают с исследованиями, в которых показана самая высокая частота циркулирующих NK-клеток, где имело место самое раннее время инкубационного периода естественной инфекции ВГВ, при этом количество NK-клеток уменьшалось в соответствии со снижением ДНК ВГВ [5]. Однако роль NK-клеток при острой инфекции остается неясной. Последние результаты показали, что активация NK-клеток и способность продуцировать IFN- снижались при пиковой виремии, а цитокины, включая IFN типа I, IL-15 и IFN -, не были соответствующим образом индуцированы при острой ВГВ-инфекции. Переходное ингибирование реакции NK соответствовало высоким уровням IL-10, который является противовоспалительным цитокином, который ингибирует NK и функцию Т-клеток [17].
Быстрые врожденные иммунные реакции, приводящие к вирусному разминированию, не ограничиваются непаренхимными клетками, такими как NK-клетки. Действительно, исследования in vitro с использованием дифференцированных клеток HepaRG, трансдуцированных рекомбинантным бакуловирусом, кодирующим полный геном ВГВ, показали, что ВГВ выявил сильный и специфический врожденный антивирусный ответ в этой линии клеток, что привело к нецитопатическому клиренсу ДНК ВГВ с регуляцией вверх IFN-, а также других IFN-стимулированных генов [26].
Хроническому гепатиту не всегда предшествует распознаваемая острая форма гепатита В. Однако иногда непосредственно после острого эпизода наступает хронизация инфекционного процесса. В других случаях, несмотря на внезапное начало, сходное с острым заболеванием, хронический гепатит уже имеет место. Примерно у 10% взрослых больных, страдающих острым гепатитом В, HBsAg не исчезает из сыворотки крови в течение 12 недель, и они становятся хроническими носителями возбудителя. Новорождённые, заболевшие гепатитом В, становятся хроническими носителями в 90% случаев. Прогрессирование зависит от продолжающейся репликации вируса в печени и состояния больного (особенно иммунной системы). Вирус не оказывает прямого цитопатического действия, и лизис инфицированных гепатоцитов определяется иммунным ответом хозяина. Персистенция вируса, возможно, связана со специфическим дефектом Т-клеток, препятствующим распознаванию ВГВ-антигенов. Нарушение гуморального и клеточного иммунитета, таким образом, определяет исход гепатита В. Когда имеется дефект на фоне продолжающейся репликации вируса, развивается состояние хронического носительства с хроническим гепатитом или без него.
Клинико-лабораторная характеристика больных вирусным гепатитом В
В период проведения работы в отделение вирусных гепатитов ИКБ №1 поступило 275 пациентов с направительным диагнозом: Вирусный гепатит неясной этиологии.
На основании эпидемиологических данных, клинической картины, лабораторных данных, включая серологическое исследование, установлен диагноз вирусного гепатита В у 63 человек.
Структура диагнозов больных представлена в Таблице 1.
В группу больных острым вирусным гепатитом В вошли 28 человек , с хроническим гепатитом В под наблюдением было 35 человек. Соотношение обследованных больных в сравниваемых группах позволило провести адекватный статистический анализ.
Вирус гепатита В характеризуется множественностью путей передачи. Возможен контактный, вертикальный и артифициальный (трансплантация органов, парентеральные манипуляции) пути передачи. Наиболее эффективен половой пути передачи. Особое значение имеет передача вируса гепатита В вертикальным путем от беременной (больная ОГВ или хронической HBV инфекцией) плоду или новорожденному. Среди обследованных пациентов также встречались лица, практикующие внутривенное введение наркотиков.
При сборе эпиданамнеза у всех наблюдаемых больных выясняли возможные пути передачи и факторы заражения вирусным гепатитом В.
Установлено, что у пациентов острой формой вирусного гепатита В в 64,3 % случаев для реализации передачи возбудителя явился половой контакт. Достаточно часто встречался такой путь передачи, как артифициальный (32,1%), у 13,8 % не удалось установить источник заражения.
У пациентов хроническим гепатитом В преобладал артифициальный путь передачи (37,2, %). У 31,4% – половой контакт, в 11,4% случаев путь передачи установить не удалось (Рисунок 4).
Таким образом, можно утверждать, что при вирусном гепатите В по прежнему остаются ведущими такие факторы риска заражения, как половые контакты с носителями возбудителя, а также медицинские манипуляции с нарушением целостности кожных покровов и слизистых.
В таблице 3 предоставленные данные проведенных эпидемиологического анамнеза всех обследованных больных.
В ходе обследования 28 пациентам на основании клинической картины, лабораторных методов диагностики был установлен диагноз: Острый вирусный гепатит В (ОГВ).
Возраст пациентов ОГВ составил от 22 до 62 лет (средний возраст больных – 34 года). Среди обследованных было: мужчин – 19 человек, женщин – 9 человек.
При поступлении состояние пациентов этой группы расценивалось как средней степени тяжести. Тяжесть состояния у 100% была обусловлена астено-вегетативным (слабость, быстрая утомляемость, разбитость) и у 57% диспептическим синдромами (ухудшение аппетита, снижение вкусовых ощущений, тошнота, рвота, боль в правом подреберье).
Синдром желтухи у большинства больных проявлялся изменением окраски кожи, видимых слизистых, ахолией, потемнением мочи. Развитие синдрома манифестировало на 5-7 дней после первых признаков заболевания, средняя длительность преджелтушного периода составила 6,5 дней, что соответствует нормам преджелтушного периода у больных вирусным гепатитов В. Обычно больные обращались за медицинской помощью на 2-3 сутки после появления желтухи и были госпитализированы в инфекционный стационар.
При поступлении больных в стационар больные предъявляли жалобы на желтушность кожи, склер, потемнение мочи, ахоличный стул, тяжесть в правом подреберье, у 44% отмечалось повышение температуры тела до +39С, 14,7% больных предъявляли жалобы на боль в суставах. Объективно состояние больных средней степени тяжести. У 34,7% пациентов при мануальном исследовании отмечалась гепатомегалия, у 8% спленомегали, что подтверждалось результатами ультразвукового исследования.
Клиническая симптоматика у больных ОГВ представлена на Рисунке 5.
Сопутствующие заболевания отмечены у 8 больных (28,5%). Из них 4 человека сообщили о хронических заболевания желудочно-кишечного тракта: хронического панкреатита, гастрита, гастродуоденита. У двоих были заболевания сердечно-сосудистой системы, у одного в анамнезе хронический пиелонефрит, у одного заболевание органов дыхания.
Все больные получали стандартную симптоматическую, патогенетическую терапию, обоснованную клинико-лабораторными данными.
Наблюдаемые больные острым вирусным гепатитом В находились на стационарном лечение от 12 до 55 суток (средней койко-день 15).
В исследование вошли 35 пациентов хронической формой вирусного гепатита В (ХГВ). Возраст пациентов с ХВГ составил от 18 до 78 лет.
Состояние при поступлении у 7 пациентов (20%) расценивалось как удовлетворительное, у 23 (65,7%) средней степени тяжести и у 5 (14,2%) как тяжелой степени тяжести.
Пациенты в удовлетворительном состоянии (7 человек) были направлены в отделение вирусных гепатитов из центра по лечению хронических вирусных гепатитов для проведения пункционной биопсии печени с целью уточнения степени поражения печени и решения вопроса о необходимости проведении противовирусной терапии. У них отсутствовали какие-либо активные жалобы. При тщательном обследовании выявлялись умеренно выраженные проявления астено-вегетативного и периодически возникающие диспептические проявления.
При поступлении пациентов хронической формой вирусного гепатита В в 55 % отмечался астено-вегетативный синдром(жалобы на слабость, снижение аппетита, быструю утомляемость) у 42% выявлена желтушность кожи, склер, у 52 % болевой синдром( тяжесть и боль в правом подреберье, эпигастральной области), у 57% диспептический синдром (тошноту, рвоту, изжогу, горечь во рту).
Тяжесть состояния была обусловлена выраженностью астено-вегетативного синдрома (слабость, головокружение, снижение аппетита, быстрая утомляемость), геморрагическим (нарушение коагулопатии, кровоточивость десен, носа, геморраидальных узлов, кровотечение из расширенных вен пищевода), отечно-асцитическим (увеличение живота в объеме, отеки нижних конечностей), мезенхимально-воспалительным синдромами (гепатомегалия, спленомегалия), признаками острой и хронической печеночной энцефалопатии.
Сопутствующие заболевания отмечены у 20 больных ХГВ (57 %). Чаще встречались хронические заболевания желудочно-кишечного тракта (12 человек): пациенты отмечали наличие в анамнезе хронического панкреатита, гастрита, гастродуоденита. У 5 пациентов были заболевания сердечно-сосудистой системы (наличие в анамнезе ишемической болезни сердца, гипертонической болезни), у одного хроническое заболевание мочеполовой системы, у двух заболевание органов дыхания.
По результатам клинико-лабораторного и инструментального обследования у 42,8% (n=15: 8 мужчин и 7 женщин) больных ХГВ был выявлен цирроз печени различной степени декомпенсации (А, В, С по классификации Чайлд-Пью). Класс цирроза выставлялся в зависимости от суммы баллов по всем параметрам. Сумма баллов исходила из подсчета следующих показателей (наличие асцита, энцефалопатии, гипербилирубинемии, гипоальбуминемии, снижении ПТИ, варикозного расширения вен пищевода по заключению эзофагогастродуоденоскопии, портальной гипертензии по данных УЗИ органов брюшной полости.
Количественные характеристики pDCs у больных хроническом вирусном гепатите В
Соотношение количественных показателей pDCs у больных при хронической форме вирусного гепатита В и нормальными значениями pDCs здорового человека представлено в таблице 12.
При сравнении абсолютного количества клеток pDCs у больных, страдающих ХГВ, и здоровых людей установлено, что показатели здорового человека более, чем в 2 раза выше показателей больных ХГВ, различие между ними статистически значимо (р 0,05).
Также и при сравнении процентного количества клеток мы получили, что различие между процентным количеством клеток у больных с ХГВ и здоровыми людьми статистически значимо.
Были определены количественные показатели pDCs крови у больных хроническим вирусным гепатитом В в разных гендерных группах. В ходе обследования этой группы было выявлено, что как абсолютное количество pDCs в крови, так и на процентное количество клеток статистически не отличается у мужчин и женщин (Рисунок 10 и Рисунок 11).
Изучена взаимосвязь возраста и количественные показатели pDCs у больных хроническим гепатитом В.
В результате сравнения количественных показателей pDCs у больных ХГВ и здоровых людей мы выяснили, что возраст не оказывает существенного влияния как на абсолютное количество клеток pDCs, так и ни на процентное количество клеток pDCs. У людей от 18 до 40 лет и у людей после 40 лет количество клеток pDCs существенно не отличалось (соответственно 3,3±0,83 и 3,4±0,7), а достоверность различий между ними статистически не значима (рисунок 12).
В соответствии с задачами исследования был проведен сравнительный анализ количественных показателей pDCs крови при острой и хронической формах вирусного гепатита В, результаты которого представлены в таблице 13. По результатам оценки соотношения количественных характеристик pDCs в крови, показатели pDCs при острой форме вирусного гепатита В превысили показатели pDCs при хронической форме вирусного гепатита В почти в 1,5 раза. При сравнении процентого количества клеток pDCs на 100 тыс. лимфоцитов достоверность различий в группах ОГВ и ХГВ статистически не значима ( р 0,05).
Результаты оценки сравнительной характеристики функционального состояния pDCs при выработки интерферона у больных вирусным гепатитом В при различных клинических формах
Для патогенеза ГВ важное значение имеет интерфероногенез. В связи с этим была поставлена задача определения выработки ИФН pDCs у больных различными формами ГВ.
В ходе исследования были получены следующие результаты: у пациентов вирусным гепатитом В количественные показатели выработки ИФН составили 8,79+1,04. В сравнении с показателями выработки ИФН у здоровых людей достоверность различий между больными гепатитом В и здоровыми людьми ниже нормального значения. Полученные данные показывают, что выработка ИФН у больных вирусным гепатитом В, значительно выше, чем у здоровых людей (Таблица 22).
Таким образом, выработка ИФН в pDcs достоверно выше у больных вирусным гепатитом В, чем у здоровых людей.
Соотношение количественных показателей pDCs выработки ИФН у больных, страдающих вирусным гепатитом В с острой формой и у здоровых людей статистический является существенным, так как р 0,0001, где показатели выработки ИФН у больных с ОГВ- 9,5+1,7 (Таблица 23).
При сравнении больных, страдающих ХГВ и здоровых людей, достоверность различий показателей выработки ИФН статистически значима при р 0,0001 (Таблица 24)
Также нами обнаружена достоверная связь между функциональным состоянием pDcs и цитолизом. Количественные показатели выработки ИФН в pDcs при нормальных условиях трансаминаз - 5,38±1,01, а при повышенных уровнях трансаминаз - 6,48±0,65. Прослеживается небольшое различие в показателях, различие между нормальным уровнем трансаминаз и повышенным является достоверно ниже нормального значения (Таблица 25).
Было проведено сравнение количественных показателей выработки ИФН в pDc у больных с вирусным гепатитом В со здоровыми людьми. Как выяснилось, как у больных с гепатитом В при нормальном уровне трансаминах, так и у больных с повышенным уровнем трансаминаз выработка ИФН в pDcs достоверно выше нормальных значений, оставаясь более интенсивной у больных с нормальным уровнем трансаминаз.
Соотношение количественных показателей выработки ИФН в pDcs в по возрасту представлено в таблице 26.
В ходе исследования, был проведен анализ влияния возраста и пола больных с вирусным гепатитом В на выработку ИФН в pDcs (Таблица 26 и Таблица 27).
Анализ показал следующие результаты. Больные с вирусным гепатитом В в возрасте до 40 лет имели выработку ИФН в pDcs ниже, чем больные в возрасте старше 40 лет. Однако при сравнении этих показателей у здоровых людей и больных ГВ разного возраста достоверных статистических различий не выявлено. Таким образом, не удалось установить взаимосвязь возраста больных и функциональной активности pDcs по выработке ИФН
Анализируя взаимосвязь функционального состояния pDcs у больных ГВ и пола, были получены следующие результаты: у мужчин выработка ИФН составила 9,01+1,26 пг/мл, у женщин была немного ниже - 8,35+1,88 пг/мл. Т.е. по нашим данны, пол не оказывает влияния на выработку ИФН при вирусном гепатите В. Достоверные в pDcs выше нормальных значений, следовательно пол не оказывается значение для прогноза заболевания больных с вирусным гепатитом В (Таблица 27).
При анализе соотношении количественных показателей pDCs выработки ИФН при острой и хронической формах вирусного гепатита В, получены следующие результаты: показатели pDCs при выработки ИФН у больных с ОГВ - 9,5+1,7 а у больных с ХГВ 8,3+1,9, где коэффициент достоверности различий статистически не значим (р 0,05) (Таблица 28).
Таким образом, у больных, инфицированных вирусом гепатита В, при остром и хроническом течении выработка интерферона pDCs достоверно выше, чем у здоровых людей.